Differentiële Labeling van Cell-oppervlak en Internalized Eiwitten na Antibody Voeden van Levende gekweekte neuronen

Summary

We beschrijven een methode om eiwit label op het oppervlak van levende neuronen met een specifiek polyklonaal antilichaam tegen extracellulaire epitopen. Eiwit door het antilichaam gebonden op het celoppervlak en vervolgens geïnternaliseerd via endocytose kunnen worden onderscheiden van eiwitten nog op of verhandeld bij het oppervlak tijdens de incubatie.

Abstract

Om het celoppervlak lokalisatie van een vermoedelijke transmembraan receptor in gekweekte neuronen demonstreren we de gemerkte eiwit op het oppervlak van levende neuronen met een specifiek primair antilichaam opgewekt tegen een extracellulair gedeelte van het eiwit. Aangezien receptoren worden verhandeld en naar de oppervlakte, wanneer cellen permeabel na fixatie dan zowel celoppervlak en interne eiwit wordt gedetecteerd door dezelfde gelabelde secundaire antilichaam. Hier passen wij een methode om eiwittransport ("antilichaam feeding") bestuderen labelen eiwit dat werd geïnternaliseerd door endocytose in de antilichaam incubatiestap en eiwitten die zijn gebleven op het celoppervlak of werd verhandeld aan het oppervlak tijdens deze periode differentieel . De mogelijkheid om deze twee zwembaden van eiwit te onderscheiden werd mogelijk gemaakt door de integratie van een overnachting blokkering stap met sterk geconcentreerde ongelabelde secundair antilichaam na een eerste broen van unpermeabilized neuronen met een fluorescent gelabelde secundaire antilichaam. Na de blokkeringsstap, permeabilisatie van de neuronen toegestane detectie van de geïnternaliseerde zwembad met een fluorescent gelabeld secundair antilichaam met een andere fluorofoor. Met deze techniek konden we belangrijke informaties subcellulaire locatie van dit vermeende receptor verkrijgen, onthullen dat het inderdaad verhandeld het celoppervlak in neuronen. Deze techniek is breed toepasbaar op verschillende celtypes en cel-oppervlakte-eiwitten, die een passend antilichaam aan een extracellulair epitoop beschikbaar.

Introduction

Bij het ​​vaststellen van de functie van nieuw geïdentificeerde eiwitten, kan onderzoek naar de subcellulaire lokalisatie van en handel van het eiwit in kwestie belangrijke aanwijzingen over de mogelijke rol / s van het eiwit ^1,2 bieden. Bioinformatica analyse van de transcriptome van de zich ontwikkelende neocortex ³ gaf ons een lijst van genen veranderde expressie vertonen in de hersenen van muizen corticogenesis. Vervolgens heeft een knockout benadering vast te stellen dat het eiwit gecodeerd door een van deze genen, sez6, heeft een belangrijke rol in neuron ontwikkeling. We zagen dat de beslaglegging gerelateerde gen 6 of Sez6, eiwi....

Protocol

1. Gedissocieerde Hippocampale Neuron Cultuur

1. Bereid dekglaasjes (borosilicaatglas):
   1. Was in 100% ethanol.
   2. Droging onder UV-bestraling.
   3. Coat met Poly-D-lysine (0,5 mg / ml in 0,15 M boraatbuffer, overnacht bij 4 ° C).
   4. Op de volgende dag (dag van cultuur) Was 3x in PBS smeer met laminine (2,5 ug / ml, natuurlijke muis laminine) + 5% v / v warmte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS) verdund in PBS gedurende 2 uur bij 37 ° C.
2. Ontleden embryonale dag 18 (E18) hippocampus rat en verzamelen in PBS met calcium en magnesium, gekoeld op ijs. OPMERKING: alle experimentele protocols waarbij dieren werden goe....

Results

De dual-color fluorescent immunokleuring techniek hier gepresenteerde bruikbaar voor het labelen van extracellulaire domeinen van transmembraan eiwitten in levende cellen (schematisch getoond in Figuur 1). Gedurende de incubatieperiode, de immunoglobulinen binden toegankelijke epitopen en een deel van de populatie van eiwitmoleculen met gebonden antilichaam wordt endocytose. Bovendien kunnen nieuw gesynthetiseerde eiwit het celoppervlak bereiken via voren handel en gerecycleerd eiwitmoleculen kunnen wor.......

Discussion

De hier beschreven techniek complementair is aan die van celoppervlak biotinylering (beoordeeld door Arancibia-Cárcamo et al..) ¹² en is de voorkeursmethode voor het bewaren van gegevens over de subcellulaire lokalisatie van de geïnternaliseerde proteïne, mits een geschikt primair antilichaam aan een extracellulaire epitoop beschikbaar. Bovendien kan kwantificering van proteïne transport / internalisatie tijd worden uitgevoerd (door het vaststellen dekglaasjes gedurende verschillende levende cel incu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS with Ca and Mg	Invitrogen	14040182
Neurobasal medium	Invitrogen	21103-049
B27 supplement	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	PDS
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich Australia	A9418
Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich Australia	P0899
Natural mouse laminin	Invitrogen	23017-015	Thaw on ice prior to making aliquots
Fetal bovine serum HyClone	Thermo Fisher
Fluorodeoxyuridine	Sigma Aldrich Australia	F0503
Uridine	Sigma Aldrich Australia	U3003
18 mm Round glass coverslips	Menzel Gläser	CB00180RA1
VECTASHIELD aqueous mounting medium	Vector Laboratories	H1400
Donkey anti-rabbit Dylight 649	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-495-152
AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich Australia	P6148	TOXIC - handle in fume hood
Triton-X-100	Sigma Aldrich Australia	T8787
Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody	Invitrogen - Molecular Probes	A21206