Geautomatiseerde Scheiding van C. elegans Variabel gekoloniseerd door een bacteriële pathogenen

Samenvatting

De wormsorter vergemakkelijkt genetische screens in Caenorhabditis elegans door het sorteren wormen volgens expressie van fluorescerende verslaggevers. Hier beschrijven we een nieuw gebruik: sorteren volgens kolonisatie door een GFP-expressie ziekteverwekker, en we gebruiken het om de slecht begrepen rol van pathogeen herkenning bij het initiëren van immuunreacties te onderzoeken.

Samenvatting

De wormsorter is een instrument analoog aan een FACS machine die wordt gebruikt in studies van Caenorhabditis elegans, doorgaans naar wormen basis van expressie van een reporter fluorescent sorteren. Hier hebben we aandacht voor een alternatief gebruik van dit instrument, voor het sorteren wormen volgens hun mate van kolonisatie door een GFP-expressie ziekteverwekker. Dit nieuwe gebruik konden we de relatie tussen kolonisatie van de darm worm en inductie van immuunresponsen pakken. Terwijl C. elegans immuunrespons op verschillende pathogenen zijn gedocumenteerd, is nog onbekend wat hen initieert. De twee belangrijkste mogelijkheden (die elkaar niet uitsluiten) zijn erkenning van pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen, en detectie van schade veroorzaakt door een infectie. Om onderscheid te maken tussen de twee mogelijkheden, moet de blootstelling aan de ziekteverwekker worden gezien van de schade die ze toebrengen. De wormsorter ingeschakeld scheiding van wormen die werden uitgebreid-gekoloniseerd door de Gram-negatief pathogeen Pseudomonas aeruginosa, met de schade die wordt veroorzaakt door pathogenen, van wormen die op soortgelijke wijze zijn blootgesteld, maar niet of marginaal, gekoloniseerd. Deze verschillende populaties werden gebruikt om het verband tussen pathogenen en de inductie van transcriptionele immuunresponsen beoordelen. De resultaten suggereren dat de twee worden gescheiden, ondersteunen de mogelijkheid van pathogeen herkenning.

Inleiding

Automatische worm sortering is net als FACS, die door het meten van een fluorescerend signaal in een worm (die normaal door transgene expressie van reporter eiwitten) bij het passeren rechtgetrokken in een buis, waardoor omleiding hetzij naar een verzamelcentrum buis / put of een afvalcontainer volgens aan het poorten van de onderzoeker ¹ set parameters. De wormsorter kan op verschillende manieren onderzoek te vergemakkelijken; een voorbeeld van het gebruik van het als een analytisch instrument is een studie die spatiotemporele promotor activiteit gevolgd voor bijna 1.000 genen ^2.
Echter, het belangrijkste gebruik van de wormsorter in genetische screens, na doelwitgen expressieniveaus of lokalisatie van fluorescerend eiwit langs de as van de worm ^3-5.

Hier beschrijven we een nieuwe applicatie voor de wormsorter, in het volgen van kolonisatie van de worm door een fluorescent gelabeld ziekteverwekker. Met dit als een instrument hebben we ons gericht op de relatie tussen Pathognl kolonisatie / lading en de immuunrespons, tot nieuwe inzichten in de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de start van de immuunreacties van de worm te krijgen.

In vrijwel alle tot nu toe onderzochte organismen, initiatie van de aangeboren immuunrespons op microbiële ziekteverwekkers is afhankelijk van de erkenning van pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs), en / of gevaar /-schade geassocieerde moleculaire patronen (dempt) ^6,7. De eerste geconserveerd microbiële structuren die componenten van de microbiële celwand, het flagellum of de lipide bilaag ⁶ zijn, de tweede zowel model moleculen (bijv. ATP ^8), veranderde eiwitten of andere merkers van veranderde cellulaire processen ^9,10. Beide signalen worden herkend door eiwitten die als patroonherkenning receptoren (PRRS), die bij specifieke binding van een patroon molecuul activeert een keten van gebeurtenissen die leiden tot een beschermende respons. C. elegans is uiterst nuttig als tracta geweestble model om de verschillende aspecten van gastheer-pathogeen interacties te ontleden, maar een ding dat niet goed begrepen is hoe immuunreacties worden geïnitieerd in de worm. Geen van de vermeende receptoren die ortholoog patroonherkenning receptoren (PRRS) bij andere organismen is aangetoond PAMPs binden, en veel van de orthologen van PRRS die cruciaal voor immune responsen in andere organismen vertonen een verrassend beperkte bijdrage aan worm pathogeen reacties en weerstand. Zo is het Drosophila Toll-receptor, die essentieel zijn voor het weren grampositieve pathogenen, vertegenwoordigd C. elegans door een enkele homoloog, tol-1, die bijdraagt ​​aan bescherming tegen de Gram negatieve pathogeen Salmonella Typhimurium ^11, maar niet van andere geteste Gram-negatieve of positieve pathogenen ^11,12. Deze waarnemingen, gecombineerd met gegevens die aangeven immuunrespons kan worden geïnduceerd door het verstoren cellulaire eiwittranslatie hals sommigen ertoe gebracht om voor te stellen dat C. elegans detecteert voornamelijk DAMPs ^9,13,14. Toch rapporten beschrijven het vermogen van dode ziekteverwekkers immuunrespons op te wekken suggereren dat PAMP bindend kunnen worden hebben een belangrijke rol in pathogeen herkenning in C. elegans ^15,16. Vorige werk gericht op immuunreacties in de leeftijd gesynchroniseerde genetisch identieke C. elegans populaties aangetoond grote individuele variabiliteit in de darmflora door de bacteriële Gram-negatieve pathogeen Pseudomonas aeruginosa.

Echter, transcriptionele profiling studies behandeld deze variabel-gekoloniseerde bevolking als een entiteit ^17,18. Profiteren van deze variabiliteit, een protocol gericht een geautomatiseerde wormsorter differentieel gekoloniseerde bevolking van Caenorhabditis elegans blootgesteld aan GFP-expressie P. scheiden ontwikkelden we aeruginosa. Het onderzoeken van genexpressie in verschillend-gekoloniseerde bevolking facilitated beoordeling van de relatie tussen ziekteverwekker belasting (en de bijbehorende schade) en immune reacties en nieuwe inzichten over pathogeen erkenning in C. elegans ^19. Hieronder beschrijven we het protocol, die kunnen worden toegepast wormen geïnfecteerd met elk fluorescent gelabelde pathogeen sorteren.

Om potentiële gebruikers moet worden opgemerkt dat het aantal wormen moet worden uitgezocht afhankelijk van de aard van de volgende analyses en gebruikte protocollen. Bijvoorbeeld, in het geval van microarray genexpressie analyse> 1000 wormen zullen moeten voldoende RNA verkrijgen als standaard protocollen worden gebruikt, maar ~ 100 wormen volstaat als versterking wordt toegepast, waardoor een snelle verzameling van materiaal en dus spanning te minimaliseren de wormen.

Protocol

1. Het verkrijgen van een gesynchroniseerde Cultuur van jonge volwassen dieren

1. Groeien wormen op verschillende NGM platen bezaaid met OP50-1 E. coli bacteriën (10x geconcentreerd uit een verzadigde cultuur) tot veel wormen hebben de zwangere stadium.
2. Behandel zwangere dieren met een ei-prep oplossing voor een gesynchroniseerde cultuur (eieren) te verkrijgen.
3. Plaat eieren op verschillende 60-mm NGM platen geënt met 10x geconcentreerde OP50-1 met een dichtheid van ongeveer 150-200 eieren / plaat.
4. Incubeer de platen bij 25 ° C gedurende 2 dagen (tot wormen de L4 hebben bereikt - Jong volwassen stadium).

2. Voorbereiden van Pseudomonas aeruginosa Platen en infecteren van Worms

1. Op de dag van de ei-prep (stap 1.1) inoculeren een PA14 :: GFP cultuur in 2 ml medium B met rifampicine Koning bij een eindconcentratie van 100 ug / ml. Incubeer de kweek bij 37 ° C onder roeren O / N.
2. Plate de PA14 :: GFP cultuur op zoveel Langzaam Killing platen (SKP) als nodig is voor de test. Op elke 150 mm SKP petrischaal pipet 75-100 ul van verzadigde cultuur en gelijkmatig verdelen met behulp van een steriele glazen strooier. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 20-24 uur.
3. Verwijder platen uit incubator en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur (~ 20 min). Met behulp van M9 buffer, wassen wormen uit stap 1.4 op PA14 :: GFP platen in een minimaal volume van vloeistof. Bij het gebruik van platen van 150 mm, kan een paar honderd wormen op een enkele plaat worden geplaatst.
4. Incubeer de platen bij 25 ° C gedurende 18-21 uur. Voor P. aeruginosa-blootgestelde jonge volwassen wormen, dit is het tijdvenster de optimale verdeling van gekoloniseerde vs noncolonized dieren dat.

3. Het opzetten van de Wormsorter

Voor het uitvoeren van de steekproef soort, ervoor zorgen dat de machine goed functioneert. Details zijn te verkrijgen op http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43, en the essentiële stappen worden hieronder beschreven.

1. Stel de schede ventiel druk tot ongeveer 5 psi (4.5-5.5 bereik).
2. Om te controleren of mantelvloeistof debiet is nodig, plaats een 15 ml conische buis onder de dispenser, zet de schede klep, en zet de sorter ventiel. Houd de buis onder de dispenser voor 60 sec. Het volume in de buis moet 9-10 ml. Als het buiten dit bereik, dienovereenkomstig aan te passen de schede klep druk.
3. Om ervoor te zorgen dat mantelvloeistof debiet (ingesteld als in stap 3.2) geeft accurate sortering toelaten, test het soort tarief met behulp van 40 micrometer controle deeltjes:
4. Schakel de schede ventiel. Voeg ongeveer 25 ml control deeltje oplossing van het reservoir.
5. Zet de huls ventiel en de monsterklep.
6. Op de computer software, navigeer naar de "control deeltje mode" en klik verwerven.
7. Zorg ervoor dat het deeltje debiet ~ 5-8 deeltjes / sec, met een TOF (Time Of Flight) benadert de breedtevan het deeltje, 40 urn. Zo'n TOF geeft aan dat slechts een enkele 40 urn object passeren tegelijk. Wanneer waarden buiten dit bereik, dienovereenkomstig aan te passen de instellingen (volgende aanwijzingen hierboven).

4. Sortering Colonized vs Noncolonized Worms

1. Met M9, wassen wormen in 15 ml conische buizen. Laat volwassen wormen te zinken naar de bodem van de buis door de zwaartekracht en verwijder het supernatant. Vul de buis met verse M9. Herhaal dit proces 3-4x. Dit verwijdert een groot deel van larven en overmaat bacteriën en duurt ongeveer 10 minuten.
2. Wormen toe te voegen aan de wormsorter reservoir met een zacht-mixing kleine roerstaafje.
3. Pas eerste signaalversterking door de Green PMT 600 en de rode en gele PMT tot 200.
4. Begin het verwerven van gegevens aan te passen.
5. Streef naar een soort snelheid van 25-30 evenementen (wormen) per sec. Indien het aantal te hoog is, verdun de wormen in het reservoir met M9 dienovereenkomstig. Als de snelheid teo laag, voeg meer wormen in een klein volume van de M9.
6. Als het experiment vereist een zeer strenge scheiding van gekoloniseerde vs noncolonized wormen, zet de "toeval check" om "zuivere". Dit zorgt ervoor dat twee objecten bij te dicht bij elkaar optreden of in dezelfde druppel, de machine verwerpt de daling plaats te verzamelen.
7. Om de bevolking van belang te sorteren, tekenen hekken rond de assen aangeeft grootte (tot volwassen wormen te verkrijgen) en fluorescentie-intensiteit (dwz hoog voor gekoloniseerd, laag voor noncolonized). De waarden voor fluorescentie gating moet empirisch worden bepaald.
8. Plaats een multi-well plaat of een petrischaal onder de dispenser om wormen te verzamelen open vervolgens het soort ventiel om te beginnen met het sorteren van wormen.
9. Verzamel een kleine populatie van de dieren na te gaan onder de microscoop dat de gesorteerde populatie is de populatie van belang. Zo niet, stel de gating parameters dienovereenkomstig en ga verder met monstername.

Resultaten

Wanneer leeftijd afgestemd, genetisch identiek C. elegans worden blootgesteld aan P. aeruginosa, is wijd verspreid waargenomen niveaus van kolonisatie (figuur 1A). Met behulp van de hier beschreven efficiënte scheiding van noncolonized uit gekoloniseerde wormen worden bereikt (figuur 1B) protocol. In tegenstelling tot noncolonized wormen, gekoloniseerd wormen vertonen tekenen van schade, zoals traagheid en verminderde ontlasting ^19. Dit laatste kan een reden...

Discussie

De methode die we beschrijven maakt gebruik van TL-etikettering van entiteiten buiten de worm, om de interacties tussen de worm en zijn omgeving te volgen. In het geval dat we presenteren, werd de scheiding op basis van etikettering van een ziekteverwekker en werd gebruikt om afzonderlijke wormen met zware pathogeen last van degenen die geen (of lichte) belasting. Daaropvolgende genexpressie analyse vond geen verschil in immuunrespons tussen de twee groepen suggereren dat zij onafhankelijk van pathogenen. Het signaal da...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
M9 Buffer	zelf gemaakt		Recept op wormbook.org
Rifampicine	Sigma	R3501
Ei prep oplossing	zelf gemaakt		50 ml water; 40 ml bleekmiddel; 10 ml van 10 N natriumhydroxide
NGM platen	zelf gemaakt		Recept op wormbook.org
SKP platen	zelf gemaakt		Recept hetzelfde als NGM, alleen 0,35% pepton in plaats van 0,25%
Controle testdeeltjes	Union Biometrica	310-5071-001