Shock Wave Toepassing op celculturen

Samenvatting

Schokgolven tegenwoordig bekend om hun regeneratieve effecten. Daarom in vitro experimenten zijn van toenemend belang. We hebben daarom een model ontwikkeld voor in vitro schokgolf trials (IVSWT) die ons in staat stelt om na te bootsen in vivo omstandigheden waardoor storende fysieke effecten te vermijden.

Samenvatting

Schokgolven tegenwoordig bekend om hun regeneratieve effecten. Fundamenteel onderzoek bevindingen bleek dat schokgolven veroorzaken een biologische prikkel om cellen of weefsel te richten zonder eventuele gevolgschade. Daarom, in vitro experimenten van toenemend belang. Verschillende methoden voor het aanbrengen schokgolven op celkweken beschreven. In het algemeen, alle bestaande modellen richten op hoe schokgolven beste toepassen op cellen.

Echter, deze vraag blijft: Wat gebeurt er met de golven na het passeren van de celkweek? Het verschil van de akoestische impedantie van het celkweekmedium en de lucht is zo hoog, dat meer dan 99% van schokgolven gereflecteerd! We hebben daarom een ​​model ontwikkeld dat voornamelijk bestaat uit een plexiglas gebouwde container die het mogelijk maakt de golven te verspreiden in het water na het passeren van de celkweek. Dit voorkomt cavitatie effecten evenals reflectie van de golven die anders nog te houden zou verstoren. With dit model zijn we in staat om in vivo omstandigheden na te bootsen en zo krijgen meer en meer kennis over hoe de fysieke prikkel van schokgolven wordt vertaald in een biologische cel-signaal ("mechanotransduction").

Inleiding

Schokgolven zijn geluidsdrukgolven die voortvloeien uit een plotseling vrijkomen van energie, bijvoorbeeld. als donder bij bliksem. In de geneeskunde schokgolven worden al meer dan 30 jaar Lithotripsie de desintegratie van nierstenen. Aangezien de incidentele vaststelling van iliacale bot verdikking bij Lithotripsie patiënten in de vroege jaren 1980, werd eerste studies uitgevoerd om het effect van drukgolfbehandeling (SWT) op botgenezing ¹ evalueren. Indrukwekkende resultaten van een betere genezing van de lange bot nonunions kon worden waargenomen ^2. Vervolgens werden aanwijzingen uitgebreid zacht weefsel wonden ^3. Fundamenteel onderzoek bevindingen bleek dat schokgolven veroorzaken een biologische prikkel om het te onderzoeken weefsel zonder eventuele gevolgschade. Vrijgave van angiogene groeifactoren (bijvoorbeeld VEGF, PlGF, FGF) wordt gevolgd door aanzienlijke angiogenese. Dit leidde tot een verdere uitbreiding van indicaties naar ischemische pathologieën. Onze groep en anderen toonden de positieve effect van SWT op ischemische hartziekte in diermodellen als in klinische studies ^4-6.

Echter, het exacte mechanisme van hoe de fysieke prikkel van SWT wordt vertaald in een biologisch signaal (mechanotransduction) blijft grotendeels onbekend. Omdat de belangstelling voor SWT uit verschillende gebieden van de geneeskunde neemt voortdurend toe, is de zoektocht naar het mechanisme steeds meer en intenser. Daarom worden in vitro schokgolf experimenten steeds belangrijker. Naast vermindering van dierproeven en kosteneffectiviteit, kan het grootste voordeel van in vitro schokgolf behandeling (IVSWT) de mogelijkheid van het bestuderen van de specifieke werking van een bepaald type cel. In schokgolf gemedieerde weefselregeneratie waarschijnlijk alle cellen van het behandelde weefsel betrokken zijn, zelfs systemische effecten besproken. Toch heeft elk type cel speelt een specifieke rol en heeft een eigen intrinsieke functie. IVSWT stelt ons in staat om deze specifieke functie een te detecterennd daardoor geeft ons een beter begrip van de complexe onderliggende processen.

Kennis van vandaag over effecten schokgolf op celculturen omvat de toename van proliferatie, wijziging van celmembraanreceptoren, verhoging en versnelling van celdifferentiatie, afgifte van groeifactoren en chemo-lokstoffen evenals verhoogde cel migratie ^7-9.

Storende fysieke effecten meeste in vitro modellen Verschillende methoden voor het aanbrengen schokgolven op celkweken beschreven. Dit feit leidt tot het probleem dat het zeer moeilijk resultaten te vergelijken, zoals lichamelijke toestand van cel stimulatie heel verschillend tussen deze modellen. In het algemeen, alle bestaande modellen richten op hoe schokgolven beste toepassen op cellen.

Echter, deze vraag blijft: Wat gebeurt er met de golven na het passeren van de celkweek? Het grootste probleem is dat het verschil in de akoestischeimpedantie van het celkweekmedium en de omgevingslucht is zo hoog, dat meer dan 99% van schokgolven gereflecteerd Figuur 1.

Door het verschil in akoestische impedantie van de twee media de golven niet alleen terug, maar een faseverschuiving van 180 ° komt die een sterke trekkrachten aan de cellen Figuur 2.

Akoestische impedantie wordt gedefinieerd als het product van de dichtheid van een materiaal en de geluidssnelheid Z = ρ x c. Voor water de akoestische impedantie is ZWater = 1440000 Ns / m ^3, voor de lucht is het slechts 420 Ns / m ^3. Het grote verschil tussen deze twee waarden resulteert in reflectie en faseverschuiving van schokgolven. De faseverschuiving blijkt een positieve druk puls in een trek-golf.

Hoewel deze trekkracht niet schadelijk voor de cellen, het interfereert met het idee nabootsen in vivo schokgolf effecten in vitro. In vivo dezetrekkrachten nauwelijks optreden als gevolg van grote lichaamsstructuren.

Bovendien kan de achterkant loopt golven zelfs verstoren de inkomende Ones. Dit kan storingen veroorzaken. Twee soorten storingen bekend. Constructieve interferentie betekent dat beide golven worden toegevoegd hetgeen resulteert in een verdubbeling amplitude Figuur 3. Destructieve interferentie treedt op als golven ontmoeten lijnrecht tegenover elkaar. Het veroorzaakt afschaffing van golven (Figuur 3). Daarom IVSWT moet een model dat schokgolven kunnen voortplanten na het passeren van de celkweek.

IVSWT waterbad

Overwegingen naar aanleiding van de bovengenoemde bezwaren leiden ons naar een waterbad voor het vermijden van het ontwerp van de beschreven problemen Figuur 4. Kortom, het bestaat uit een plexiglas gebouwde container met een membraan om elk soort schokgolf applicator verbinden. Voor koppeling tussen dit membraan en de applicator ultrageluidtransmissie geIk moet worden gebruikt. Het waterbad is gevuld met ontgast water cavitatie die zou optreden als gas werd soluted in het water te vermijden. Een kachel bij de bodem met een temperatuursensor verbonden met een regeleenheid stelt om gedurende imitatie van in vivo omstandigheden reguleren en celculturen vermijden tijdens de procedure afkoelen. De temperatuur kan stabiel worden gehouden op 37 graden Celsius als het wordt gedaan in een incubator. Een houder voor de cel monsters zorgt voor het onderdompelen van elke vorm van cultuur fles of buis. Daarbij moet het monster vaartuig volledig worden gevuld met kweekmedium, zoals luchtbellen schokgolven zouden blokkeren! Een wigvormige absorber aan de achterwand van het bad vernietigt golven om niet gereflecteerd en ren terug om interferentie te voorkomen.

Een verder voordeel van andere IVSWT modellen is de mogelijkheid van het variëren van de afstand tussen de applicator en de cultuur kolven. Bevindingen van onze groep en anderen die gebruik maken van dit model duidelijk ishoe dat elk type cel reageert zeer specifiek naar verschillende behandeling parameters. Bovendien bepalen de afstand tussen de bron van de golven en het monster is belangrijk omdat hiermee de cellen te controleren om op een bepaalde positie ten opzichte van de focus van de schokgolf applicator.

Protocol

Ethische toestemming

Na het verkrijgen van informed consent van de patiënten, werden navelstrengen verkregen van een keizersnede op de afdeling Gynaecologie voor isolatie van humane navelstreng endotheel cellen (HUVEC). Toestemming werd gegeven van de ethische commissie van de Medische Universiteit van Innsbruck (nr. UN4435).

1. Bereid de IVSWT Water Bath

1. Bereid 3.5 L van leidingwater in een geschikte tank. Water moet worden verwarmd tot 37 ° C (zie Protocol nr. 6).
2. Vul het water in het waterbad totdat het waterpeil ongeveer 3 cm onder de rand. Erg om volledig te bedekken het membraan met water. Dit zal ongeveer de voorbereide 3,5 L. vereisen
3. Sluit de temperatuursensor op de voeding.
4. Plaats de sensor in de bedoelde bevestiging op de achterwand van het waterbad.
5. Sluit verwarming tot voeding van de temperatuursensor. Doe dit niet zonderwater in het bad als de verwarming zou het plexiglas smelten.
6. Wacht tot het water een stabiele temperatuur van 37 ° C heeft bereikt Roer het water regelmatig met een soort stok om een ​​constante temperatuur in het waterbad te garanderen.

2. Bereid Cellen en cultuur Kolven

1. Zaadcellen overnacht op gewenste dichtheid in T25 kweekkolven of kweek van de cellen in de kolven direct tot zij de gewenste samenvloeiing bereikt.
2. Voor het experiment, lijnt de kolven verticaal.
3. Vul de cultuur kolven met kweekmedium tot vlak onder hun nek. Vul niet te veel medium in de kolven als medium in contact met de nek of de afsluitdop zou besmet raken.
4. Schroef de kolven met stevige kappen zonder filters om besmetting te voorkomen van water. Let erop dat het water in het bad en het bad zelf zijn niet steriel.
5. Sluit de doppen met Parafilm vóór het inbrengen in het waterbad.
6. Fix verzegeld kweekflessen in de meegeleverde voet.
7. Steek vaste kolf in het waterbad. Zorg ervoor dat het midden van de celkweek kolf ligt op dezelfde hoogte als het centrum van het membraan schokgolf applicator. Een lijn aan de zijkant van het bad begeleidt u.

3. Definieer Behandeling Parameters

1. Definieer afstand tussen schokgolf bron en voorbeeld. Identificeer perfecte behandeling parameters uitvoering van de parameter conclusie proefproject zoals beschreven in figuur 6.
2. Kies de juiste behandeling parameters (energie fluxdichtheid, frequentie) op de schokgolf apparaat. Nogmaals, zie figuur 6.

4. Shock Wave Toepassing

1. Zet tal hoeveelheden commercieel verkrijgbare ultrasone transmissie gel op de schokgolf applicator en op het membraan van het waterbad. Dit is om koppeling te verzekeren. Geen lucht of luchtbellen moet tussen de applicator en het membraan alshet zou schokgolven absorberen.
2. Sluit applicator aan het membraan en houd het stabiel in het midden van het membraan. Zorg ervoor dat het horizontaal is uitgelijnd.
3. Zorg ervoor dat de juiste verticale positie van de sonde in het waterbad is in lijn met de aangegeven markering aan de zijkant van het bad.
4. Houd centra van de applicator en de kolf stabiel in een horizontale lijn.
5. Activeer de schokgolf apparaat en de impulsen passen terwijl de kolf en de applicator in een stabiele positie tijdens de hele procedure.

5. Na behandeling

1. Neem de kolf uit het waterbad.
2. Droog het met gewone papieren handdoeken.
3. Veeg de kolf nauwkeurig met desinfecterende middelen.
4. Verwijder Parafilm afdichting en cap.
5. Pipetteer het medium in de kolven in centrifugale buizen.
6. Centrifugeren gepast. Centrifugeren parameters afhankelijk van het gebruikte celtype, Bijvoorbeeld. HUVEC voor gebruik 290 g bij kamertemperatuur.
7. 5 ml celcultuurmedium Voeg aan de kolf. Resuspendeer de celpellet gecentrifugeerd met 2 ml celkweekmedium. Pipetteer de suspensie in de kolf. Zo hoeft cel fragmenten of cellen die tijdens de behandeling kunnen zijn losgemaakt niet verdwalen.

Valkuilen

1. Bereiding en behandeling moet onder steriele omstandigheden in laminaire stroming geschieden dat verontreiniging van de celkweek te voorkomen.
2. Goede celkweek praktijk wordt aanbevolen om verontreiniging van de probes voorkomen. In het bijzonder desinfectie van de buitenkant van de kolven wordt sterk aanbevolen alvorens ze terug naar de incubator. Het waterbad, evenals het water in, is niet steriel!
3. Gebruik de kachel niet aan op de stroomvoorziening, tenzij het water bad wordt gevuld met water om schade aan het plexiglas gebouwd bad te voorkomen.
4. Gebruik royale hoeveelheden ultrasone gel op de schokgolf applicator om een ​​goede koppeling en golfvoortplanting garanderen in het bad. Lucht en zelfs kleine luchtbelletjes doen absorberen schokgolven!
5. Positie van de sondes in het waterbad met betrekking tot de applicator op de behandeling van het gehele groei te garanderen.
6. Niet probes dunk te diep in het water om besmetting te voorkomen.

Resultaten

Met de beschreven werkwijze pasten wij schokgolven op humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) die wij hiervoor geïsoleerd uit navelstrengen. Navelstrengen werden verkregen van electieve keizersneden.

HUVECs werden behandeld op een samenloop van 90% in een T25 celkweekkolf met een elektrohydraulische schokgolf therapie systeem. Behandelingsparameters waren een energie fluxdichtheid van 0,1 mJ / mm ² en een frequentie van 5 Hz. 300 impulsen toegepast op een afstand van 5 cm van d...

Discussie

De betekenis van het voorgestelde model voor in vitro drukgolfbehandeling is het feit dat golven kunnen voortplanten na het passeren van de celkweek in tegenstelling tot bestaande modellen. Daardoor kunnen storende fysische effecten zoals trekkrachten worden vermeden. Het model lijkt meer op in vivo omstandigheden dan die door anderen toepassen golven om hun celkweekkolven direct.

Een bijkomend voordeel is de mogelijkheid van het variëren van de afstand tussen schokgolf bro...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Orthogold shock wave device	Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – gefabriceerd door MTS-Europe GmbH, Konstanz, Duitsland
IVSWT Water Bath V2.0	Johann Hohenegger - Technical Products
EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl. & Growth Factors	Lonza	CC-3156 & CC-4176	Dit medium werd gebruikt voor de getoonde experimenten met HUVECs om de celcultuurflacon te vullen. Gebruik voor andere celtypen het aanbevolen medium.
Pechiney Parafilm M PM996	Pechiney Plastic Packaging	PH-LF-PM996-EA op labplanet.com	voor het afdichten van flacons
Falcon Serologische pipetten 25 ml	Becton Dickinson Labware	357525
CellMate II Serologische Pipet	Matrix Technologies
Skintact Ultrasonic Gel	Skintact	UL-01 250 ml
T25 Celcultuur flacons	COSTAR	3056
Mikrozid ontsmettingsmiddel	Schülke
3.5 L Ontgast water
Papieren handdoeken