Isolatie en fysiologische analyse van de Muis Cardiomyocyten

Samenvatting

Individuele cardiomyocyten van wilde type en mutante muizen kunnen uit het hart worden geïsoleerd om hun contractiliteit en calciumtransienten te bestuderen. Dit maakt het mogelijk om de bijdrage van cellulaire disfunctie aan hartdisfunctie, van welke oorzaak dan ook, te karakteriseren.

Samenvatting

Cardiomyocyten, de werkpaardcel van het hart, bevatten uiterst georganiseerde cytoskelet- en contractiele elementen die de contractiekracht genereren die wordt gebruikt om bloed te pompen. Individuele cardiomyocyten werden voor het eerst meer dan 40 jaar geleden geïsoleerd om de fysiologie en structuur van hartspier beter te bestuderen. Technieken zijn snel verbeterd om enzymatische spijsvertering via coronaire perfusie te omvatten. Meer recentelijk heeft het analyseren van de contractiliteit en calciumflux van geïsoleerde myocyten een essentieel hulpmiddel opgeleverd in de cellulaire en subcellulaire analyse van hartfalen. Echocardiografie en EKG's geven alleen informatie over het hart op orgaanniveau. Cardiomyocytcellen kweeksystemen bestaan, maar cellen ontbreken fysiologisch essentiële structuren zoals georganiseerde sarcomeren en t-tubuli die nodig zijn voor myocytfunctie in het hart. In het hier gepresenteerde protocol worden cardiomyocyten geïsoleerd via Langendorff-perfusie. Het hart wordt uit de muis verwijderd, gemonteerd via de aorta op een canule, geperfundeerd met verteringsenzymen en cellen worden blootgesteld aan toenemende calciumconcentraties. Rand- en sarcomeerdetectiesoftware wordt gebruikt om de contractiliteit te analyseren, en een calciumbindende fluorescerende kleurstof wordt gebruikt om calciumtransienten van elektrisch gestimuleerde cardiomyocyten te visualiseren; waardoor het begrip van de rol die cellulaire veranderingen spelen in hartdisfunctie toeneemt. Traditioneel gebruikt om de effecten van geneesmiddelen op cardiomyocyten te testen, gebruiken we dit systeem om myocyten van WT-muizen en muizen met een mutatie die dilateerde cardiomyopathie veroorzaakt te vergelijken. Dit protocol is uniek in zijn vergelijking van levende cellen van muizen met bekende hartfunctie en bekende genetica. Veel experimentele omstandigheden worden betrouwbaar vergeleken, inclusief genetische of omgevingsmanipulatie, infectie, medicamenteuze behandeling en meer. Naast fysiologische gegevens kunnen geïsoleerde cardiomyocyten gemakkelijk worden gefixeerd en gekleurd voor cytoskeletal elementen. Het isoleren van cardiomyocyten via perfusie is een uiterst veelzijdige methode, nuttig bij het bestuderen van cellulaire veranderingen die gepaard gaan met of leiden tot hartfalen in een verscheidenheid van experimentele omstandigheden.

Inleiding

Cardiomyocyten zorgen voor de samentrekkingskracht van het hart. Elke myocyt bevat georganiseerde cytoskelet- en contractiele elementen die essentieel zijn voor samentrekking. Het hart bevat niet alleen cardiomyocyten, maar ook fibroblasten, bindweefsel en gemodificeerde myocyten zoals Purkinje-vezels. Veranderingen in een of meer van deze celtypen kunnen worden waargenomen bij hartfalen, waardoor het moeilijk wordt om de uiteindelijke oorzaak van hartdisfunctie te bepalen. Verminderde ventrikelcontractiliteit van een falend hart wordt voorafgegaan door verschillende graden van bouw van bindweefsel en hypertrofie en disfunctie van de cardiomyocyten¹. Aritmieën kunnen worden veroorzaakt door disfunctie in de geleidende cellen², fibrose die de hartgeleiding onderbreekt³ of veranderingen in de expressie van ionenkanalen in cardiomyocyten^1,4. Inderdaad, deze problemen bestaan vaak op een ingewikkelde manier naast elkaar.

Het isoleren en bestuderen van cardiomyocyten maakt het mogelijk om contractiele en elektrische disfunctie van individuele myocyten te onderzoeken in de context van de algehele hartfunctie. Technieken om individuele hartmyocyten te isoleren werden meer dan 40 jaar geleden ontwikkeld in een poging om de fysiologie van deze 'workhorse'-cel van het hart beter te bestuderen. Isolatietechnieken zijn verbeterd om de opbrengst en kwaliteit van cellen te verhogen, met de cruciale ontwikkeling van coronaire perfusie via canuletie van de aorta, voor het eerst uitgevoerd in 1970⁵. Dit artikel beschrijft cardiomyocyte-isolatie gevolgd door meting van contractiliteit en calciumtransienten met behulp van ratiometrische fluorescentie en software voor gegevensverwerving voor celdimensionering. In zowel genetische als omgevingsmodellen van hartaandoeningen biedt het gebruik van dit protocol sleutelinformatie over celcontractiliteit, sarcomeercontractiliteit en relaxatie, calciumtransienten en cytoskeletdisrupsie. Dit systeem wordt vaak gebruikt om het effect van geneesmiddelen op geïsoleerde cardiomyocyten te testen^6,7. We gebruiken het systeem om contractiliteit en calciumtransienten van cardiomyocyten te vergelijken tussen wildtype muizen en muizen met een mutatie die leidt tot dilateerde cardiomyopathie.

Het bestuderen van individuele hartmyocyten heeft tal van voordelen boven andere gebruikelijke methoden om hartanatomie en fysiologie te bestuderen. Echocardiografie en elektrocardiografie geven informatie over de contractiele functie en elektrische geleiding van het hart als geheel. Geen van deze methoden verklaart de oorzaak of aard van de disfunctie onder het niveau van het hele orgaan. Het meten van contractiliteit van individuele cardiomyocyten met behulp van randdetectie en sarcomeerlengte-algoritmen kan aantonen dat veranderingen binnen de contractiele cel van het hart aanwezig zijn binnen globale hartdisfunctie. Het meten van calciumtransienten toont de invloed van veranderingen in ionenstroom op cellulair niveau op contractiele disfunctie of aritmieën aan.

Naast het aanvullen van studies van het hele orgaan, biedt dit protocol cellen die gemakkelijk kunnen worden gekleurd voor subcellulaire componenten. Het is mogelijk om cytoskeletaal veranderingen te zien door weefselsecties van het hele hart te kleuren; echter, men kan alleen een dwarsdoorsnede van cellen visualiseren. Een hele cardiomyocyte is dikker dan de typische weefselsectie, en gezien de rangschikking en lengte van de cardiomyocyten, is het moeilijk om hele cellen in een enkele sectie te zien. Geïsoleerde cardiomyocyten kunnen onmiddellijk worden gefixeerd en gekleurd voor een verscheidenheid aan cytoskeletal elementen en ionenkanalen. Confocale beelden kunnen worden samengesteld tot z-stacks van de volledige dikte van de cel. Bovendien stelt het kleuren van geïsoleerde hartmyocyten het mogelijk om componenten te kleuren die onmogelijk te visualiseren zijn in secties, zoals de membraaninvaginaties die bekend staan als t-tubuli.

Er bestaan gekweekte cellijnen van hartmyocyten, waarvan sommige vergelijkbare transcriptieprofielen en fenotypische kenmerken hebben als hartmyocyten. Sommige, zoals de HL-1-cellijn, behouden zelfs enige sarcomeerorganisatie en rudimentaire contractiele capaciteit⁸. Ondanks deze eigenschappen missen gekweekte cellen de 'box car'-vorm en t-tubulusstructuur van cardiomyocyten en hebben ze minder sarcomeerorganisatie. Deze componenten zijn essentieel voor de functie van cardiomyocyten in vivo. Bovendien staat het gebruik van gekweekte cellen genetische manipulatie toe, maar niet in vivo fysiologische manipulatie. Geïsoleerde cardiomyocyten behouden hun cellulaire organisatie lang genoeg om te bestuderen, maar kunnen nog steeds gemakkelijk worden geïmager en zelfs worden getransduceerd⁹.

Geïsoleerde cardiomyocyten zijn uiterst veelzijdig en bieden een substraat om cellen uit verschillende experimentele omstandigheden identiek te analyseren. Isolatie en fysiologische analyse van myocyten zijn door talloze laboratoria gebruikt voor een verscheidenheid aan experimenten, waaronder het bestuderen van het effect van geneesmiddelen^6,7 of kleine moleculen¹⁰, omgevingsstressors¹¹, infectie¹², ziekte¹³ of genetische mutatie^14,15 op contractiliteit en/of calciumtransienten en het bestuderen van de regulatie van contractiliteit en calciumvrijlating binnen een cardiomyocyte^15-17. Met toepassing van een van deze stressoren, zouden veranderingen in hartfunctie kunnen worden veroorzaakt door een willekeurige combinatie van veranderingen in de cardiomyocyten zelf en veranderingen in de omringende omgeving van het hart, zoals littekens, veranderingen in geleidbaarheid of veranderingen in de extracellulaire matrix. Dit is een ideaal protocol voor het beantwoorden van onderzoeksvragen over individuele myocytstructuur en -functie in de context van hartfalen van elke oorzaak.

Hoewel het talloze voordelen heeft ten opzichte van andere technieken, is fysiologische analyse van geïsoleerde cardiomyocyten niet ideaal voor elke onderzoeksvraag. Isolatie is een terminale procedure, dus cardiomyocyten kunnen alleen op één moment in het leven van de muis worden beoordeeld. Dit kan gedeeltelijk worden overwonnen door gebruik te maken van cohorten en het opofferen van individuele muizen tijdens het verloop van de ontwikkel

Protocol

Zorg ervoor dat alle procedures waarbij dieren worden goedgekeurd door de bevoegde gebruik van dieren en zorg lichaam.

1 Bereid Stock Buffers in Advance

1. Bereid 2 L voorraad Ca ^{2 +} gratis Tyrode (tabel 1). Breng de pH op 7,4 met NaOH.
2. Bereid 2 L voorraad 1,2 mM Ca ^{2 +} Tyrode (tabel 2). Breng de pH op 7,4 met NaOH.

2 Op de dag van het experiment, Bereid Perfusie, Transfer, en Spijsvertering Buffers

1. Bereid 150 ml perfusie buffer in Ca ^{2 +} gratis Tyrode (tabel 3) en filtreer door een 0,2 um filter.
2. Bereid 35 ml Ca2 ⁺ vrije transfer "Buffer A" (tabel 4) en 25 ml Ca2 ⁺ met "Buffer B" (Tabel 5). Filtreer elk door een 0,2 urn filter.
3. Bereid oplossingen van 00,06, 0,24, 0,6, en 1,2 mM Ca2 ⁺ door mengen van buffer A en B per Tabel 6.
4. Bereid 25 ml digestie buffer door oplossen verteringsenzymen in 25 ml perfusiebuffer (Tabel 7) op basis van het lichaamsgewicht (BW) van de muis. Filtreer door een filter voor gebruik 0,2 micrometer.

3 Experimentele Setup

1. Monteer een constante stroom Langendorff-apparaat, in de handel verkrijgbaar of met een peristaltische pomp, leidingen en een warmtewisselaar met een stroomsnelheid van 3 ml toestaan ​​/ min perfusievloeistof verwarmd tot 37 ° C. Een eenvoudig schema is te vinden in de evaluatie in 2011 door Bell et al ^18.
2. Stel circulerend waterbad temperatuur (~ 47 ° C) van de Langendorff inrichting zodat uitstroom uit de canule bij 37 ° C met een stroomsnelheid van 3 ml / min.
3. Run 70% ethanol via het perfusie systeem gedurende 15 min, gevolgd door 100 ml type I ultrazuiver water. Ren perfusie buffer door de system voor 5 min, terwijl het elimineren van luchtbellen.
4. Steriliseer alle chirurgische instrumenten met een gewenste methode.
5. Maak canule door het aanbrengen van een kort stuk (ongeveer 3 mm) van PE-50 slang aan het uiteinde van een 23 G Luer-adapter stub. Heat tip buis een lip waarover de aorta worden geplaatst creëren.

4 Cardiomyocyte Isolatie

1. Injecteer muis met 0,2 ml heparine-oplossing (1000 IU / ml), via intraperitoneale injectie.
2. Na 5 min, verdoven muis met isofluorane. Wanneer deze volledig verdoofd (geen reactie op sterke voet snuifje), spray op de borst met 70% EtOH. Open de kist, snel accijnzen het hart, zorg dat u de aorta, en de plaats in 4 ° C perfusie buffer niet te beschadigen. Met gebogen pincet te begrijpen en op te heffen onder het hart. Dit creëert ruimte om bijlagen achter het hart met fijne schaar knippen.
3. Canule het hart door voorzichtig grijpen de rand van de aorta met twee paar fijne tang en voorzichtig trekken aan de openinng van de aorta boven de rand van de canule. Zorg ervoor dat de punt van de canule niet voorbij de aortaklep en in het ventrikel, zoals deze perfusie van het hart zal remmen via de kransslagaders.
4. Bevestig de aorta aan de canule door binden een lus van 5-0 zijden hechtdraad rondom de aorta direct boven de rand van de canule.
5. Opmerking: De stappen 4.2 tot 4.4 moet zo snel mogelijk voor de beste kwaliteit van de spijsvertering worden afgerond.
6. Opmerking: Het hart kan rechtstreeks op de canule reeds aan de Langendorff Apparaten met stromend perfusie buffer worden opgehangen. Echter, opknoping het hart op een canule aan een kleine spuit perfusiebuffer onder een dissectie microscoop werd gevonden het meest succesvol zijn. Hierdoor kan een kleine hoeveelheid van de perfusie buffer te worden geduwd door, kijken voor clearing van kransslagaders en het waarborgen van het hart goed is aangesloten op de canule. De canule wordt vervolgens opgehangen aan de Langendorff perfusie met stromend buffer.
7. Perfusehet hart met Ca2 ⁺ vrij perfusie buffer bij een stroomsnelheid van 3 ml / min voor 2-3 minuten.
8. Schakel over naar de spijsvertering buffer enzym en perfuse voor 7-10 min, zal het hart zachter en lichter van kleur worden.
9. Opmerking: Digestion kan worden ingesteld op basis van enzymactiviteit en grootte van het hart.
10. Zodra hart is tastbaar slappe, verwijder het hart van de canule en plaats in een steriele p60 schotel met buffer A (Ca ^{2 +} gratis transfer buffer).
11. Verwijder atria en grote vaten. Verwijder rechterventrikel indien gewenst. Met forceps, scheid de hartkamer in kleine stukjes. Pipetteer meerdere malen met een steriele 5 ml pipet overdracht verder verspreiden cellen.
12. Filter de celsuspensie in een 50 ml conische buis door een 250 um nylon mesh filter.
13. Om de schorsing op pellet voor ongeveer 10 minuten.
14. Breng de pellet in de 0,06 mM Ca ^{2 +-oplossing.} Laat cellen tot pellet gedurende 10 minuten. Gezonde cellen zullen pellet, terwijl de meeste dode cellen zal drijven.
15. Zuig het supernatant, en breng de pellet aan de 0,24 mM Ca ^{2 +-oplossing.}
16. Herhaal 10 min incubatie, aspiratie en overgedragen en de overige twee Ca2 ⁺ oplossingen tot cellen in 1,2 mM oplossing. Op dit punt zou een meerderheid van de cellen staafvormige myocyten.

5 Meten en calciumhuishouding Transients

1. Opmerking: Zowel contractiliteit en calcium transiënten kunnen gelijktijdig worden gemeten.
2. Bereid Fura-2:00 oplossing suspenderen in watervrij DMSO tot een concentratie van 1 ug / ul. Fura-2:00 oplossing kan worden bewaard in een exsiccator bij -20 ° C.
3. Belasting 1 ml van zwevende cellen met 1 pl Fura-02:00. Laat cellen om te zitten in het donker 10 min daarna aspireren supernatant. Tweemaal spoelen met Ca2 ⁺ Tyrode's oplossing, waardoor cellen pellet in het donker gedurende 10 min tussen wasbeurten.
4. Plaats een glas dekglaasje in een stadium inzetstuk dat verwarmd pe toestaatrfusion / aspiratie en elektrode pacing met een myocyte veld stimulator. Plaats stadium insert op omgekeerde microscoop ingesteld voor fluorescentie meting, het toevoegen van een druppel olie op de lens als het gebruiken van een olie-immersie objectief.
5. Opgezet verwarmd zwaartekracht perfusie met 1,2 mM Ca ^{2 +} Tyrodes oplossing dus oplossing op het podium bereikt 37 ° C. Bevestig streven naar vacuüm. Bevestig elektroden.
6. Zet de microscoop systeem, en open de ratiometrische fluorescentie en mobiele dimensionering data-acquisitie software.
7. Voeg een paar druppels Fura-02:00 beladen cellen het stadium insert, tijdelijk blokkeren perfusie om gezonde cellen bezinken.
8. Gebruik 40X objectief gewenste cel te lokaliseren. Een gezonde cel zou moeten zijn staafvormige en niet spontaan samentrekkende. Het moet zichtbaar en uniform contract wanneer cel wordt gestimuleerd met 5-20 V.
9. Opmerking: Fysiologische analyse vereist een hoge kwaliteit vertering. Het is mogelijk om cellen die er gezond uitzien, maar niet per jaar hebben ce goed voor fysiologische analyse. Spijsvertering protocol kan verfijning nodig om hoge kwaliteit, gezond myocytes krijgen. Bovendien kunnen mutante of zieke harten aanpassingen aan het protocol vereist.
10. Adjust lensrotatie en diafragma veranderen zodat gewenste cel wordt horizontaal opgesteld op het scherm en de achtergrond niet zichtbaar is.
11. Lijn edge detectie bars aan elk uiteinde van myocyte en pas drempel. Lijn sarcomeer detectie op een deel van de cel met uniforme sarcomeren. Hoe langer je kunt deze bar te maken, des te nauwkeuriger het wiskundige model van de sarcomeer lengte te zijn, zolang het niet op twee populaties van sarcomeren.
12. Pace cellen op 2 Hz en 5-20 V voor 10-15 seconden voordat de opname.
13. Record tracing. Omgevingslicht moet worden geminimaliseerd voor de beste calcium voorbijgaande opname.

6 Analyse

1. Analyseer sporen met behulp ratiometrisch fluorescentie en cel dimensionering data-acquisitie software.

titel "> 7. Verdere studies

1. Dit protocol geeft overmaat cellen die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van andere experimenten inclusief: fixatie en immunokleuring evaluatie direct drugseffecten korte termijn cultuur en atomic force microscopie.

Resultaten

Wanneer de contractiliteit en voorbijgaande traces verzameld (figuur 2), zijn gegevens gemakkelijk geanalyseerd met de juiste software. De gehele tracing of delen daarvan kunnen worden gemiddeld (figuur 3). Contractiliteit kunnen worden geanalyseerd op verschillende manieren. Systolische functie, kan men de omvang van de contractie met fractionele verkorting of snelheid van contractie tijd tot piek verkorten en contractie snelheid beoordelen. Diastolische functie kan eveneens worden gea...

Discussie

Isolatie van kwaliteit hartspiercellen vereist een zekere mate van oefening en optimalisatie. Dit protocol bevat de belangrijkste stappen die sterk kan invloed hebben op de uitkomst van de spijsvertering. Deze moeten zorgvuldig worden overwogen bij het uitvoeren en oplossen van problemen met het protocol. De tijd vanaf verwijdering van het hart infusen en perfusie moet worden geminimaliseerd, bij voorkeur minder dan vijf minuten. Spoelen van het hart onmiddellijk in ijskoud perfusie buffer na het verwijderen van de muis...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
NaCl	RPI	S23020
KCl	Sigma	P-3911
MgCl2	Sigma	M-8266
HEPES	EM Science	S320
NaH2PO4	Sigma	S5011
CaCl2·2H2O	Fisher	C79
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528
2,3-Butanedione-monoxime (BDM)	Sigma	B-0753
Taurine	Sigma	T-0625
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A-7030
Collagenase B	Roche Diagnostics	1-088-823
Collagenase D	Roche Diagnostics	1-088-882
Protease XIV	Sigma	P-5147
Heparin	APP Pharmaceuticals, LLC	401586D
Isofluorane	Butler Schein	11695-6776-2
Fura-2 AM	Teflabs	103
DMSO – anhydrous	Sigma	276855
IonOptix cell pacing and fluorescent analysis system	IonOptix
250 μm nylon mesh filter	Sefar America	Lab Pak 03-250/50
23 G Luer-stub adaptor	Becton Dickinson	1482619E
PE-50 tubing	Becton Dickinson	427410