Method Article

Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples

DOI:

10.3791/51116

⸱

April 21st, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department NeuroFarBa, Division of Pharmacology, University of Florence, 2Department of Clinical and Experimental Medicine, Division of Physiology, University of Florence

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Huidige kennis over de cellulaire basis van hartziektes vertrouwt vooral op studies op diermodellen. Hier beschrijven we en validatie van een nieuwe methode om enkele levensvatbare hartspiercellen te verkrijgen van kleine chirurgische monsters van menselijk ventriculair myocard. Menselijke hartspiercellen en kan worden gebruikt voor elektrofysiologische studies en drugstesten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hartspiercellen van zieke harten zijn onderworpen aan complexe verbouwing processen waarbij veranderingen in de celstructuur, excitatie contractie koppeling en membraan ion stromingen. Deze veranderingen zijn waarschijnlijk verantwoordelijk voor het verhoogde risico aritmogene en contractiele wijzigingen waardoor systolische en diastolische disfunctie bij hartpatiënten zijn. Echter, de meeste informatie over de wijzigingen van myocyte functie in hartziekten is afkomstig van diermodellen.

Hier beschrijven we en valideren van een protocol om levensvatbare myocytes isoleren van kleine chirurgische monsters van ventriculaire myocardium van patiënten die een hartoperatie operaties. Het protocol wordt beschreven. Elektrofysiologische en intracellulair calcium metingen worden gerapporteerd aan de haalbaarheid van een enkele cel metingen in humane ventriculaire cardiomyocyten verkregen met deze werkwijze tonen.

Het protocol meldde hijre kan nuttig zijn voor toekomstige onderzoeken van de cellulaire en moleculaire basis van functionele veranderingen van het menselijke hart in de aanwezigheid van verschillende hartziekten zijn. Verder kan deze methode worden gebruikt om nieuwe therapeutische targets op cellulair niveau te identificeren en de effectiviteit van nieuwe verbindingen te testen op menselijke cardiomyocyten, directe translationele waarde.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dissectie van de elektrofysiologische eigenschappen van het myocard heeft na de ontwikkeling van technieken voor enkele hartspiercel isolatie aanzienlijk gevorderd. Recente ontwikkelingen in het begrijpen van cardiale Excitatie contractiekoppeling (EG-koppeling) zijn ook mogelijk gemaakt door het vermogen isoleren levensvatbare enkele cardiomyocyten dat alle fysiologische eigenschappen van het intacte weefsel behouden. Patch clamp methoden worden routinematig gebruikt om de functie en farmacologische modulatie van cardiale sarcolemmale ionstromen bestuderen. Opnamen van intracellulair calcium dynamiek Ca2 + gevoelige kleurstoffen worden regelmatig uitgevoe....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De experimentele protocollen op menselijk weefsel werden goedgekeurd door de ethische commissie van Careggi Universitair Ziekenhuis (2006/0024713; vernieuwd mei 2009). Elke patiënt gaf schriftelijk toestemming.

1. Solutions en apparatuur voorbereiding

Oplossingen worden beschreven in Tabel 1. Een vereenvoudigd stroomschema van de cel isolatieprocedure wordt in Figuur 1.

Oplossing CP DB KB TB PS EB1 EB2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hierboven beschreven werkwijze werd gebruikt om de functionele abnormaliteiten cardiomyocyten geïsoleerd uit het septum patiënten met hypertrofische cardiomyopathie (HCM) die myectomy operatie ondergingen kenmerken, vergeleken met niet niet niet hypertrofische chirurgische patiënten 21. De resultaten in dit deel zijn afgeleid van dat werk 21 en worden hier getoond als een voorbeeld van hoe deze techniek gebruikt kan worden om de veranderingen in myocardiale celfunctie cardiale aandoeningen karak.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij hebben beschreven en gevalideerde werkwijze levensvatbare myocyten isoleren van chirurgische monsters van menselijk ventriculair myocard. Vanaf eerder beschreven protocollen die met succes had gebruikt om geïsoleerde cellen van atriale chirurgische monsters, de techniek om de scheiding van enkele levensvatbare myocytes van zieke ventriculaire myocard werd ontwikkeld en verfijnd. Vroege rapporten bleek dat isolatie van enkele hartspiercellen uit brokken van atriale en ventriculaire weefsel selectief verminderde repol.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de EU (STREP Project 241577 "GROOT HART," 7de Europese Kaderprogramma, CP), Menarini International Operations Luxembourg (AM), Telethon GGP07133 (CP) en Gilead Sciences (AM).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O)Sigma-AldrichM1880
HEPESSigma-AldrichH3375
AdenosineSigma-AldrichA9251
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270
MannitolSigma-AldrichM4125
TaurineSigma-AldrichT0625
Potassium hydroxide (KOH)Sigma-AldrichP5958
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS7653
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3)Sigma-AldrichS6297
Potassium bicarbonate (KHCO3)Sigma-Aldrich237205
Sodium pyruvateSigma-AldrichP2256
2,3-Butanedione monoximeSigma-AldrichB0753
Sodium hydroxide(NaOH)Sigma-AldrichS8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrateSigma-Aldrich49601
Pyruvic acidSigma-Aldrich107360
3-Hydroxybutyric acidSigma-Aldrich166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)Sigma-AldrichA8937
CreatineSigma-AldrichC0780
Succinic AcidSigma-AldrichS3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)Sigma-AldrichE0396
Albumin from bovine serumSigma-AldrichA0281
Magnesium chloride (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type VSigma-AldrichC9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIVSigma-AldrichP8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2OSigma-Aldrich21115
Calcium chloride 0.1 M solutionSigma-Aldrich53704
Potassium methanesulfonateSigma-Aldrich83000
FluoForte ReagentEnzo Life SciencesENZ-52015
Powerload concentrate, 100XLife TechnologiesP10020
Perfusion Fast-Step SystemWarner InstrumentsVC-77SP
Amphotericin B solubilizedSigma-AldrichA9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifierMolecular Devices
Digidata 1440AMolecular Devices
pClamp10.0 Molecular Devices
Digestion DeviceCUSTOMCUSTOMThe device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested.
Silicone elastomer for the digestion device's brushesDow CorningSYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion deviceCrouzetCrouzet 178-4765
Mold for brushes castingN.A.N.A.The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue. Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).
  2. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Iso....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Ventricular CardiomyocytesCardiomyocyte IsolationVentricular MyocardiumEnzymatic DigestionPatch Clamp RecordingAction Potential MeasurementCalcium Transient AnalysisCardioplegic SolutionStromal Vascular FractionCell Suspension

Related Articles