Verzameling en analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bastweefsel wondvocht De EDTA-methode vergemakkelijkt

Samenvatting

Kennis van de samenstelling van het floëem sap en het mechanisme van de lading en langeafstandsvervoer is essentieel voor het begrijpen van de lange afstand signalering bij ontwikkeling en stress / pathogeen respons planten en assimileren transport. Dit manuscript beschrijft de verzameling van floëem exsudaten gebruik van de EDTA-gefaciliteerd methode.

Samenvatting

De plant floëem is essentieel voor het vervoer over lange afstand van de (foto-) assimileert alsook van signalen overbrengen van biotische of abiotische stress. Het bevat suikers, aminozuren, eiwitten, RNA, lipiden en andere metabolieten. Hoewel er een grote belangstelling voor het begrijpen van de samenstelling en functie van het floëem, de rol van veel van deze moleculen en dus hun belang in ontwikkeling en stress plantenrespons moet nog worden bepaald. Een hindernis bij floëem analyse ligt in het feit dat het floëem zeehonden zich op verwonden. Dientengevolge, het aantal planten waaruit floëem sap kan worden verkregen beperkt. Een methode die collectie van floëem afscheidingen laat uit verschillende plantensoorten zonder toegevoegde apparatuur is de EDTA-gefaciliteerde floëem exsudaat collectie hier beschreven. Hoewel het gemakkelijk is te gebruiken, leidt wel tot het verwonden van cellen en zorg moet worden genomen om de inhoud van beschadigde cellen te verwijderen. Bovendien hebben verschillende controles zuiverheid van het exsudaat tonennoodzakelijk. Omdat het een afscheiding in plaats van een directe inning van het floëem sap (niet mogelijk in veel soorten) slechts relatieve kwantificering van de inhoud kan ontstaan. Het voordeel van deze methode boven anderen is dat het kan worden gebruikt in vele kruidachtige en houtachtige plantensoorten (Perilla, Arabidopsis, populier, enz.) en vereist minimale uitrusting en training. Het leidt tot redelijk grote hoeveelheden exsudaten die kan worden gebruikt voor daaropvolgende analyse van eiwitten, suikers, lipiden, RNA, virussen en metabolieten. Het is eenvoudig genoeg dat het kan worden gebruikt in zowel onderzoek als in het onderwijs laboratorium.

Inleiding

Planten kunnen niet bewegen om ongunstige omstandigheden te ontsnappen. Bijgevolg moesten ze mechanismen om milieu-invloeden te detecteren ontwikkelen, uitlokken en zenden een bijbehorende signaal door de plant, en de ontwikkeling aan te passen. Twee transportsystemen bestaan ​​voor de distributie van water, voedingsstoffen en andere (signalering) verbindingen. De eerste is het xyleem, die typisch transporteert water en mineralen opgenomen door de wortels in de plant. De tweede is het floëem. Volgens de floëem is veranderd van een eenvoudige assimileren transportsysteem met een leiding voor RNA, eiwitten, virussen, lipiden en andere kleine moleculen. Het speelt een belangrijke rol bij assimileren en transport van nutriënten, respons op biotische en abiotische stress, en in plantengroei en-ontwikkeling. Het wordt nu genoemd de "informatiesnelweg" van de plant ^18.

De floëem bestaat uit verschillende celtypes: floëem parenchym, alsmede gespecialiseerde companion cells en zeef elementen. De zeef element is de plaats van de lange afstand beweging. Te zorgen voor onbelemmerde langsstroming, worden zeef elementen ontbreken de meeste organellen evenals kernen en worden verondersteld om in het beste geval een beperkte translatiemachinerie ^{21, 33} bevatten. Men gelooft dat companion cellen synthetiseren eiwitten en andere verbindingen, die reizen op het floëem stroom. Deze verbindingen worden vervolgens in de zeef element via plasmodesmata vervoerd en kan functioneren als lange afstand signalen ^4,16.

Verschillende groepen van verbindingen kunnen worden gevonden in floëem exsudaten:

• Suikers Vaak gaat de fotosynthese en getransporteerd als "energie-transport" moleculen aan andere delen van de plant voor opslag of als bouwstenen. Ze kunnen echter ook als antivries of signalering verbindingen.
• Eiwitten kunnen ook worden gevonden in floëem exsudaten. Zij omvatten metabole enzymen maar heeft signaalfunctie. Een example van een eiwit dat als een ontwikkelingsstoornis signaal bedient is de Bloeiende locus T-eiwit, dat de inductie van de bloei en seizoensgebonden blad abscissie in planten signaleert. ⁶
• Nucleïnezuren aanwezig in floëem exsudaten in de vorm van mRNA, kleine en micro RNAs, en virale RNA's. Ze lijken grotendeels betrokken bij signalering ^{27, 28, 39.} Tegelijkertijd hebben rRNA en tRNA's voor vrijwel alle aminozuren waargenomen in het bastweefsel sap van Cucurbitaceae ^42. Ze lijken selectief overgebracht naar de zeef buissysteem. Het tRNA vertonen noodzakelijk zijn voor de mogelijkheid om aminozuren te dragen aan de translationele inrichting. Maar in plaats van aan vertaling, lijken ze dit proces remmen. Ze zouden ook dienen als een bron van cytokinine of signaleren metabole status van de installatie ^42.
• Vetzuren, oxylipines en andere lipiden zijn ook gevonden in floëem exudaten ^{3, 13, 14, 23.} Jasmonic zuur, een oxylipin beweegt door het floëem als onderdeel van de reactie op pathogeeninfectie ^{22, 29, 31, 32.} Hoewel de rol van de meest floëem lipiden is nog onduidelijk, sommige hebben waarschijnlijk signaalfunctie ^4.

De uitdaging in het werken met planten floëem ligt in zijn vermogen om zichzelf te verzegelen na verwonding. Er zijn vier belangrijke methoden die worden gebruikt om floëem afscheidingen te verzamelen, maar ze werken alleen in een beperkt aantal soorten:

1) In komkommerachtigen is het mogelijk om redelijke hoeveelheden floëem exsudaat vinden doorsnijdingen van de bladsteel. Zodra de eerste druppel met verontreiniging van verwonde cellen wordt verwijderd, is het mogelijk om redelijk grote hoeveelheden van zuiver sap floëem ^{1, 15} te verkrijgen. Echter, met toenemende verzamelen tijd, dit exsudaat verdikt, zodat het steeds ongeschikt voor vloeistofchromatografie benaderingen (niet gepubliceerd). Recente publicaties suggereren, dat afhankelijk van de soort, dit floëem sap wordt afgeleid van either de fasciculair (FP) of de extrafascicular floëem (EP) en dat, terwijl het bevat "mobiele" floëem sap uit de zeef elementen (FP), het is ook gevoelig voor besmetting van andere celtypen, waaronder de xyleem ^{40, 41} .

2) Een tweede benadering is om floëem sap te verkrijgen via ondiepe sneden of lekken in de stengel of bladsteel. Deze werkwijze is met succes gebruikt in lupine ^{17, 25, 36} pompoenen en Brassica napus ^12. Hier de verontreiniging door verwonde cellen is minimaal en de uitscheidingen zeer zuiver. Echter, planten nodig hebben om gezond en goed van water te zijn, omdat het is zeer uitdagend om selectief punctie gewoon de zeef elementen. Als houtvaten zijn gejat, wordt alle exsudaat getrokken in de houtvaten stroom. Dit maakt de methode geschikt voor planten met zeer fragiel of sterk verhoute bladstelen of stengels.

3) Bladluis stylectomy laat bladluizen hun stilet voegen in de zeef elementen den verwijderen van de bladluis met een laser. Floëem sap wordt afgescheiden door de overgebleven stilet ^{2, 9, 10, 35, 38.} In theorie kunnen alle planten die kunnen worden geïnfecteerd door bladluizen worden gebruikt voor deze aanpak. Toch zullen de meeste kassen of klimaatkamers managers ondersteunt het gebruik van een ziekteverwekker. Bovendien bladluizen introduceer eiwitten in het bastweefsel hun speeksel ^{19, 33.} Dit leidt tot een beperkte transcriptionele herprogrammering ³⁰ en heeft de potentie om de samenstelling floëem ²⁶ wijzigen.

4) De hier beschreven methode is de EDTA-gefaciliteerd uitzweten van floëem sap. Deze methode maakt EDTA om afdichting van de floëem ²⁰ voorkomen. EDTA chelaat ^{Ca2 +} ionen die anders zouden deelnemen processen die dicht de floëem. Terwijl EDTA kan leiden tot celbeschadiging ^30, hebben verschillende groepen deze methode en acht geen nadelig effect van EDTA concentraties van 10 mM tot 20 mM aan de cel ultrastructuur of phloem laden en transport ^{5, 24.} Om schadelijk effect, en ook interferentie van EDTA met chromatografie en gelelektroforese verminderen, worden de planten verplaatst naar water na 1 uur en alleen het laatste deel van het exsudaat wordt gebruikt ^14. Dus, in plaats van afscheiding in EDTA, wordt phloem exudated in water (EDTA-gefaciliteerd uitzweten). Het is een straight-forward, lage kosten, en de low-tech methode voor het verzamelen van floëem afscheidingen. Floëem sap deze wijze verkregen kan worden gebruikt om eiwitten, kleine moleculen, lipiden en RNA analyse en is met succes gebruikt in veel planten. Terwijl een beperkt aantal experimenten werd uitgevoerd in eenzaadlobbigen ^11, wordt de methode meer geschikt voor tweezaadlobbigen (Perilla ^{17, 20,} Arabidopsis ^{8, 13, 14,} populier ^7). Verzameling van exudaten moet plaatsvinden in een vochtige omgeving om verlies van uitscheidingen voorkomen door transpiratie. Afhankelijk van de installatie, incubatie in EDTA gedurende 1-2 uur isvoldoende afdichting van het floëem / zeef elementen te voorkomen. De collectie kan dan plaatsvinden in het water. Dit heeft het voordeel van het voorkomen van de negatieve gevolgen EDTA op celstructuur en stabiliteit. Tevens elimineert de interferentie van EDTA met methoden zoals HPLC of SDS-PAGE. Aangetoond zoals dit geldt voor Arabidopsis. Voor grotere installaties incubatie in EDTA en exsudaat verzamelingen moet worden opgeschaald en wordt uitgevoerd in bekers plaats in 1,7 ml reageerbuisjes.

Protocol

1. Bereiding van planten

1. Arabidopsis zaden kunnen worden gekiemd direct op de grond of op MS platen. Groeien de planten gedurende vier tot zes weken in groeikamers met een 12-uurs lichtperiode (22 ° C dag, 15 ° C 's nachts ^14). Planten water twee keer per week. Gebruik onderste lade voor het besproeien; niet waterplanten uit de top, zodat de trays te drogen alvorens opnieuw te drenken. Zorg ervoor dat planten zijn goed gehydrateerd op het moment van de oogst.

2. Voorbereiding van oplossingen en Schotels

1. ₂ K-EDTA-oplossing: Voeg een 100 mM K _2-EDTA voorraadoplossing, die in de koelkast worden bewaard. Op de dag van de verzameling, verder verdund 4:59 (enerzijds EDTA, vier delen water) een 20 mM K _2-EDTA oplossing.
2. Vul een glas of een petrischaal (diameter 7-15 cm) halverwege de 20 mM K _{2-EDTA-oplossing.} Als het verzamelen van monsters van verschillende behandelingen (voor exvoldoende controle en zout-gestresste planten of verschillende genotypen), bereiden aparte gerechten voor elke behandeling.
3. Vul gewenste aantal 1,7 ml reageerbuisjes met 1,4 ml 20 mM K-EDTA-oplossing _2. Vul een gelijk aantal reactiebuizen met 1,4 ml geautoclaveerd gedeioniseerd of Millipore water.
4. Zet papieren handdoeken op de bank te planten zich op, krijgen een nieuw scheermesje en op handschoenen.

3. Verzameling van bastweefsel exsudaten (afgebeeld in Stroomschema in figuur 1)

1. Harvest rozetbladeren 4-6 weken oude planten door te snijden ze met het scheermes aan de voet van de bladsteel dicht bij het centrum van de rozet.
2. Onmiddellijk het bladeren in de gerechten die 20 mM K _2-EDTA. Zorg ervoor dat het afgesneden uiteinde van de bladsteel is ondergedompeld in de oplossing (figuur 2).
3. Nadat 15 bladeren zijn verzameld (ca. 3-4 planten) voorzichtig stapelen bladeren boven elkaar de thoed de cut bladstelen zijn op elkaar afgestemd. Recut de basis van de bladstelen (ca. 1 mm) en de bladeren onmiddellijk overbrengen naar een van de reageerbuisjes met 20 mM K _{2-EDTA-oplossing.} De bladeren passen makkelijkst als ze iets zijn opgerold. Vermijd knijpen de bladeren aangezien dit schade cellen en dus leidt tot het verzamelen van bladeren celinhoud veroorzaken.
4. Als er meer materiaal nodig is, zachtjes betrekking op de monsters met een natte papieren handdoek. Gebruik een nieuwe reeks van gerechten als voor het verzamelen van monsters uit verschillende behandelingen of genotypen.
5. Nadat alle monsters zijn geplaatst in reageerbuisjes, verzamel de uitscheidingen hetzij in het donker of in het licht.
6. Voor de inzameling in het donker, lijn de vloer van een grote ondiepe schaal met natte papieren handdoeken. Plaats het rek met het blad gevulde reageerbuisjes in de schaal en de omslag met natte papieren handdoeken of in een zwarte plastic rug met sleuven voor beluchting. Leg de hele setup in een kast of een donkere kamer.
7. Voor de inzameling in het licht, lijn de bodem van een heldere plexiglas container met natte papieren handdoeken. Plaats het rek met het blad gevulde reageerbuisjes in de container en sluit het.
8. Na 1 uur, verwijder bladeren voorzichtig uit de container en de reageerbuisjes en grondig met gedestilleerd, gedemineraliseerd of Millipore water om alle EDTA te verwijderen. Deze stap dient drie doelen: (1) het verwijdert de EDTA geminimali celschade, (2) het elimineert de interferentie van EDTA met SDS-PAGE en chromatografie, en (3) verwijdert verbindingen die verzameld uit cut / beschadigd cellen. Onmiddellijk over in de voorbereide reactie buisjes met geautoclaveerd water en terug te keren naar de bevochtigde collectie containers voor de inzameling van afscheidingen. Op dit punt, voeg RNase inhibitor als het exsudaat moet worden gebruikt voor RNA-extractie. Optioneel: proteïnase remmer kan worden toegevoegd indien gewenst eiwitanalyse.
9. Na de beoogde verzamelen tijd, trek en DISCArd de bladeren en bast bevriezen de uitscheidingen in vloeibare _N2 voor verder gebruik. Indien langdurige opslag vereist, lyofiliseren de monsters en bewaar bij -80 ° C.
10. In het geval van Arabidopsis kan metabolieten al gedetecteerd na afname van uitscheidingen gedurende 1 uur. Echter, collectie voor 5-8 uur is aan te raden als de analyse van minder overvloedig onderdelen is gepland. Voor grotere installaties zoals Perilla, worden langer collectie tijden (8 uur) aanbevolen.
    Exsudaat verzameld uit 15 bladeren is meestal genoeg voor een rijstrook op een SDS-PAGE gel (eiwitten), voor mRNA extractie, GC-MS (suikers en metabolieten). Voor lipide analyse van de bundeling van 2-3 monsters (exsudaat 30-45 bladeren) wordt aanbevolen en leidt tot duidelijkere resultaten.

4. Latere Analyse (Voor Video Wij Only Show 4.4)

1. Voor eiwitanalyse, resuspendeer monster in 15 ul water en 30 pi Lämmli buffer, hitte tot 95 ° C gedurende 5 min, snel spin down elke precipitates en laad gehele monster op een SDS-PAGE gel (45 pl laden zakken). De monsters moeten worden gekleurd met colloïdaal Coomassie of andere gevoelige vlekken aangezien eiwitgehalte zeer laag.
2. Voor suiker en kleine metabolietanalyse, voeg derivatiseren middelen voor het gedroogde monster in de literatuur ^14.
3. mRNA kan worden geanalyseerd met behulp van RT-PCR, microarray of RNA-Seq-analyse.
4. Voor lipide analyse onmiddellijk pool 2-3 monsters en partitie tegen Chloroform: Methanol (1:1) in de zuurkast als volgt: voeg een gelijke hoeveelheid Chloroform: Methanol aan elk monster, vortex gedurende enkele seconden en centrifugeer gedurende 4 min bij 400 x g. Verzamel de bodem (organische) fase in een glazen buis met teflon dop en herhaal partitie met de hoogste fase nog drie keer. Droog de ​​gecombineerde organische fasen onder een stroom van N ₂ en dienen bij verdere analyse (Dunnelaagchromatografie: TLC ^{14, 37;} Vloeistofchromatografie-Massaspectrometrie: LC-MS ^14).

Resultaten

Het is duidelijk geworden in de afgelopen jaren dat de complexiteit van het floëem sap het antwoord op de vraag hoe planten te sturen verschillende ontwikkelings-en stress-signalen voor optimale respons kan zijn. Met behulp van EDTA-gefaciliteerd floëem uitzweten kan de mogelijkheid om floëem afscheidingen analyseren van planten die niet geschikt zijn voor andere benaderingen, maar kan zijn van economische of fysiologische belang.

Deze methode zorgt voor de oogst van voldoende floëem uitscheidingen te floëem-gelokaliseerde eiwitten te identificeren en detecteren veranderingen in het niveau in reactie op ontwikkeling of stress (Figuur 3). Zoals de figuur laat zien, eiwitten zijn in zeer lage overvloed, maar toch, het niveau hoog genoeg is voor de daaropvolgende proteomics experimenten met LC-MS/MS of voor Western blot analyse. Bevindingen in cucurbitaceae suggereren dat het snijden van de steel leidt tot een verstoring van het water potentieel balans en een latere instroom van water eneventuele verontreinigingen uit de apoplast ^41. Toch collectie voor tijden, variërend van een tot acht uur heeft geen invloed op het floëem eiwitprofiel / compositie in Arabidopsis (. Alleen het absolute bedrag varieert Guelette et al.), de hoeveelheid eiwit verzameld en het patroon van eiwitten gevonden varieert tussen soorten (Arabidopsis: op; Perilla, lane I en NI) en behandelingen (Perilla gegroeid op verschillende dag lengtes, lane I en NI). Hierdoor eiwitachtig signalen kunnen worden gevisualiseerd, geïdentificeerd en gevolgd.

mRNA en micro RNAs kunnen ook bastweefsel exudaten worden geïdentificeerd door deze methode. Echter, de behandeling met RNAse inhibitor noodzakelijk voor afbraak van het mRNA tijdens de verlengde exudatie tijd voorkomen. Aangezien de zeef elementen niet functioneel chloroplasten Rubisco kleine of grote subeenheid (RBCs of RbCl respectievelijk) bevatten mRNA kan worden gebruikt als negatieve controles, terwijl bekend bastweefselGelokaliseerde mRNA achtige Ubiquitine-conjugerend enzym worden gebruikt als een positieve controle (Figuur 4).

Evenzo kunnen suikers of kleine metabolieten worden geanalyseerd met behulp van GC-MS of LC-MS. Hierbij moet worden opgemerkt dat het floëem uitscheidingen bevatten een groot aantal functionele enzymen, waaronder bijna de volledige glycolytische route ^12. Vandaar dat, met behulp van verschillende tijdstippen kunnen metabole processen tijdens het exsudaat collectie te onthullen. Een voorbeeld is getoond in Figuur 5: In alle afscheidingen, sucrose is de meest voorkomende metaboliet, dit is het duidelijkst na verzameling gedurende 1 uur. Na vijf uur de sucrose fructose enigszins verminderd. Als dezelfde wondvocht wordt verzameld voor een uur en links op de bank voor de komende vier uur, wordt de sucrose te verhouding fructose gereduceerd tot een veel grotere mate, wat suggereert dat actieve enzymen in het floëem uitscheidingen leiden tot een degradatie van sucrose bij kamertemperatuurtuur (voor meer peak interpretaties zie ^14). Dit komt overeen met de bevindingen die floëem laden en transport van moleculen uit begeleider cellen in de zeef elementen, nog tijdens afscheiding tot het systeem verliest zijn vitaliteit ^34.

Lipiden in het floëem afscheidingen en, bij uitbreiding, lange-afstand lipide signalering zijn een vrij recente veld van interesse in de plantkunde. Door hun hydrofobe aard lipiden slechts aanwezig in lage concentraties en worden gebonden aan andere moleculen voor solubilisatie. Toch is de EDTA-vergemakkelijkt afscheiding maakt het verzamelen van voldoende materiaal te visualiseren (TLC, figuur 6), en identificeren (LC-MS, Figuur 7) floëem lipiden uit verschillende plantensoorten. Zoals de figuur laat zien is het mogelijk om verscheidene soorten lipiden identificeren en te scheiden. LC-MS maakt het mogelijk om verschillende soorten lipiden te identificeren en om veranderingen te volgen binnen het lipidenprofiel van different genotypen of behandelingen. Dit maakt de studie van de rol van lipiden in plantenontwikkeling en stressrespons.

Figuur 1. Stroomdiagram van de collectie van floëem afscheidingen van Arabidopsis of Perilla. Verschillende wegen leiden tot verschillende eindproducten, die zijn aangegeven in blauw. Voor de bereiding van RNA, RNAse-remmer (100 U / ml, Roche) wordt toegevoegd aan het water waarin het floëem exudaat verzameld.
Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 2. Setup van materialen voor floëem exsudaat verzamelenion. De setup geeft alle materialen die nodig zijn voor het protocol stappen 3.1-3.4.
Klik hier voor grotere afbeelding .

. Figuur 3 Eiwitten gevonden in floëem exsudaten van twee verschillende plantensoorten, Arabidopsis (At) en Perilla (I en NI; andere dag lengtes); MW: molecuulgewichtmerker (baan 2). Eiwitten werden gescheiden onder toepassing van een 10-20% gradiënt SDS-PAGE.
Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 4. Analysede aanwezigheid van mRNA voor Rubisco kleine en grote subeenheid (RBCs en RbCl, respectievelijk) en ubiquitine-conjugerend enzym (UBC). mRNA werd verzameld van Arabidopsis bladeren (L), bladstelen (P) en floëem exudaten (Ph), reverse getranscribeerd en specifieke transcripten gevisualiseerd middels PCR. Het cijfer werd gewijzigd van Guelette et al.. ^14.
Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 5. GC-MS profiel van floëem exsudaten voor verschillende hoeveelheid tijd. Merk op hoe de relatieve hoeveelheid sacharose verandert van 1 uur collectie (A) tot 5 uur van de collectie (B) tijd. Exsudaat profiel na collectie voor 1 uur gevolgd door "incubatie" op kamer temperatuur (RT) van vier uur (C). Blad metabolietenprofiel (D).
Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 6. Thin-layer chromatogram lipiden vergelijken van Perilla (links) en Arabidopsis (rechts) bladeren en bast afscheidingen. Sterretjes geven lipiden specifiek voor floëem uitscheidingen. DGDG: digalactosyldiacylglycerol; PG: fosfatidylglycerol; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol; Het deel van de figuur weergeven van Arabidopsis lipiden aangepast is Guelette et al. ^14..
Klik hier voor grotere afbeelding .

nt "fo: keep-together.within-page =" altijd ">
Figuur 7. Lipidenprofiel van floëem afscheidingen van Arabidopsis (chloroform fase) met behulp van LC-MS / negatieve ion-modus. Grafieken in de top (mutant A) en onder (wild-type, B) tonen de verschillen in lipidenprofielen tussen twee verschillende genotypen (aangegeven door pijlen).
Klik hier voor grotere afbeelding .

Discussie

De EDTA-gefaciliteerd collectie van floëem afscheidingen is heel simpel, moet een minimale uitrusting, en is van toepassing op de meeste planten. Kortom, deze werkwijze breidt de mogelijkheid floëem uitscheidingen analyseren van meer species. Hoewel het exsudaat wordt verdund, is het gemakkelijk om verschillende monsters of veel planten te schalen tot een grote hoeveelheid materiaal. Dit maakt vervolgens de detectie van nieuwe verbindingen die in zeer lage abundantie en anders zouden worden gezien.

Deze methode kan gebruikt worden voor verschillende plantensoorten en werkt zoals beschreven in dit manuscript opgegeven talen. Als er nieuwe soorten worden verkend, de twee aspecten die wijziging nodig zou kunnen hebben zijn het aantal bladeren gebruikt en het tijdstip van de afscheiding. In de meeste gevallen moet een uur exudaat 07:55 geschikt. Om het gebruik van deze methode voor een nieuwe plantensoorten bevestigen exsudaat moet worden verzameld en een of meer van de volgende als beschreven in protocol deel 4 needs te voeren. Afhankelijk van de intensiteit van het signaal waargenomen, kan de opvangcapaciteit moet worden opgeschaald. In het algemeen zullen lipiden en eiwitanalyse meer materiaal dan suiker en metabolietanalyse worden omdat de eerstgenoemde minder overvloedig in floëem exudaten.

Omdat EDTA gefaciliteerde exudaat verzameling omvat gesneden oppervlakken en een potentieel schadelijke effect van EDTA, diverse punten moeten worden overwogen: (1) na een uur incubatie met EDTA, de bladstelen moeten grondig worden gewassen. Dit verwijdert alle samenstellingen uit gewonde cellen alsmede de EDTA zelf, die cellen kunnen beschadigen of die de extractie. (2) Positieve en negatieve controles moeten worden opgenomen om ervoor te zorgen verkregen gegevens zijn afgeleid van floëem sap en niet die van gewonde cellen (zie hieronder kritische stappen). (3) bastweefsel sap bevat verschillende enzymen, die tijdens wondvocht collectie actief kon zijn. Vandaar dat in sommige gevallen het nuttig om voor verzamelen kanr verschillende hoeveelheden tijd. (4) Aangezien de werkwijze betrokken exudatie in water, een absolute kwantificering van de verbindingen niet mogelijk.

Kritische stappen: De sleutel tot het succesvol gebruik van deze methode is het gebruik van voorzichtigheid tijdens het hanteren van het monster aan alle cellen, alsook het gebruik van passende controles niet verwonden (zie ref ^14.). Een geschikte controle is de collectie van floëem afscheidingen zonder voorafgaande behandeling met EDTA. In dit geval zal het floëem zelf dichten en geen exsudaat kunnen worden verzameld. Elke vervuilende stoffen afkomstig van de gewonde cellen zullen hier worden gedetecteerd. Een tweede controle zou de analyse van suikers in het exsudaat zijn. In Arabidopsis, moet sucrose zijn de belangrijkste metaboliet in het floëem sap, met fructose naar sacharose verhouding van 1:04-01:08 (ref ^{8, 14).}

Voor RNA-extractie het gebruik van een RNAse inhibitor noodzakelijk. Bovendien, een positieve controle van eerder described floëem-gelokaliseerde mRNA (UBC9: Ubiquitine conjugerend enzym 9, At4g27960, ^{8, 14)} en een negatieve controle voor bijvoorbeeld een chloroplast mRNA (Rubisco LSU) te bepalen.

Omdat het exsudaat bevat actieve enzymen, is een tijdsverloop geadviseerd om zeker veranderingen in het floëem profiel te maken zijn niet alleen te wijten aan variaties in de collectie tijd. In sommige gevallen kan het nuttig zijn om proteaseremmers gebruiken. Echter, de onderzoekers moeten in gedachten houden, dat de verzamelde wondvocht zal worden geconcentreerd en dat eventuele toegevoegde verbindingen zal grotendeels worden geconcentreerd. Een tweede belangrijke stap in het protocol is de Versnijden van de bladsteel onder EDTA. Deze stap heeft een tweeledig doel: ten eerste, het verwijdert alle geasfalteerde zeef platen terwijl het voorkomen van de vorming van nieuwe pluggen waardoor voor vrije doorstroming van het floëem sap. Ten tweede, het verwijdert de cavitatie zeepbel in de houtvaten gegenereerd tijdens het snijden en dus zorgt voor xyleem vervoer. De grootte van de tweede snede afhangenTussen de planten gebruikt. In installaties met grotere bladstelen moet verscheidene millimeters (1 cm) boven het aansnijden in planten zoals Arabidopsis, 1-2 mm voldoende.

Het gebruik van deze werkwijze kan leiden tot de ontdekking van nieuwe verbindingen in floëem exsudaten die kunnen signaleren, ontwikkelings-of biomedische gevolgen. Het heeft een meer gevraagd diepgaande blik op lange afstand lipide signalering, wat een weinig onderzocht gebied was binnen de plantkunde te wijten aan het gebrek aan toegang tot het floëem.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
K2-EDTA	Sigma-Aldrich	ED2P-500G
Ondiepe glazen of plastic Petri-schaal (7-15cm)	PYREX of Corning		Elke schone, ondiepe schaal werkt
Chloroform	EMD	CX1054-1	Open alleen containers in een afzuigkap
Methanol	J.T.Baker	9070-03
Buisjes met schroefdop	VWR International	53283-800
Buisjes met schroefdop	Sun Sri	13-425
Eppendorfbuisjes	Denville	C2170