Imaging celmembraan letsel en Subcellulaire processen die betrokken zijn in reparatie

Samenvatting

Het genezingsproces beschadigde cellen omvat handel specifieke eiwitten en subcellulaire compartimenten aan de plaats van celmembraan schade. Dit protocol beschrijft assays deze processen volgen.

Samenvatting

Het vermogen van beschadigde cellen te genezen is een fundamenteel cellulair proces, maar cellulaire en moleculaire mechanismen betrokken bij genezing beschadigde cellen worden slecht begrepen. Hier assays zijn beschreven om het vermogen en de kinetiek van genezing van gekweekte cellen na gelokaliseerde schade controleren. Het eerste protocol beschrijft een eindpunt gebaseerde benadering van celmembraan herstel vermogen van honderden cellen tegelijkertijd te beoordelen. Het tweede protocol beschrijft een real-time imaging benadering om de kinetiek van celmembraan reparatie in individuele cellen na gelokaliseerde letsel met een gepulste laser controleren. Als genezing beschadigde cellen betreft handel in specifieke eiwitten en subcellulaire compartimenten om de plaats van het letsel, de derde protocol beschrijft het gebruik van bovenstaande eindpunt gebaseerde benadering van een dergelijke handel event (lysosomale exocytose) in honderden cellen gewond gelijktijdig beoordelen en het laatste protocol beschrijft het gebruik van gepulste laser letsel met TIRF microskopie aan de dynamiek van de individuele subcellulaire compartimenten in beschadigde cellen bij hoge ruimtelijke en temporele resolutie monitoren. Terwijl de protocollen Hier wordt de toepassing van deze benaderingen het verband tussen celmembraan reparatie en lysosomale exocytose in gekweekte spiercellen bestuderen, kunnen ze worden toegepast als zodanig voor andere hechtende gekweekte cellen en subcellulaire compartiment keuze.

Inleiding

Celmembraan handhaaft de integriteit van de cellen door een barrière tussen de cellen en de extracellulaire omgeving. Een chemische, elektrische of mechanische stimulus die de normale fysiologische drempel en de aanwezigheid van binnendringende pathogenen dan kan elk letsel aan het celmembraan en leiden tot een latere cellulaire respons op de schade te herstellen. Om deze verwondingen overleven de celmembraan, cellen beschikken over een efficiënt mechanisme voor reparatie. Dit mechanisme is calcium afhankelijk en gaat intracellulair verkeer van eiwitten zoals annexinen en MG53 oa evenals subcellulaire compartimenten zoals endosomen, lysosomen, Golgi afgeleide blaasjes en mitochondriën aan de benadeelde celmembraan ^1-7. Toch blijft de gegevens van de sequentie van moleculaire en subcellulaire gebeurtenissen betrokken bij het herstel van beschadigde celmembraan slecht begrepen.

Reparatie reactie cel kan worden gescheiden in het oorly en late reacties. Vroege reacties, die binnen seconden tot minuten tijdschaal, zijn enorm belangrijk bij het bepalen van de aard van de late reacties die leiden tot succesvol herstel van cellen of celdood. Eindpunt assays gebaseerd op bulk biochemische en cellulaire analyse hebben meegewerkt aan de totstandkoming van de betrokkenheid van de moleculaire en cellulaire processen in de reparatie. Maar vanwege de heterogeniteit en de snelheid van cellulaire reparatiereactie, eindpunt assays niet de kinetische en ruimtelijke data van de reeks gebeurtenissen die tot herstelling. Benaderingen die gecontroleerde schade van celmembraan mogelijk en laat de controle celmembraan reparatie en bijbehorende subcellulaire reacties op hoge ruimtelijke en temporele resolutie zijn ideaal voor dergelijke studies. Hier hebben dergelijke benaderingen gepresenteerd. Twee van de protocollen beschreven benaderingen van de real-time kinetiek van celmembraan reparatie en de subcellulaire responsen geassocieerd met het reparatieproces in levende cellen na laser inj bewakenUry. Ter aanvulling op deze live cell imaging gebaseerde testen, hebben eindpunt assays ook beschreven dat een populatie gebaseerd maatregel voorzien in toezicht reparatie van individuele cellen en de bijbehorende subcellulaire reacties. Om hun nut bewijzen deze benaderingen zijn gebruikt om mensenhandel en exocytose van lysosomen bewaken in reactie op celmembraan letsel.

Protocol

1. Imaging celmembraan Reparatie behulp Bulk (Glass Bead) Verwonden

Met dit protocol kunt afzonderlijk markeren van de beschadigde cellen en degenen die niet te genezen. Kwantificeren van deze populaties van cellen vereist het gebruik van drie voorwaarden: 1. Test (C1) - Cellen mogen te herstellen in aanwezigheid van Ca ^{2 +,} 2. Controle 1 (geen schade C2) - Cellen worden geïncubeerd in aanwezigheid van ^{Ca2 +,} maar niet gewond en 3. Control 2 (geen reparatie C3) - cellen zijn toegestaan ​​om te herstellen in afwezigheid van Ca ^{2 +.}

1. Kweek cellen> 50% confluentie drie steriele dekglaasjes en was C1 en C2 tweemaal met CIM bij 37 ° C en C3 met PBS bij 37 ° C en overdracht dekglaasjes op silicone O-ringen.
2. Voeg 100 ul van voorverwarmde FITC dextran oplossing CIM van C1 en C2 of C3 PBS.
3. Verwonden plasmamembraan bij C1 en C3 door zacht glooiende 40 mg glazen kralen over het dekglaasje bij kamertemperatuur door het handmatig kantelen dekglaasjes terug enweer 6-8 keer onder een hoek van 30 °.
   Opmerking: Bij lichte blessure, zorgen de glazen kralen zijn gelijkmatig verdeeld, dus het minimaliseren van herhaling verwondingen. Om reproduceerbaarheid schade tussen monsters verbeteren, tegelijkertijd uitvoeren van de glaskraal schade van de verschillende monsters te vergelijken.
4. Om verdere rollen kralen; breng dekglaasjes tot een 37 ° C incubator bij omgevingstemperatuur _CO2 en laat reparatie men gedurende 5 minuten.
5. Zonder dat de korrels rollen, het glazen kralen en FITC dextran door wassen met CIM (C1 en C2) of PBS (C3) bij 37 ° C.
6. Plaats coverslips terug op de O-ring en voeg 100 ul van voorverwarmde lysine fixable TRITC dextran oplossing CIM op C1 en C2 of in PBS op C3.
7. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten bij omgevingstemperatuur _CO2.
8. Was tweemaal met dekglaasjes voorverwarmde CIM en bevestig met 4% PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
9. Was tweemaal met PBS en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur Hoechst kleurstof.
10. Wassen samples tweemaal met PBS, monteren op een dia met behulp van montage media en imago cellen met behulp van een epifluorescentiemicroscoop.
11. Gebruik cellen van C2 naar de achtergrond rode en groene kleurintensiteit bepalen en deze waarde drempel de rode en groene kanalen voor alle monsters (C1-C3).
12. Score totaal aantal cellen dat a) groene (gewonden en gerepareerd) en b) rood of beide rood en groen (gewonden, maar niet te repareren) C1 en C3 monsters.
13. Telling> 100 greens cellen voor elke voorwaarde en drukken de fractie van cellen die niet te repareren als percentage van alle cellen gewonden (groen en rood).

2. Live-Imaging van de kinetiek van celmembraan Reparatie Na Laser Injury

1. Was de cellen met voorverwarmde CIM en zet dan het dekglaasje in CIM met FM kleurstof.
2. Plaats het dekglaasje in een houder in de bovenste fase incubator op 37 ° C.
3. Selecteer een 1-2 ^mm2 gebied van het celmembraan en bestralen voor <, 10 msec met gepulste laser. Verzwakken het laservermogen via de software tot 40-50% van het piekvermogen. Optimale voeding laat consistent, maar niet-dodelijke verwondingen en dit moet worden bepaald door trial and error voor elk individueel instrument en cellijn wordt gebruikt.
4. Te repareren, afbeelding controleren elke 10 seconden in epifluorescentie en helderveld, ingaan vóór letsel en blijven voor 3-5 minuten na letsel.
   Opmerking: Voor geen reparatie controle, herhaalt u de stappen 2,1-2,4 met de cellen gewond bij PBS met FM-kleurstof.
5. Om de kinetiek van de reparatie te kwantificeren, meten cellulaire FM kleurstof fluorescentie en plot de verandering in intensiteit (ΔF/F0) in de loop van de beeldvorming. Deze gegevens worden gemiddeld voor meer dan 10 cellen per conditie en uitgezet als gemiddelde waarde of individuele cel, zoals nodig.

3. Imaging Bulk (Glass Bead) Letsel Induced Lysosomal Exocytosis

De volgende monsters omvatten cellen gekweekt tot> 50%samenvloeiing: 1. Test (C1) - cellen toegestaan ​​te herstellen in aanwezigheid van Ca ^{2 +,} 2. Controle 1 (C2; geen letsel) - Cellen noch gewond noch geïncubeerd met primair antilichaam, en 3. Control 2 (C3; geen reparatie) - Cellen toegestaan ​​om te herstellen in afwezigheid van Ca ^{2 +.}

1. Was dekglaasjes C1 en C2 tweemaal met CIM bij 37 ° C en C3 met PBS bij 37 ° C en overbrengen op silicone O-ringen.
2. Voeg 100 ul voorverwarmde lysine vastzetbaar TRITC dextran CIM van C1 en C2 en C3 in PBS op.
3. Verwonden plasmamembraan bij C1 en C3 zoals in stap 1.3.
4. Om verdere rollen kralen; breng dekglaasjes tot een 37 ° C incubator bij omgevingstemperatuur _CO2 en laat reparatie men gedurende 5 minuten.
5. Verwijder de glazen kralen en TRITC dextran door het wassen van de dekglaasjes in koud groeimedium en zorgt op geen rollen van de glasparels op de cellen.
6. Spoel tweemaal de dekglaasjes met koud kweekmedium en transfer naar de O-ringen.
7. Naar C1 en C3Voeg 100 ul rat anti-muis antilichaam LAMP1 koud volledig groeimedium en voeg de koude, compleet groeimedium C2.
8. Om antilichaambinding dekglaasjes Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
9. Was de dekglaasjes driemaal met koud CIM en vast alle coverslips met 4% PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en spoel 3x met CIM.
10. Incubeer alle dekglaasjes in 100 ui blokkerende oplossing gedurende 15 min bij KT
11. Incubeer alle dekglaasjes in 100 pl Alexa Fluor 488 anti-rat antilichaam gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
12. Was tweemaal met PBS en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur Hoechst.
13. Was de cellen tweemaal met PBS, monteren op een dia met behulp van montage-media en het beeld met behulp van een epifluorescentiemicroscoop.
14. Afbeeldingen gebruiken C2 cellen, bepalen de niet-specifieke achtergrondkleuring in het rode (TRITC dextran) en groene (Alexa Fluor 488 antilichaam) kanalen en deze gebruiken achtergrondkleuring waarden drempel de rode en groene kanalen voor alle monsters (C1-C3).
15. Gebruik> 100 rode gemerkte cellen uit C1 en C3 aan de intensiteit van kleuring LAMP1 (groen) in beschadigde cellen te meten. Voor een succesvolle experiment LAMP1 kleuring in cellen C3 aanzienlijk lager dan in cellen van C1 zijn.

4. Live-Imaging van celmembraan Injury Getriggerd Subcellulaire Trafficking

1. Fluorescent label de compartiment van rente door transfecteren geschikte reporter (bijv. CD63-GFP voor ⁸ lysosomen) of met behulp van fluorescerende kleurstoffen ^9.
2. Voor de etikettering lysosomen met fluorescerende kleurstof, incubeer cellen gekweekt tot 50% confluentie in groeimedia met FITC-dextran
3. Laat dextran worden endocytosed 2 uur (of langer als nodig is voor voldoende endosomal labeling met dextran door de cellijn van belang) in de CO ₂ incubator.
4. Was de cellen met voorverwarmd groeimedium en incubeer daarin gedurende 2 uur in een _CO2 incubator om alleendocytose dextran ophopen in het lysosoom.
5. Voor beeldvorming, spoel het dekglaasje in voorverwarmde CIM en houder van een dekglaasje houder op het podium top incubator bij 37 ° C.
6. Voer groothoek (voor verkeer in de cel) of TIRF (verkeer aan het celoppervlak en exocytose) imaging - cellen die niet FITC gelabelde dextran kan druk lysosomen zijn ideaal voor beeldvorming van de verplaatsing en exocytose individuele lysosomen.
7. Uitlijnen van de TIRF lasers voor imaging microscoop: Gebruik 60X of 100X doelstelling met> 1.45 NA. Stel de hoek voor het incident TIRF laserstraal met behulp van de aanpak van de fabrikant.
8. Verwonden celmembraan door bestraling een kleine (1-2 mm ²⁾ regio <100 msec, met de gepulste laser op 40-50% verzwakking.
9. Om de reactie van lysosoom controleren om schade afbeeldingscellen cel 4-6 beelden / sec gedurende minstens 2 minuten of langer, afhankelijk van de dynamiek van exocytose in de cellen van belang.

Resultaten

Protocollen hier beschreven voor de enkele-cell imaging zijn om het vermogen en de kinetiek van celmembraan reparatie (Protocollen 1 en 2) en de subcellulaire mensenhandel en fusie van lysosomen tijdens de reparatie te controleren (Protocollen 3 en 4).

Protocol nr. 1 toont een bulk test waarmee markering alle beschadigde cellen en het identificeren van die beschadigde cellen die niet te repareren. De resultaten in Figuur 1 laten zien dat, terwijl de niet-beschadigde cellen <...

Discussie

Celmembraan schade in vivo optreedt als gevolg van een verscheidenheid van fysiologische stressoren verschillende experimentele benaderingen zijn ontwikkeld om deze na te bootsen. Deze omvatten verwonden celmembraan van hechtende cellen door schrapen ze van de schaal of door passage van door een smalle boring spuit ^9,10. Naar aanleiding van dergelijke verwondingen de cellen te genezen in suspensie en niet gehouden aan de extracellulaire matrix zoals ze normaal doen in het weefsel. Weer anderen, zoals...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
HBSS	Sigma	H1387	Wordt gebruikt voor de bereiding van CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES	Fisher	BP410	Wordt gebruikt voor de bereiding van CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
FITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM of PBS
Glass beads	Sigma	G8772
TRITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM of PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM dye	Invitrogen	T3163	1 µg/µl in CIM of PBS
FITC dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml in groeimedium
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in groeimedium
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in blokkeeroplossing
Mounting media	Dako	S3023
Coverslips	Fisher	12-545-86
Glass bottom petridish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Silicone O ring	Bellco	1943-33315
Coverslip holder	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Wordt gebruikt voor groeimedium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin	VWR	12001-350	Wordt gebruikt voor groeimedium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Chicken serum	Sigma	C5405	5% kippen serum in CIM wordt gebruikt voor blokkeeroplossing tijdens immunokleuring
PBS (Ca2+ en Mg2+ vrij)	VWR	12001-664
Epifluorescent microscope	Olympus America, PA	IX81
TIRF illuminator	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluorescent illuminator	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Image acquisition and analysis software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Pulsed laser	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Stage top incubator	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS