Celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit te meten

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een gevoelige, cel-gebaseerde cytotoxiciteit assay. Door het tellen van de afname in frequentie van levende doelwit CD4+ T-cellen in aanwezigheid van een toenemend aantal effector CD8+ T-cellen, staat deze assay toe de directe beoordeling van de cytolytische activiteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen.

Samenvatting

Cytolytische activiteit van CD8+ T-cellen wordt zelden geëvalueerd. We beschrijven hier een nieuwe cel-gebaseerde assay om de capaciteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen om CD4+ T-cellen te doden die beladen zijn met hun cognate peptide te meten. Doel-CD4+ T-cellen worden verdeeld in twee populaties, gelabeld met twee verschillende concentraties CFSE. Eén populatie wordt gepulseerd met het peptide van belang (CFSE-low) terwijl de andere ongepulseerd blijft (CFSE-high). Gepulseerde en ongepulseerde CD4+ T-cellen worden gemengd in een gelijke verhouding en geïncubeerd met een toenemend aantal gezuiverde CD8+ T-cellen. De specifieke doding van autologe doel-CD4+ T-cellen wordt geanalyseerd door middel van flowcytometrie na co-cultuur met CD8+ T-cellen die de antigeen-specifieke effector CD8+ T-cellen bevatten, gedetecteerd door peptide/MHCI tetrameerkleuring. De specifieke lysis van doel-CD4+ T-cellen gemeten bij verschillende effector versus doel verhoudingen, maakt het mogelijk om lytische eenheden, LU₃₀/10⁶ cellen, te berekenen. Deze eenvoudige en duidelijke assay maakt een nauwkeurige meting van de intrinsieke capaciteit van CD8+ T-cellen mogelijk om doel-CD4+ T-cellen te doden.

Inleiding

Cytolytische activiteit is de belangrijkste functie van CD8+ T-cellen, maar wordt nog steeds zelden gemeten omdat de assays die hiervoor worden gebruikt omslachtig zijn en moeilijk te standaardiseren^1,2. Nauwkeurige meting van deze functie is van het grootste belang bij het karakteriseren van effectorfuncties van CD8+ T-cellen, aangezien er nog geen betrouwbare voorspellers van effectieve celgemedieerde cytotoxiciteit zijn beschreven. Hier stellen we een nieuwe functionele assay voor om de cytotoxische activiteit van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen op doelgerichte CD4+ T-cellen te meten. Er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om alternatieven te bieden voor de gouden standaard, chromium-release-assay. We presenteren hier een op cellen gebaseerde assay die het hele proces van doden onthult, aangezien deze de dood van levende doelwitten meet. Deze methode is afgeleid van protocollen van flowcytometrie-gebaseerde cytotoxische assays in vivo bij muizen^4,5 en in vitro bij mensen⁶. In dit protocol worden de antigeenspecifieke CD8+ T-cellen die in de totale CD8+ T-celpopulatie aanwezig zijn, gebruikt als effectorcellen en autologe CD4+ T-cellen worden gebruikt als doelcellen. Effectieve CD8+ T-cellen van belang worden geteld met behulp van MHCI/peptide tetramers⁷. De dood van doelcellen wordt berekend door de verhouding tussen peptide geladen/niet-geladen CD4+ T-cellen. We hebben eerder aangetoond dat deze methode reproduceerbaar, gevoelig, specifiek was en niet afhankelijk was van het aantal effectorcellen binnen de totale CD8+ T-celpopulatie⁸. Door zowel het aantal effector- als doelcellen in de cocultuur-assay te tellen, kan de intrinsieke capaciteit van CD8+ T-cellen om doelcellen te doden worden berekend en uitgedrukt in lytische eenheden⁹.

Protocol

1. Preparatie van Effector CD8+ T Cellen

1. Ontdooi autologe gecryopreserveerde PBMC's (2-3 flacons van 50 x 10⁶ cellen) door de cryovial van vloeibare stikstof over te brengen naar een 37 °C waterbad.
2. Was de cellen door de buis tot 50 ml te vullen met volledige RPMI (4 mM L-glutamine, en 100 U/ml penicilline en streptomycine, aangevuld met 10% FBS). Tel PBMC's en resuspendeer cellen in een concentratie van 5 x 10⁶/ml in volledige RPMI.
3. Voeg specifiek peptide (5 µg/ml) en IL-2 (10 ng/ml) toe aan PBMC's.
4. Stel cultuur in 96 diepe welbplaat in; zaai 1 ml van celsuspensie in elke put.
5. Vervang na 3 dagen cultuur de helft van het celcultuurmedium met vers volledige RPMI.
6. Verzamel na 6 dagen cultuur alle PBMC's met meerkanaalspipet en breng cellen over in steriele reservoir.
7. Tel, was en resuspendeer PBMC's bij 5 x 10⁷/ml in de aanbevolen scheidingsbuffer in 14 ml ronde bodembuizen. Voeg menselijke CD8+ T cel verrijkingscocktail toe bij 50 µl/ml cellen. Meng en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Voeg magnetische deeltjes toe bij 150 µl/ml en incubeer gedurende 5 min.
8. Breng de celsuspensie op 7 ml door de scheidingsbuffer toe te voegen. Ga door met immunomagnetische isolatie van onaangeroerde CD8+ T cel door de buis in de magneet te plaatsen. Na 5 min, met de buis nog steeds in de magneet, giet de cellen van belang in een nieuwe 15 ml conische buis. Neem een kleine aliquot en kleed de cellen met antilichamen tegen CD3 en CD8 in 1X PBS-2% FBS gedurende 30 min bij 4 °C. De zuiverheid van de CD8+ T cellen kan dan gemeten worden via flowcytometrie met een verwachte zuiverheid van 95% of hoger.
9. Resuspendeer CD8+ T cellen in 450 µl met volledige RPMI.
10. Voeg 225 µl van volledige RPMI toe in 5 schroefdopbuizen.
11. Bereid seriële verdunningen (van 1:2 tot 1:32) voor door 225 µl van CD8+ over te brengen naar de volgende buis (zie Figuur 1 bovenpaneel).

2. Preparatie van Doelwit CD4+ T Cellen

1. Ontdooi autologe gecryopreserveerde PBMC's (1 flacon van 50 x 10⁶ cellen) door de cryovial van vloeibare stikstof over te brengen naar een 37 °C waterbad.
2. Breng de celsuspensie over naar een 50 ml conische buis die 10 ml van RPMI bevat.
3. Was cellen en resuspendeer PBMC's bij 5 x 10⁷/ml met scheidingsbuffer in 14 ml ronde bodembuizen. Voeg menselijke CD4+ T cel verrijkingscocktail toe bij 50 µl/ml cellen. Meng en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Voeg magnetische deeltjes toe bij 100 µl/ml en incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
4. Breng de celsuspensie op 7 ml door de scheidingsbuffer toe te voegen. Ga door met de isolatie van CD4+ T cellen door de buis in de magneet te plaatsen. Na 5 min, met de buis nog steeds in de magneet, giet de gewenste cellen in een nieuwe 15 ml conische buis. Neem een kleine aliquot en kleed de cellen met antilichamen tegen CD3 en CD4 in 1x PBS-2% FBS gedurende 30 min bij 4 °C. De zuiverheid van de CD4+ T cellen kan dan gemeten worden via flowcytometrie met een verwachte zuiverheid van 95% of hoger.
5. Tel CD4+ T cellen, verdeel ze in twee 15 ml conische buizen en was in warm 1x PBS.
6. Bereid een 0.4 µM CFSE-high werkoplossing in warm PBS.
7. Bereid een 0.04 µM CFSE-low werkoplossing voor door een portie van de 10x CFSE high werkoplossing te verdunnen in warm PBS.
8. Resuspendeer cellen bij 20 x 10⁶/ml van PBS (als het aantal CD4+ T cellen minder is dan 10 x 10⁶/ml resuspendeer cellen in 0,5 ml van PBS) en kleed de helft van de CD4+ T cellen door één gelijke volume van 0.4 µM CFSE-high werkoplossing toe te voegen (finale concentratie 0.2 µM). Bijvoorbeeld, voor 1 ml cellen, voeg 1 ml van de CFSE werkoplossing toe. Kleed de resterende helft van de CD4+ door één gelijke volume van 0.04 µM CFSE-low werkoplossing toe te voegen (finale concentratie 0.02 µM). Kleed cellen gedurende 15 min bij 37 °C in 5% CO₂ atmosfeer.
9. Na de incubatie, pelleteer cellen bij 1.500 rpm gedurende 5 min en resuspendeer in 1 ml warme volledige RPMI om de labelreactie te dempen.
10. Pulse CFSE-low CD4+ T cellen door het peptide van belang toe te voegen bij een finale concentratie van 5 µg/ml in de volledige RPMI en incubeer gedurende 45 min in 5% CO₂ atmosfeer bij 37 °C.
11. Was CFSE-high en CFSE-low CD4+ T cellen in volledige RPMI. Herhaal gedurende in totaal twee wasbeurten. Resuspendeer bij een concentratie van 2 x 10⁵ cellen/ml elk in volledige RPMI.
12. Meng de twee doelpopulaties bij een verhoud

Resultaten

Het schema in Figuur 1 vat de assay samen. Gezuiverde CD8+ T-cellen (effectorcellen) werden geresuspendeerd in 450 µl compleet RPMI en er werden seriële verdunningen uitgevoerd door 225 µl CD8+ T-cellen toe te voegen aan de volgende buis die 225 µl medium bevatte (bovenste paneel). Gezuiverde CD4+ T-cellen (doelcellen) werden geteld, verdeeld over twee buizen en gekleurd met twee verschillende concentraties CFSE (hoog en laag) zoals beschreven in het protocol. CFSE-low CD4+ T-cellen werden gepulseerd met...

Discussie

De hier beschreven assay maakt kwantificering mogelijk van de belangrijkste functie van CD8+ T-cellen: de cytolytische activiteit. De nauwkeurige meting van deze functie is van groot belang bij het karakteriseren van effectorfuncties van CD8+ T-cellen, aangezien eerdere studies een discrepantie rapporteerden tussen deze functie en de cytokinesecretie van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen^10,11. Vanwege de korte incubatietijd van de cocultuur (6 uur) en het gebruik van autologe doelcellen, is er een lage mate van...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit	Stamcel	19052
EasySep Human CD8+ T Cell Enrichment Kit	Stamcel	19053
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit - Voor Flow Cytometry	Invitrogen	C34554
Far Red LIVE/DEAD fixable dode cel	Invitrogen	L10120
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Human CD3	BD	557943
Brilliant Violet 650 Anti-Human CD4 Antilichaam	Biolegend	317435
PerCP anti-human CD8 Antilichaam	Biolegend	344707
RPMI 1640 Medium 1x	VWR	10-040-CV
Penicillin-Streptomycin 100x Oplossing	Invitrogen	15070063
Fetal bovien serum - Gold, hitte-geïnactiveerd	PAA	A15-252
96-wells platen; Behandeld; U-bodem; met deksel	BD Falcon	353077
25 ml steriele polystyreen, individueel verpakte reservoirs	USA Scientific	2321-2230
96-wells U-bodem, steriele 2 ml diepe putjes platen	Thermo Scientific	275743
Human IL-2 (v126), onderzoekskwaliteit	Miltenyi Biotec	130-093-096
RoboSep Buffer, scheidingsbuffer	Stamcel	20104
15 ml Polypropyleen Conische Buiskoppeling	BD Falcon	352097
14 ml ronde bodembuiskoppeling, polypropyleen	BD Falcon	352059
De Big Easy EasySep Magneet	Stamcel	18001
PBS 1x	VWR	21-040-CV
96-wells; V-bodem plaat met deksel	Fisher	12-565-481
Formaldehyde oplossing, ACS reagens, 37 wt % in H2O	Sigma-Aldrich	252549-500ML
1,5 ml microbuisje met schroefdop, conisch	Sarstedt	72.692.005