Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples

17K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51116

⸱

21 april 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department NeuroFarBa, Division of Pharmacology, University of Florence, 2Department of Clinical and Experimental Medicine, Division of Physiology, University of Florence

In dit artikel

Samenvatting

Huidige kennis over de cellulaire basis van hartziektes vertrouwt vooral op studies op diermodellen. Hier beschrijven we en validatie van een nieuwe methode om enkele levensvatbare hartspiercellen te verkrijgen van kleine chirurgische monsters van menselijk ventriculair myocard. Menselijke hartspiercellen en kan worden gebruikt voor elektrofysiologische studies en drugstesten.

Samenvatting

Hartspiercellen van zieke harten zijn onderworpen aan complexe verbouwing processen waarbij veranderingen in de celstructuur, excitatie contractie koppeling en membraan ion stromingen. Deze veranderingen zijn waarschijnlijk verantwoordelijk voor het verhoogde risico aritmogene en contractiele wijzigingen waardoor systolische en diastolische disfunctie bij hartpatiënten zijn. Echter, de meeste informatie over de wijzigingen van myocyte functie in hartziekten is afkomstig van diermodellen.

Hier beschrijven we en valideren van een protocol om levensvatbare myocytes isoleren van kleine chirurgische monsters van ventriculaire myocardium van patiënten die een hartoperatie operaties. Het protocol wordt beschreven. Elektrofysiologische en intracellulair calcium metingen worden gerapporteerd aan de haalbaarheid van een enkele cel metingen in humane ventriculaire cardiomyocyten verkregen met deze werkwijze tonen.

Het protocol meldde hijre kan nuttig zijn voor toekomstige onderzoeken van de cellulaire en moleculaire basis van functionele veranderingen van het menselijke hart in de aanwezigheid van verschillende hartziekten zijn. Verder kan deze methode worden gebruikt om nieuwe therapeutische targets op cellulair niveau te identificeren en de effectiviteit van nieuwe verbindingen te testen op menselijke cardiomyocyten, directe translationele waarde.

Inleiding

Dissectie van de elektrofysiologische eigenschappen van het myocard heeft na de ontwikkeling van technieken voor enkele hartspiercel isolatie aanzienlijk gevorderd. Recente ontwikkelingen in het begrijpen van cardiale Excitatie contractiekoppeling (EG-koppeling) zijn ook mogelijk gemaakt door het vermogen isoleren levensvatbare enkele cardiomyocyten dat alle fysiologische eigenschappen van het intacte weefsel behouden. Patch clamp methoden worden routinematig gebruikt om de functie en farmacologische modulatie van cardiale sarcolemmale ionstromen bestuderen. Opnamen van intracellulair calcium dynamiek Ca2 + gevoelige kleurstoffen worden regelmatig uitgevoerd in enige cardiale myocyten uit verschillende gezonde en zieke modellen, waarbij het ​​belangrijke gegevens over de fysiologie van EG-koppeling en op de pathologische veranderingen van intracellulaire Ca2 + homeostase leidt tot mechanische stoornissen en verhoogde aritmogeen lasten op hartziekten. Informatie van deze studies is cruciaal voor het begrijpen van de elektrofysiologische en mechanische effecten van geneesmiddelen in de klinische setting. Er zijn soortspecifieke verschillen in de transmembraan stromen en de EG-koppeling eiwitten die verantwoordelijk zijn voor specifieke kenmerken van cardiale actiepotentiaal en cardiale mechanica. Dus, terwijl studies van myocytes geïsoleerd van niet-menselijke zoogdieren de biofysische eigenschappen en fysiologische rol van specifieke transmembraan ionkanalen en EG-Koppeling eiwitten hebben opgehelderd, zij niet noodzakelijkerwijs relevante modellen van menselijke hartspiercellen. Isolatie van levensvatbare myocytes van menselijke hartspier is daarom essentieel om volledig te begrijpen van de pathofysiologie van hart-en vaatziekten en valideren van nieuwe therapeutische benaderingen.

Menselijke atriaal weefsel beschikbaar atriale aanhangsels vaak tijdens chirurgische procedures worden verwijderd. Initiële kwantitatieve studies van volwassen menselijke cardiale actiepotentialen en ionische currents werkzaam enzymatisch geïsoleerde atriale cellen 1-4. Opnames van actiepotentialen of stromen van geïsoleerde menselijke ventriculaire cellen volwassen zijn vervolgens gerapporteerd 3,5-10. De meeste van deze studies gebruikte cellen verkregen uit geëxplanteerde harten en gebruikt hetzij collagenase perfusie van een kransslagader segment of blootstelling van relatief grote hoeveelheden weggesneden weefsel collagenase geïsoleerde cellen te verkrijgen. Deze studies kon een gedetailleerde karakterisering van een aantal transmembraan ionstromen van humane ventriculaire cardiomyocyten van gezonde hart en patiënten met terminale hartfalen. Opnamen van L-type Ca2 + (I Ca-L) 5-7, voorbijgaande buitenwaartse kaliumstroom (I) 8 binnenwaartse kaliumstroom (I κ1) 8, de verschillende componenten van vertraagde gelijkrichter kalium (I κ ) 9 gemeld. Voorschotten en raffinage vande isolatie procedure 10, kon een duidelijk karakterisering van de ionische basis van de toegenomen arrhythmogenic potentieel in terminal hartfalen, bestaande uit actiepotentiaal verlenging 11, vertraagd na depolarisaties 12 en verhoogde grappige huidige 13 leidt tot diastolische depolarisatie en premature slagen.

Volwassen hartspiercellen gewoonlijk geïsoleerd uit kleine dieren door retrograde perfusie van het gehele hart met verschillende enzymmengsel een techniek die hoge opbrengsten van Ca 2 +-tolerante cellen 14 produceert. Isolatie van cardiale myocyten van fragmenten van weefsel inherent minder succesvol waarschijnlijk vanwege de beperkte toegankelijkheid van enzymen individuele myocyten vergeleken met die bereikt door perfusie van kransslagaders. Vanwege de beperkte beschikbaarheid van ongebruikte donorharten, de enige praktische manier om normale humane ventriculaire cellen te verkrijgen regelmatig is door enzymatische spijn van de vaak zeer kleine weefselfragmenten weggesneden tijdens electieve chirurgische procedures. De enige menselijke ziektemodel die grondig gekarakteriseerd op celniveau terminaal hartfalen, vanwege de toegankelijkheid van getransplanteerde harten. Echter, terminal hartfalen optreedt in een minderheid van de patiënten vaak gaat om een gemeenschappelijke route van ernstige herinrichting van myocardiale cellen, die relatief onafhankelijk van de onderliggende oorzaak 15. De mogelijkheid om de functie van afzonderlijke hartspiercellen uit beoordelen patiënten eerder niet falende stadium van de ziekte is cruciaal voor de specifieke pathofysiologie van verschillende erfelijke of verworven aandoeningen begrijpen. Hypertrofische cardiomyopathie (HCM) is een sprekend voorbeeld. HCM is een gemeenschappelijke (1/500 personen) erfelijke cardiale aandoening gekenmerkt door hypertrofie van het hart, verhoogde arrhythmogenic risico en contractiele veranderingen als gevolg van obstructie van de uitstroom en diastolische dysfunctie 16. Hartspiercellen van HCM harten undergo een complexe verbouwing processen die veranderingen in celstructuur (hypertrofie, myofibrillar wanorde) en EG-Koppeling 17. Echter, de meeste informatie van myocyte disfunctie bij HCM is afkomstig van transgene diermodellen. Aangezien slechts een minderheid van de HCM patiënten evolueert in de richting van terminal hartfalen en vereist harttransplantatie, HCM harten zijn zeer zelden beschikbaar voor celisolatie met standaard methoden. Echter, ten minste 30% van de HCM patiënten ontwikkelen obstructieve symptomen als gevolg van massale septum hypertrofie veranderen uitstroombaan bloedstroom tijdens systole (HCM) 18. De meest effectieve beschikbare therapeutische optie voor de verlichting van de obstructie in HCM is chirurgische septum myectomy: tijdens deze chirurgische procedure wordt een variabele grootte deel van de bovenste septum verwijderd door trans aorta aanpak. Dit gedeelte van hypertrofe septum is dus beschikbaar voor celisolatie uit de verse weefsel.

Werkwijze voor de isolatie van menselijke ventricular myocytes van enkele, kleine transvenous endomyocardiale biopsiespecimens eerder is ontwikkeld en gepubliceerd 19. We hebben een methode om enkele septum myocytes isoleren van ventriculaire myocard monsters van patiënten die hartchirurgie ondergaan, waaronder patiënten met HCM ondergaan septum myectomy en patiënten die een klepvervanging procedures. Naast een gedetailleerde beschrijving van de isolatieprotocol representatief elektrofysiologische en Ca2 + fluorescentiemetingen worden, dat de levensvatbaarheid van de geïsoleerde humane ventriculaire myocyten en de haalbaarheid van patch clamp en intracellulaire Ca2 + onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De experimentele protocollen op menselijk weefsel werden goedgekeurd door de ethische commissie van Careggi Universitair Ziekenhuis (2006/0024713; vernieuwd mei 2009). Elke patiënt gaf schriftelijk toestemming.

1. Solutions en apparatuur voorbereiding

Oplossingen worden beschreven in Tabel 1. Een vereenvoudigd stroomschema van de cel isolatieprocedure wordt in Figuur 1.

Oplossing CP DB KB TB PS EB1 EB2
Reagens (mM) KH 2 PO 4 50
MgSO4 8 1.2 5 1.2 1.2
HEPES 10 10 10
adenosine 5
glucose 140 10 20 10 10 10
mannitol 100
taurine 10 20 5 20 20
NaCl 113 136 113 113
KCl 4.7 85 5.4 25 4.7 4.7
MgCl2 1.2 5
KH 2 PO 4 0.6 30 0.6 0.6
Na 2 HPO 4 0.6 0.6 0.6
NaHCO3 12 12 12
KHCO3 10 10 10
Na-pyruvaat 4 4 4
BDM 10 10 10
BHBA 5
barnsteenzuur 5
EGTA 0.5
K 2-ATP 2
pyrodruivenzuur 5
creatine 5
KMES 115
Enzymen (U / ml) Collagenase Type V 250 250
Protease Type XXIV 4
pH 7.4 KOH 7,3 NaOH 7.1 KOH 7.35 NaOH 7.2 KOH 7,3 NaOH 7,3 NaOH

. Tabel 1 Solutions gebruikt voor het verzamelen van monsters, celisolatie en functionele karakterisering van myocytes CP = cardioplegische oplossing.; DB = dissociatie buffer; KB = Kraft-Bruhe oplossing; TB = Tyrode buffer; PS = pipet oplossing; EB1 = enzymbuffer 1; EB2 = enzymbuffer 2.

  1. Bereid cardioplegische (CP) oplossing. CP oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende 1 week.
  2. Bereid Ca 2 + gratis dissociatie buffer (DB). Deze oplossing moet worden gebruikt binnen de dag.
  3. Bereid Kraft-Bruhe (KB)-oplossing. KB oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende 1 week.
  4. Bereid Ca 2 + gratis Tyrode buffer (TB). Deze oplossing moet worden gebruikt binnen de dag.
  5. Filter alle oplossingen met behulp van spuit filters voor gebruik.
  6. Bereid de spijsvertering (figuur 2), een schrapend bakken van twee tegenover elkaar liggende borstels van siliconenelastomeer, waarvan geroteerd door een elektromotor. De spijsvertering apparaat wordt op maat gemaakt. Details over de vertering apparaat zijn in figuur 8; beelden van de inrichting in fig. 2C en 2D. Was de weefselkamer met 70% ethanol en water.

2. Verzamelen en verwerken van myocard Monsters

  1. Giet 40 ml cardiplegic (CP) oplossing in een 50 ml buis en op te slaan in ijs voor specimen vervoer van het operatieve kamer naar de celisolatie lab.
  2. Verzamel de ventriculaire myocard exemplaar uit de operatieve kamer onmiddellijk na excisie, wassen met ijskoudCP-oplossing en bewaar het in de buis. Gebruik endocardiale exemplaren uitgesneden uit de bovenste inter ventriculaire septum tijdens open hart operatie, gewicht> 100 mg.
  3. Snel het monster over te brengen naar het lab gebied; binnen 10 min van specimen excisie beginnen specimen verwerking.
  4. Terwijl het model in ijskoud CP buffer, verwijder voorzichtig de endocardiale fibrotische laag met behulp van fijne schaar onder een stereomicroscoop; daarna, snijd het myocardium in kleine stukjes (2-3 mm lang). Afhankelijk van weefsel steekproefgrootte, snijd een totaal bedrag van ventriculaire myocard tussen 100 mg en 1 g per isolement.
  5. Na voltooiing van weefsel hakken, breng het myocard brokken in de vertering apparaat, met schone ijskoude CP oplossing. Vermijd vullen het gehele volume tussen de twee silicium borstels (3-4 ml) met myocardiale brokken, met niet meer dan 1 g totaal weefsel.

3. Wassen en Spijsvertering van myocard Brokken

  1. Achteruiter de brokken worden overgebracht naar het schrapen kamer van de spijsvertering apparaat, wijzigt de CP buffer in de kamer met koud Ca 2 +-vrij dissociatie buffer (DB).
  2. Plaats de vertering inrichting in een thermostatisch bad, zodat de kamer tot in contact met het verwarmde water in het bad (figuur 1). Zet het bad tot 37,5 ° C en zet hem aan, om langzaam de temperatuur van het weefsel kamer. Zet de motor van de vertering inrichting, waarin de rotatiesnelheid 1 omwenteling / seconde.
  3. Voer 3 wasbeurten met DB, het veranderen van de oplossing in de kamer met schone DB om de 8 minuten. Het DB wordt verwarmd (37 ° C) en zuurstof verzadigd voordat je in contact met het myocard brokken.
  4. Bereid enzymbuffer 1 (EB1) door het toevoegen van 250 U / ml Collagenase Type V en 4 U / ml protease Type XXIV DB oplossing. Bereid enzymbuffer 2 (EB2) door het toevoegen van 250 E / ml Collagenase Type V DB oplossing. Warming-up (37 ° C) en oxygenate EB1 en EB2.
  5. Voer twee cycli van 12 minuten digestie in de roterende inrichting digestie met 100% zuurstof EB1 (bij 37 ° C). Bij elke cyclus gebruikt ~ 3 ml EB1. Verwijder de oplossing met een pipet aspiratie en gooi deze na elke cyclus.
  6. Bereid 6 15 ml buizen voor celinzameling en ~ 80 ml koude (4 ° C) oplossing KB elueren de buffers.
  7. Voer een eerste 15 minuten digestie-cyclus met 3 ml 100% zuurstof EB2 bij 37 ° C. Na de digestie-cyclus, verzamel de oplossing die de eerste gedissocieerd myocyten in een 15 ml buis en de celsuspensie verdund met 12 ml koude oplossing KB. Bewaar de buis plat bij kamertemperatuur.
  8. Verdun de resterende EB2 oplossing met een gelijke hoeveelheid DB om de concentratie van collagenase V halveren de volgende digestie cycli.
  9. Voer andere 5 12 minuten digestie cycli met 3 ml EB2 bij 37 ° C; na elk van hen verzamelen van myocyte met buffer in een 15 ml conische buis enverdunnen met 12 ml KB oplossing. Bewaar de 6 cel met buizen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.

4. Cell Resuspension en Ca 2 + Revalidatie

  1. Voeg 1 mg / ml runderserumalbumine (BSA) tot 20 ml Ca2 +-vrije Tyrode buffer (TB). Filtreer de oplossing.
  2. Centrifugeer de zes myocyte met conische buizen bij 100 xg gedurende 5 minuten te myocytes te vestigen dwingen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in elke buis met een variabele hoeveelheid (1-3 ml, afhankelijk van de opbrengst) van BSA met TB bij kamertemperatuur.
  3. Verhoog geleidelijk Ca 2 +-concentratie in de cel met buffer door het toevoegen van kleine hoeveelheden van 100 mmol / L CaCl2 oplossing. In de eerste en tweede stap Ca2 +-concentratie wordt verhoogd tot 50 umol / L en 100 umol / L respectievelijk. De volgende Ca2 + toevoeging stappen worden uitgevoerd om de 5 min en de concentratie wordt verhoogd met 100 umol / L bij elke stap to een eindconcentratie van 0,9 mmol / L.
  4. Beoordelen van de opbrengst van de isolatie procedure. Transfer 0,5 ml myocyte bevattende oplossing op het glas onderste kamer van een microscoop. Evalueer 15 microscoopvelden 10x objectiefvergroting en berekent het percentage gezonde myocyten (bijvoorbeeld staafvormige cellen met heldere strepen en geen significante insluitsels, figuur 2). De verwachte opbrengst is rond de 20%.

5. Functionele Evaluatie van Geïsoleerde Cardiomyocytes.

Het volgende protocol is een voorbeeld van de menselijke cardiomyocyte functieonderzoek, waaronder simultane opnames van actiepotentialen en intracellulaire Ca 2 + fluxen.

  1. Bereid pipetoplossing (PS) voor patch clamp experimenten in geperforeerde patch configuratie. De oplossing kan worden bewaard bij -20 ° C maximaal 3 maanden.
  2. Voeg 1,8 mmol / L CaCl2 om Ca 2 +-vrij Tyrode buffer (TB). Use deze oplossing voor superfusie van hartspiercellen tijdens patch clamp / fluorescentie experimenten.
  3. Breng 1 ml celsuspensie om een ​​1,5 ml buis en voeg 10 micromol / l Fluoforte en 10 ul Powerload Concentrate. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Daarna stelt u de buis in verticale positie en laat de cel te regelen voor 5 min; resuspendeer de cellen in Ca 2 + met TB.
  4. Breng 0,25 ml celsuspensie met een kleine (0,5 ml), geïsoleerde microscoop gemonteerd opname kamer, superfused door zwaartekracht met een verwarmd microperfusor systeem met een stroomsnelheid van 0,3 ml / min (temperatuur: 37 ± 0,5 ° C).
  5. Met een micropipet trekker, bereid patch clamp pipetten met een tip diameter van 3 tot 5 urn en een weerstand van 3-4,5 M gevuld met PS.
  6. Voeg amfotericine B een partij PS (250 ug / ml) en gebruiken om de elektroden te vullen.
  7. Selecteer een staafvormige cel met duidelijke strepen, verstoken van insluitsels, form de giga afdichting en wacht 5 tot 10 minuten, totdat de toegang weerstand lager is dan 20 MQ.
  8. Ontlokken actiepotentialen in stroomtang modus met behulp van korte pulsen (<3 msec) bij verschillende frequenties van de stimulatie (0,2 Hz, 0,5 Hz en 1 Hz, 1 min bij elke frequentie). Tijdens de opname fase, zet helder veld verlichting bij 492 ± 3 nm en detecteren Fluoforte fluorescentie bij 505-520 nm. Verwerven fluorescentie en membraanpotentiaal signalen met behulp Digidata 1440A en PClamp 10,0 software. Herhaal de opname sequentie meerdere malen als nodig; echter, houdt de totale opnametijd minder dan 15 min voor elke cel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De hierboven beschreven werkwijze werd gebruikt om de functionele abnormaliteiten cardiomyocyten geïsoleerd uit het septum patiënten met hypertrofische cardiomyopathie (HCM) die myectomy operatie ondergingen kenmerken, vergeleken met niet niet niet hypertrofische chirurgische patiënten 21. De resultaten in dit deel zijn afgeleid van dat werk 21 en worden hier getoond als een voorbeeld van hoe deze techniek gebruikt kan worden om de veranderingen in myocardiale celfunctie cardiale aandoeningen karak...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Wij hebben beschreven en gevalideerde werkwijze levensvatbare myocyten isoleren van chirurgische monsters van menselijk ventriculair myocard. Vanaf eerder beschreven protocollen die met succes had gebruikt om geïsoleerde cellen van atriale chirurgische monsters, de techniek om de scheiding van enkele levensvatbare myocytes van zieke ventriculaire myocard werd ontwikkeld en verfijnd. Vroege rapporten bleek dat isolatie van enkele hartspiercellen uit brokken van atriale en ventriculaire weefsel selectief verminderde repol...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de EU (STREP Project 241577 "GROOT HART," 7de Europese Kaderprogramma, CP), Menarini International Operations Luxembourg (AM), Telethon GGP07133 (CP) en Gilead Sciences (AM).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Kaliumfosfaat monobasisch (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791
Magnesiumsulfaat heptahydraat(MgSO4*7H2O)Sigma-AldrichM1880
HEPESSigma-AldrichH3375
AdenosineSigma-AldrichA9251
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270
MannitolSigma-AldrichM4125
TaurineSigma-AldrichT0625
Kaliumhydroxide (KOH)Sigma-AldrichP5958
Natriumchloride (NaCl)Sigma-AldrichS7653
Kaliumchloride (KCl)Sigma-AldrichP9333
Natriumfosfaat dibasisch (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907
Natriumbicarbonaat (NaHCO3)Sigma-AldrichS6297
Kaliumbicarbonaat (KHCO3)Sigma-Aldrich237205
NatriumpyruvaatSigma-AldrichP2256
2,3-Butanedioon monoximeSigma-AldrichB0753
Natriumhydroxide(NaOH)Sigma-AldrichS8045
L-Glutaminzuur monokaliumzout monohydraatSigma-Aldrich49601
PyruwzuurSigma-Aldrich107360
3-HydroxyboterzuurSigma-Aldrich166898
Adenosine 5′-trifosfaat dikaliumzout dihydraat (K2-ATP)Sigma-AldrichA8937
CreatineSigma-AldrichC0780
BernsteenzuurSigma-AldrichS3674
Ethyleenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraazijnzuur (EGTA)Sigma-AldrichE0396
Albumine uit runder serumSigma-AldrichA0281
Magnesiumchloride (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
Collageenase uit Clostridium histolyticum, Type VSigma-AldrichC9263
Proteinase, Bacterieel, Type XXIVSigma-AldrichP8038
Calciumchloride oplossing, ~1 M in H2OSigma-Aldrich

Referenties

  1. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue. Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).
  2. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells. Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).
  3. Harding, S. E., et al. Species dependence of contraction velocity in single isolated cardiac myocytes. Cardioscience. 1, 49-53 (1990).
  4. Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Canadian Medical Association Journal. 126, 791-793 (1982).
  5. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Characteristics of calcium-current in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 23, 929-937 (1991).
  6. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  7. Cohen, N. M., Lederer, W. J. Calcium current in single human cardiac myocytes. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 4, 422-437 (1993).
  8. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation Research. 73, 379-385 (1993).
  9. Virag, L., et al. The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes. Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).
  10. Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. A. Isolation of human ventricular and atrial cardiomyocytes: technical note. Cardioscience. 4, 111-116 (1993).
  11. Benitah, J. P., et al. Slow inward current in single cells isolated from adult human ventricles. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 421, 176-187 (1992).
  12. Verkerk, A. O., et al. Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts. Circulation. 104, 2728-2733 (2001).
  13. Cerbai, E., et al. Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart. Circulation. 95, 568-571 (1997).
  14. Kohncke, C., et al. Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
  15. Tomaselli, G. F., Marban, E. Electrophysiological remodeling in hypertrophy and heart failure. Cardiovascular Research. 42, 270-283 (1999).
  16. Maron, B. J. Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 287, 1308-1320 (2002).
  17. Olivotto, I., et al. The many faces of hypertrophic cardiomyopathy: from developmental biology to clinical practice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 349-367 (2009).
  18. Maron, M. S., et al. Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction. Circulation. 114, 2232-2239 (2006).
  19. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  20. Lippiat, J. D. Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique. Methods Mol Biol. 491, 141-149 (2008).
  21. Coppini, R., et al. Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 127, 575-584 (2013).
  22. Kuusisto, J., et al. Low-grade inflammation and the phenotypic expression of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. Heart. 98, 1007-1013 (2012).
  23. Yan, G. X., et al. Phase 2 early afterdepolarization as a trigger of polymorphic ventricular tachycardia in acquired long-QT syndrome : direct evidence from intracellular recordings in the intact left ventricular wall. Circulation. 103, 2851-2856 (2001).
  24. Yue, L., Feng, J., Li, G. R., Nattel, S. Transient outward and delayed rectifier currents in canine atrium: properties and role of isolation methods. The American Journal of Physiology. 270, 2157-2168 (1996).
  25. Li, G. R., Feng, J., Yue, L., Carrier, M., Nattel, S. Evidence for two components of delayed rectifier K+ current in human ventricular myocytes. Circulation research. 78, 689-696 (1996).
  26. Viswanathan, P. C., Shaw, R. M., Rudy, Y. Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study. Circulation. 99, 2466-2474 (1999).
  27. Volders, P. G., et al. Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation. Circulation. 107, 2753-2760 (2003).
  28. Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action. Circulation Research. 68, 77-84 (1991).
  29. Coppini, R., et al. A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine. Circulation. 125, 1(2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Isolatie van cardiomyocytenventriculair myocardenzymatische digestiepatchclamp-registratieactiepotentiaalmetingcalciumtransiëntanalysecardioplegische oplossingstromale vasculaire fractiecelsuspensie
Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.