Celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit te meten

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een gevoelige, cel-gebaseerde cytotoxiciteit assay. Door het tellen van de afname in frequentie van levende doelwit CD4+ T-cellen in aanwezigheid van een toenemend aantal effector CD8+ T-cellen, staat deze assay toe de directe beoordeling van de cytolytische activiteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen.

Samenvatting

Cytolytische activiteit van CD8+ T-cellen wordt zelden geëvalueerd. We beschrijven hier een nieuwe cel-gebaseerde assay om de capaciteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen om CD4+ T-cellen te doden die beladen zijn met hun cognate peptide te meten. Doel-CD4+ T-cellen worden verdeeld in twee populaties, gelabeld met twee verschillende concentraties CFSE. Eén populatie wordt gepulseerd met het peptide van belang (CFSE-low) terwijl de andere ongepulseerd blijft (CFSE-high). Gepulseerde en ongepulseerde CD4+ T-cellen worden gemengd in een gelijke verhouding en geïncubeerd met een toenemend aantal gezuiverde CD8+ T-cellen. De specifieke doding van autologe doel-CD4+ T-cellen wordt geanalyseerd door middel van flowcytometrie na co-cultuur met CD8+ T-cellen die de antigeen-specifieke effector CD8+ T-cellen bevatten, gedetecteerd door peptide/MHCI tetrameerkleuring. De specifieke lysis van doel-CD4+ T-cellen gemeten bij verschillende effector versus doel verhoudingen, maakt het mogelijk om lytische eenheden, LU₃₀/10⁶ cellen, te berekenen. Deze eenvoudige en duidelijke assay maakt een nauwkeurige meting van de intrinsieke capaciteit van CD8+ T-cellen mogelijk om doel-CD4+ T-cellen te doden.

Inleiding

Cytolytische activiteit is de belangrijkste functie van CD8+ T-cellen, maar wordt nog steeds zelden gemeten omdat de assays die hiervoor worden gebruikt omslachtig zijn en moeilijk te standaardiseren^1,2. Nauwkeurige meting van deze functie is van het grootste belang bij het karakteriseren van effectorfuncties van CD8+ T-cellen, aangezien er nog geen betrouwbare voorspellers van effectieve celgemedieerde cytotoxiciteit zijn beschreven. Hier stellen we een nieuwe functionele assay voor om de cytotoxische activiteit van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen op doelgerichte CD4+ T-cellen te meten. Er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om alternatieven te bie....

Protocol

1. Preparatie van Effector CD8+ T Cellen

1. Ontdooi autologe gecryopreserveerde PBMC's (2-3 flacons van 50 x 10⁶ cellen) door de cryovial van vloeibare stikstof over te brengen naar een 37 °C waterbad.
2. Was de cellen door de buis tot 50 ml te vullen met volledige RPMI (4 mM L-glutamine, en 100 U/ml penicilline en streptomycine, aangevuld met 10% FBS). Tel PBMC's en resuspendeer cellen in een concentratie van 5 x 10⁶/ml in volledige RPMI.
3. Voeg specifiek peptide (5 µg/ml) en IL-2 (10 ng/ml) toe aan PBMC's.
4. Stel cultuur in 96 diepe welbplaat in; zaai 1 ml van celsuspensie in elke put.
5. Vervang na 3 dage....

Resultaten

Het schema in Figuur 1 vat de assay samen. Gezuiverde CD8+ T-cellen (effectorcellen) werden geresuspendeerd in 450 µl compleet RPMI en er werden seriële verdunningen uitgevoerd door 225 µl CD8+ T-cellen toe te voegen aan de volgende buis die 225 µl medium bevatte (bovenste paneel). Gezuiverde CD4+ T-cellen (doelcellen) werden geteld, verdeeld over twee buizen en gekleurd met twee verschillende concentraties CFSE (hoog en laag) zoals beschreven in het protocol. CFSE-low CD4+ T-cellen werden gepulseerd met.......

Discussie

De hier beschreven assay maakt kwantificering mogelijk van de belangrijkste functie van CD8+ T-cellen: de cytolytische activiteit. De nauwkeurige meting van deze functie is van groot belang bij het karakteriseren van effectorfuncties van CD8+ T-cellen, aangezien eerdere studies een discrepantie rapporteerden tussen deze functie en de cytokinesecretie van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen^10,11. Vanwege de korte incubatietijd van de cocultuur (6 uur) en het gebruik van autologe doelcellen, is er een lage mate van.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit	Stamcel	19052
EasySep Human CD8+ T Cell Enrichment Kit	Stamcel	19053
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit - Voor Flow Cytometry	Invitrogen	C34554
Far Red LIVE/DEAD fixable dode cel	Invitrogen	L10120
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Human CD3	BD	557943
Brilliant Violet 650 Anti-Human CD4 Antilichaam	Biolegend	317435
PerCP anti-human CD8 Antilichaam	Biolegend	344707
RPMI 1640 Medium 1x	VWR	10-040-CV
Penicillin-Streptomycin 100x Oplossing	Invitrogen	15070063
Fetal bovien serum - Gold, hitte-geïnactiveerd	PAA	A15-252
96-wells platen; Behandeld; U-bodem; met deksel	BD Falcon	353077
25 ml steriele polystyreen, individueel verpakte reservoirs	USA Scientific	2321-2230
96-wells U-bodem, steriele 2 ml diepe putjes platen	Thermo Scientific	275743
Human IL-2 (v126), onderzoekskwaliteit	Miltenyi Biotec	130-093-096
RoboSep Buffer, scheidingsbuffer	Stamcel	20104
15 ml Polypropyleen Conische Buiskoppeling	BD Falcon	352097
14 ml ronde bodembuiskoppeling, polypropyleen	BD Falcon	352059
De Big Easy EasySep Magneet	Stamcel	18001
PBS 1x	VWR	21-040-CV
96-wells; V-bodem plaat met deksel	Fisher	12-565-481
Formaldehyde oplossing, ACS reagens, 37 wt % in H2O	Sigma-Aldrich	252549-500ML
1,5 ml microbuisje met schroefdop, conisch	Sarstedt	72.692.005