Differentiële Labeling van Cell-oppervlak en Internalized Eiwitten na Antibody Voeden van Levende gekweekte neuronen

Summary

We beschrijven een methode om eiwit label op het oppervlak van levende neuronen met een specifiek polyklonaal antilichaam tegen extracellulaire epitopen. Eiwit door het antilichaam gebonden op het celoppervlak en vervolgens geïnternaliseerd via endocytose kunnen worden onderscheiden van eiwitten nog op of verhandeld bij het oppervlak tijdens de incubatie.

Abstract

Om het celoppervlak lokalisatie van een vermoedelijke transmembraan receptor in gekweekte neuronen demonstreren we de gemerkte eiwit op het oppervlak van levende neuronen met een specifiek primair antilichaam opgewekt tegen een extracellulair gedeelte van het eiwit. Aangezien receptoren worden verhandeld en naar de oppervlakte, wanneer cellen permeabel na fixatie dan zowel celoppervlak en interne eiwit wordt gedetecteerd door dezelfde gelabelde secundaire antilichaam. Hier passen wij een methode om eiwittransport ("antilichaam feeding") bestuderen labelen eiwit dat werd geïnternaliseerd door endocytose in de antilichaam incubatiestap en eiwitten die zijn gebleven op het celoppervlak of werd verhandeld aan het oppervlak tijdens deze periode differentieel . De mogelijkheid om deze twee zwembaden van eiwit te onderscheiden werd mogelijk gemaakt door de integratie van een overnachting blokkering stap met sterk geconcentreerde ongelabelde secundair antilichaam na een eerste broen van unpermeabilized neuronen met een fluorescent gelabelde secundaire antilichaam. Na de blokkeringsstap, permeabilisatie van de neuronen toegestane detectie van de geïnternaliseerde zwembad met een fluorescent gelabeld secundair antilichaam met een andere fluorofoor. Met deze techniek konden we belangrijke informaties subcellulaire locatie van dit vermeende receptor verkrijgen, onthullen dat het inderdaad verhandeld het celoppervlak in neuronen. Deze techniek is breed toepasbaar op verschillende celtypes en cel-oppervlakte-eiwitten, die een passend antilichaam aan een extracellulair epitoop beschikbaar.

Introduction

Bij het ​​vaststellen van de functie van nieuw geïdentificeerde eiwitten, kan onderzoek naar de subcellulaire lokalisatie van en handel van het eiwit in kwestie belangrijke aanwijzingen over de mogelijke rol / s van het eiwit ^1,2 bieden. Bioinformatica analyse van de transcriptome van de zich ontwikkelende neocortex ³ gaf ons een lijst van genen veranderde expressie vertonen in de hersenen van muizen corticogenesis. Vervolgens heeft een knockout benadering vast te stellen dat het eiwit gecodeerd door een van deze genen, sez6, heeft een belangrijke rol in neuron ontwikkeling. We zagen dat de beslaglegging gerelateerde gen 6 of Sez6, eiwit in de ontwikkeling dendrieten en is ook aanwezig in dendritische gespecialiseerde structuren dendrieten ontvangt en integreert prikkelende signalen. Bovendien, wanneer dit eiwit ontbreekt, dendrieten en exciterende synapsen niet goed ⁴ vormen. De waarschijnlijke overheersende isovorm van het eiwit kenmerken van een transmembrane receptor hoewel, wanneer de subcellulaire verdeling van immunologisch eiwit werd onderzocht door confocale microscopie of immuno-elektronenmicroscopie meeste, zo niet alle, van het signaal bleek geassocieerd met kleine blaasjes in het somatodendritische compartiment met weinig of geen eiwit, dat op de plasmamembraan aan het celoppervlak.

Om definitief te tonen dat dit vermeende receptor met een voorspeld extracellulair domein groot is verhandeld naar de plasmamembraan, we levende cellen benadering vastgesteld middels het antiserum we hadden gegenereerd aan een extracellulaire deel van het eiwit aan eiwit label op het celoppervlak. Door deze "antilichaam feeding" benadering twee toepassingen van differentieel-gelabelde secundaire antilichaam gescheiden door een uitgebreide blokkering stap en permeabilisatie stap konden we twee verschillende pools van eiwit onderscheidt identificeren door binding aan fluorescent gelabelde secundaire antilichamen onderdelen verschillende tlent tags. Zo konden wij eiwit dat werd geïnternaliseerd door endocytose in het antilichaam incubatiestap uit eiwitten die zijn gebleven op het celoppervlak of werd verhandeld aan het oppervlak tijdens deze periode onderscheiden. Met deze methode, hebben we vastgesteld dat het eiwit van belang wordt verhandeld en naar het celoppervlak in neuronen. Daarom deze relatief snelle en eenvoudige techniek bleek informatiever dan traditionele methoden immunocytochemie of pre-embedding immunogoud elektronenmicroscopie, hoewel we gebruikten dezelfde konijnen polyklonaal antiserum voor al deze technieken. Deze techniek is algemeen toepasbaar op elke transmembraan eiwit bood een goede antilichaam dat extracellulair domein epitopen beschikbaar. De techniek is al eerder gebruikt om receptor handel van de glutamaat receptor subeenheid GluR1 ⁵ bestuderen.

Protocol

1. Gedissocieerde Hippocampale Neuron Cultuur

1. Bereid dekglaasjes (borosilicaatglas):
   1. Was in 100% ethanol.
   2. Droging onder UV-bestraling.
   3. Coat met Poly-D-lysine (0,5 mg / ml in 0,15 M boraatbuffer, overnacht bij 4 ° C).
   4. Op de volgende dag (dag van cultuur) Was 3x in PBS smeer met laminine (2,5 ug / ml, natuurlijke muis laminine) + 5% v / v warmte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS) verdund in PBS gedurende 2 uur bij 37 ° C.
2. Ontleden embryonale dag 18 (E18) hippocampus rat en verzamelen in PBS met calcium en magnesium, gekoeld op ijs. OPMERKING: alle experimentele protocols waarbij dieren werden goedgekeurd door de Dier Ethische Commissie van de Universiteit van Melbourne.
3. Bereid de papaïne en DNase I oplossingen van de papaïne Dissociatie Kit volgens de instructies van de fabrikant.
   1. Voeg 50 ul DNase I oplossing 1 ml papaïne oplossing.
   2. OPMERKING: Zodraeerst bereid, kan de oplossing papaïne en DNase I oplossingen afzonderlijk afgegeven in porties (0,5 ml en 25 pi aliquots van papaïne en DNase I, respectievelijk) en bewaard bij -20 ° C totdat het nodig is.
4. Verwijder zoveel mogelijk PBS en incubeer hippocampus (ve nest embryo) met 1 ml papaïne / DNase I oplossing bij 37 ° C gedurende 15-20 minuten. Tik zachtjes tegen de buis om de inhoud tijdens de incubatieperiode twee keer mengen.
5. Vermaal de hippocampus weefsel voorzichtig (vermijden van de belletjes) met een vlam-gepolijste gesiliconiseerde Pasteur pipet 10-15x tot cel dispersie wordt verkregen en weinig of geen stukjes gedissocieerde weefsel blijft.
6. Layer zorgvuldig de gedissocieerde celsuspensie over een 3 ml-kussen van 4% w / v bovine serum albumine (BSA) in Hanks Balanced Salt Solution plus additieven (HBSS ^+; zie paragraaf 1.6.1).
   1. Bereid deze stapgradiënt oplossing door het oplossen van de BSA bij kamertemperatuur zonder roerring in HBSS bevattende 2 mM _CaCl2, 1 mM MgSO _4, 4 mM NaHCO ₃ en 40 mM glucose (HBSS ⁺⁾ vervolgens steriel filter en bewaar bij 4 ° C.
7. Centrifuge, 100 xg, 7 min in een bench top centrifuge met een swing-out rotor.
8. Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig de cel pellet niet te aspireren.
9. Resuspendeer de gepelleteerde cellen voorzichtig met een vlam gepolijst (gesiliconiseerd) Pasteur pipet (of 1 ml blauwe pipetpunt) in 1 ml compleet Neurobasal medium (met 2% B27, 0,5 mM L-glutamine aangevuld met 1% FCS).
10. Count twee 10 pl porties behulp van een hemocytometer (NB tellen alleen fase-heldere cellen als 'live' cellen).
11. Plate primaire neuronen op preprepared gecoat glas dekglaasjes (0.75-1 x 10 ^5/18 mm dekglaasje in 12-well plaat). Onmiddellijk vóór plateren, zuigen overmaat laminine / serum oplossing van dekglaasjes en vervang primaire neuron kweekmedium (zie hieronder). NB De vereiste nantal dekglaasjes moet worden bepaald van tevoren als dekglaasje voorbereiding is begonnen de dag voorafgaand aan de cultuur (zie stap 1.1).
12. Cultuur primaire rat hippocampale neuronen E18 tot 21 dagen in vitro (DIV) in Neurobasal medium, 2% B27, 0,5 mM L-glutamine aangevuld met 1% FCS (hitte geïnactiveerd). Voer een half medium verandering op 7 DIV en daarna wekelijks. De anti-mitotische fluordeoxyuridine / uridine wordt toegevoegd 7 DIV, 1/1, 000 verdunning van 10 mM voorraad van elk nucleoside) naar gliale overgroei te voorkomen.

2. Antilichaam incubatie met Live Neuronen

1. Tijdens de eerste week van cultuur, zijn neuronen ontwikkelen dendritische bosjes en in week 2-3, hebben neuronen voldoende gerijpt te ondergaan synaptogenese ^6,7.
   1. Op geselecteerde experimentele tijdstip / s, gelden de primaire antilichaam aan putjes die primaire embryonale neuronen op dekglaasjes drievoud. Voeg een hoeveelheid van het antilichaam direct in het kweekmedium vande primaire neuronen de gewenste uiteindelijke verdunning Opmerking: In ons voorbeeld, een konijn polyklonaal antiserum opgewekt tegen een recombinant uitgescheiden vorm van het eiwit werd verdund 1/500 door 2 pi tot 1 ml kweekmedium goed, een centrifugatie gedurende 10 min , 13.000 xg, RT kan worden voorafgaand aan het nemen van een monster van antilichaam, zoals deze opgenomen worden alle deeltjes te verwijderen en kan helpen verminderen achtergrond.
   2. Voor de pre-immune serum, voeg een equivalente hoeveelheid pre-immuun serum (naar dezelfde uiteindelijke verdunning). Indien geen pre-immuun serum beschikbaar is, voeg de gelijkwaardige hoeveelheid Neurobasal medium of PBS (geen primair antilichaam controle). Als alternatief, als een geschikte primaire antilichaam beschikbaar dat intracellulaire gebied / s van het eiwit herkent, dit antilichaam kan worden toegevoegd aan een putje om specificiteit van het oppervlak kleuring testen.
   3. De terugkeer van de cellen naar de incubator voor 1-4 uur (dit incubatieperiode kan empirisch worden bepaald). In onze experimegen, het antilichaam was aanwezig voor de gehele periode, hoewel de proefopzet een puls van antilichaam, gevolgd door een verdere incubatie periode na wash-out (een pulse-chase experiment) konden nemen om het tijdsverloop van internalisatie beoordelen.
      Optionele stap: Deze incubatie kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur of op ijs uitgevoerd om de mate van basale eiwitten internalisatie vertragen indien nodig. Indien uitgevoerd in een niet-CO ₂ gecontroleerde omgeving, moet het medium aangepast tot een die niet bicarbonaat gebufferd voor toevoeging van het antilichaam / antiserum. LET OP: Mature neuron culturen (> 14 dagen, en in het bijzonder gekweekte muis embryonale neuronen) niet vol midden veranderingen goed verdragen.
2. We hebben incubatietijden voor deze primaire antilichaam internalisatie stap van 1 uur, 2 uur en 4 uur met goede resultaten, hoewel de optimale tijd zal afhangen rijkdom van het eiwit van belang en de dynamiek van proteïne transport in de cells onder studie.
   OPMERKING: De tweekleurige de afbeeldingen in Representatieve resultaten werden verkregen met een incubatie van 1 uur bij 37 ° C in een weefselkweek incubator.
3. Na incubatie gedurende de gewenste periode, zuigen uit de antilichaam-bevattend medium. Was de putjes voorzichtig maar snel eenmaal met PBS bij kamertemperatuur.

3. Secundair antilichaam Toepassing op Vast, Unpermeabilized Cells

1. Fix neuronen met 4% paraformaldehyde in fosfaatbuffer pH 7,2, 5 minuten bij kamertemperatuur Let op: voor de beste resultaten, gebruik vers bereid fixatief alternatief gebruiken oplossing die is opgeslagen bij -20 ° C en volledig ontdooid zodat er geen neergeslagen paraformaldehyde is evident . LET OP: Paraformaldehyde fixatief moet bereid en verwerkt worden in een zuurkast.
2. Verwijder fix uit putten (transfer naar afvalcontainer in zuurkast vloeistof) en spoel 3x met PBS.
   1. Optionele stap: Indien gewenst, om te besparen op antilichaam reagentia, de dekglaasjes kanwordt voorzichtig verwijderd uit de 12-wells plaat met een pincet en geplaatst cel-side-up, op een stuk Parafilm vastgesteld op basis van een wegwerp kweekplaat.
   2. Oplossingen kunnen vervolgens voorzichtig gepipetteerd op de dekglaasjes zodat deze volledig bedekt zonder de oplossing overstroming over de rand van het dekglaasje op de Parafilm.
   3. Deze techniek is geschikt voor korte termijn incubatie (1-2 uur) echter langer incubaties (bijv. 's nachts) moet worden uitgevoerd in een vochtige kamer uitgevoerd. Alternatief kan de dekglaasjes terug in de putjes van de 12-well plaat voor incubatie overnacht en voldoende volume worden gebracht, moet worden toegevoegd dat de dekglaasjes niet uitdrogen.
3. Blok voor 30 min bij kamertemperatuur met 5% BSA in PBS (NB: geen wasmiddel aan de blokkerende oplossing in dit stadium is het belangrijk dat de cellen niet permeabel).
4. Om oppervlakte-eiwit labelen voordat u verder gaat met detectietie van geïnternaliseerde eiwit, gelden de eerste fluorescent gelabelde 2 ° antilichaam naar keuze.
   Opmerking: In het hier beschreven voorbeeld, werd de primaire antiserum bij konijnen (in-house antilichaam) een recombinant uitgescheiden isovorm ^4. Aldus kan de eerste secundaire antilichaam aan het extracellulaire gebied van het transmembraan isovorm detecteren op het oppervlak van unpermeabilized neuronen, gebruikten we ezel anti-konijn DyLight 649 (1/200 verdund in PBS met 5% BSA). Het wordt aanbevolen om verdunde secundaire antilichaam oplossing (10 min., 13.000 xg, RT) voor gebruik centrifuge.
5. Incubeer de dekglaasjes gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
6. Was dekglaasjes (in putjes), 2x 5 min. met PBS.

4. Blokkeren met Excess Ongelabeld 2 ° Antibody

1. Blokkeer de unpermeabilized neuronen met een hoge concentratie (> 0,1 mg / ml) niet-gemerkt antilichaam 2 °.
   1. De ongelabelde 2 ° antilichaam moet tegen de soort worden verhoogd in diehet primaire antilichaam werd opgewekt (in dit geval konijn) door incubatie overnacht bij kamertemperatuur.
   2. Voor dit protocol AffiniPure _Fab fragment geit anti-konijn IgG (H + L) werd gebruikt bij een concentratie van 0,13 mg / ml.
      OPMERKING: De incubatie overnacht bleek cruciaal als een kortere incubatietijd (2 uur) te zijn was onvoldoende voor volledige afscherming van primaire antistof die niet volledig gebonden was door de gelabelde secundaire antilichaam.
2. Was dekglaasjes (in putjes), 2x 5 min. met PBS.
3. Na deze stap blokkeren, post-fix de cellen met 4% paraformaldehyde in fosfaatbuffer pH 7,2, 5 min bij kamertemperatuur geroerd. Spoelen met PBS (2x) na verwijdering van fixatief (transfer fixatief om afvalcontainer in zuurkast vloeistof).

5. Permeabilisatie en toepassing van de tweede fluorescent geconjugeerd 2 ° Antibody

1. Doorlaatbaar en blokkeren de cellen met 5% BSA in PBS dat 0,1% Triton-X-100 bij kamertemperatuur temperatuur gedurende 30 minuten.
2. Verwijder de blokkering oplossing (zorg dat de dekglaasjes niet uitdrogen). Voeg de tweede fluorescent-geconjugeerde 2 ° antilichaam gelabeld met een andere fluorofoor.
   1. Opmerking: Het moet mogelijk zijn om deze fluorofoor label onderscheiden van de eerder gebruikte, afhankelijk van de beschikbare excitatie / emissie filters aan de confocale microscoop (zie hieronder).
   2. Voor het voorbeeld in dit protocol, is een Alexa Fluor 488-geconjugeerd ezel anti-konijn 2 ° gebruikte antilichaam (1/200 in PBS, 5% BSA en 0,1% Triton-X-100). Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur en verwijder vervolgens de 2 ° antilichaam oplossing.
3. Wash dekglaasjes 3x 5 minuten met PBS en tenslotte wassen met gedeïoniseerd water kort.

6. Montage en Imaging

1. Mount coverslips op glasplaatjes met een waterig montage medium dat antifade (bijv. Vectashield) en laten drogen. Bewaren in het donker bij 4 ° C opTimal behoud van fluorescent signaal intensiteit.
2. Afbeelding immunologisch cellen op een confocale microscoop.
   1. Passende excitatie en emissie filters voor de detectie van de twee fluorofoor signalen beschikbaar zijn.
   2. Als er verschillende experimentele condities moeten worden vergeleken (bijvoorbeeld internalisatie tarieven onder gedepolariseerd ^8,9 of controle-omstandigheden), ervoor zorgen dat alle repliceren dekglaasjes van de verschillende voorwaarden wordt afgebeeld met het zelfde beeld acquisitie parameters. De geïntegreerde dichtheid van standaard regio's van belang of de puncta attributen (bijvoorbeeld het aantal, de grootte) van de resulterende beelden kunnen vervolgens worden gemeten met behulp van standaard software voor beeldanalyse (bijv. Fiji / ImageJ, Metamorph).

Results

De dual-color fluorescent immunokleuring techniek hier gepresenteerde bruikbaar voor het labelen van extracellulaire domeinen van transmembraan eiwitten in levende cellen (schematisch getoond in Figuur 1). Gedurende de incubatieperiode, de immunoglobulinen binden toegankelijke epitopen en een deel van de populatie van eiwitmoleculen met gebonden antilichaam wordt endocytose. Bovendien kunnen nieuw gesynthetiseerde eiwit het celoppervlak bereiken via voren handel en gerecycleerd eiwitmoleculen kunnen wor...

Discussion

De hier beschreven techniek complementair is aan die van celoppervlak biotinylering (beoordeeld door Arancibia-Cárcamo et al..) ¹² en is de voorkeursmethode voor het bewaren van gegevens over de subcellulaire lokalisatie van de geïnternaliseerde proteïne, mits een geschikt primair antilichaam aan een extracellulaire epitoop beschikbaar. Bovendien kan kwantificering van proteïne transport / internalisatie tijd worden uitgevoerd (door het vaststellen dekglaasjes gedurende verschillende levende cel incu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS with Ca and Mg	Invitrogen	14040182
Neurobasal medium	Invitrogen	21103-049
B27 supplement	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	PDS
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich Australia	A9418
Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich Australia	P0899
Natural mouse laminin	Invitrogen	23017-015	Ontdooi op ijs voor het maken van aliquots
Fetal bovine serum HyClone	Thermo Fisher
Fluorodeoxyuridine	Sigma Aldrich Australia	F0503
Uridine	Sigma Aldrich Australia	U3003
18 mm Round glass coverslips	Menzel Gläser	CB00180RA1
VECTASHIELD aqueous mounting medium	Vector Laboratories	H1400
Donkey anti-rabbit Dylight 649	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-495-152
AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich Australia	P6148	TOXIC - hanteer in afzuigkap
Triton-X-100	Sigma Aldrich Australia	T8787
Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody	Invitrogen - Molecular Probes	A21206