Een gemodificeerde precipitatiewerkwijze isoleren Urinary exosomes

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een protocol voor het isoleren van exosomen uit menselijke urine met behulp van een gemodificeerde precipitatietechniek.

Samenvatting

De identificatie van biomarkers die een vroege detectie van nierziekten in urine en plasma mogelijk maken, is al enkele jaren een gebied van actief belang. Urinaire exosome vesicles, 40-100 nm groot, worden onder normale omstandigheden vrijgegeven in de urine door cellen uit alle nefronsegmenten en kunnen eiwitten, mRNA en microRNA bevatten die representatief zijn voor hun celtype van herkomst. Onder omstandigheden van nierdisfunctie of -letsel kunnen exosomen veranderde verhoudingen van deze componenten bevatten, die kunnen dienen als biomarkers voor ziekten. Er zijn momenteel verschillende methoden beschikbaar voor het isoleren van urinaire exosomen en we hebben eerder een experimentele vergelijking van elk van deze benaderingen uitgevoerd, waaronder drie gebaseerd op ultracentrifugeren, een met behulp van een nanomembraan ultrafiltratie concentrator, een met behulp van een commercieel precipitatie reagens en een met behulp van een modificatie van de precipitatietechniek met behulp van ExoQuick reagens dat we in ons laboratorium hebben ontwikkeld. We ontdekten dat de gemodificeerde precipitatiemethode de hoogste opbrengst aan exosomedeeltjes, miRNA en mRNA produceerde, waardoor deze aanpak geschikt is voor het isoleren van exosomen voor daaropvolgend RNA-profilering. We concluderen dat de gemodificeerde exosome precipitatiemethode een snelle, schaalbare en effectieve alternatief biedt voor het isoleren van exosomen uit urine. In dit rapport beschrijven we onze gemodificeerde precipitatietechniek met behulp van ExoQuick reagens voor het isoleren van exosomen uit menselijke urine.

Inleiding

Urine exosomen zijn kleine interne blaasjes van 100 nm van multivesiculaire lichaampjes (MVB), afkomstig van alle soorten cellen onder normale en pathologische omstandigheden in de urine ruimte, met inbegrip van de glomerulaire podocytes, niertubuli-cellen en epitheelcellen van de urine drainagesystemen die lijken te worden verrijkt voor miRNAs ^{1 -2.} Veel onderzoekers hebben verschillende eiwitten aangetroffen in exosomen geïsoleerd uit urine van gezonde individuen evenals die met nier- en / of systematische ziekten ^3-5. Exosomes kan worden geïsoleerd met behulp van verschillende methoden zoals tweestaps differentiële ultracentrifugatie met of zonder sucrose ^6-7 combineert nanomembrane filter met ultracentrifugatie ^{09/08, 11/10} of precipitatie. Recent hebben wij een eenvoudige, snelle, schaalbare en effectieve methode om urine exosomen te isoleren en op te sporen miRNA en eiwit biomarkers ^11. Hoewel biomarkers kan worden gedetecteerd in verschillende biologische vloeistoffen, urine is de meest geschikte keuze voor patiënten met nier- en urinewegen omdat het kan worden verkregen in grote hoeveelheden in een relatief niet-invasieve wijze.

Hoewel er verschillende manieren om urine exosomes isoleren ^6-11, de meest gebruikte procedure is gebaseerd op differentiële ultracentrifugatie met een 30% sucrose kussen. Hoewel deze methode is efficiënt en de kwaliteit van de resulterende exosomes geïsoleerd met deze werkwijze is hoog, de techniek zelf vereist geschoold personeel en is tijdrovend en vereist verscheidene stappen ultracentrifugatie. Andere werkwijzen, zoals filtratie en precipitatie, zijn ontwikkeld voor de isolatie van exosomes, waaronder een die een eigen precipitatiereagens gebruikt (dwz ExoQuick-TC: System Biosciences, Mountain View, CA). Hoewel precipitatie met dit reagens snel en relatief eenvoudig, de zuiverheid van de geïsoleerde exosomes is laag in vergelijking met de ultracentrifugatie method. We hebben onlangs vergeleken zes voor de isolering van urine exosomes, waaronder een modificatie van de precipitatie methode met ExoQuick-TC dat we in ons laboratorium ontwikkeld ^11. We vonden dat deze gewijzigde neerslag methode leverde hogere hoeveelheden eiwit, miRNA, en mRNA's en de procedure zelf sneller en eenvoudiger te implementeren dan ultracentrifugering was. Hier beschrijven we de experimentele protocol van onze gewijzigde neerslag methode stapsgewijs, en onder meer een bespreking van de voor- en nadelen van deze techniek in vergelijking met andere methoden van exosome isolement. De gemodificeerde precipitatie werkwijze omvat een initiële precipitatie van exosome deeltjes, gevolgd door verwijdering van Tamm-Horsfall eiwit, dat wordt gecorreleerd met exosomaal eiwitten en bekende exosome opbrengst van urine te verminderen. We vonden dat deze wijzigingen verhoogde de opbrengst en zuiverheid van de exosomaal preparaat uit urine.

Protocol

Opmerking. De stappen die betrokken zijn bij de isolatie van de urine exosomes met de gemodificeerde precipitatie werkwijze worden geïllustreerd in de Figuur 1 De eerste stappen omvatten het verwijderen van grote dode cellen en celresten door centrifugatie. De uiteindelijke pellet verkregen uit de vanuit elke volgende stap supernatant overeen met de exosoom, dat wordt opgelost in isolatieoplossing voor verdere extractie van eiwitten, RNA en DNA.

1. Het verzamelen van urine

1. Vóór urine inzameling bereiden proteaseremmer cocktail volgens de instructies van de fabrikant en voeg 3.125 ml van deze cocktail een lege steriele houder. De buis met de proteaseremmer cocktail kan vervolgens worden gedistribueerd naar vrijwilligers voor urine collectie.
   OPMERKING: De reden voor het toevoegen proteaseremmer om eiwitafbraak te beperken in het urinemonster. Hoewel we specifiek gebruikt een proteaseremmer cocktail vanSigma, kunnen andere commercieel verkrijgbare proteaseremmers worden vervangen.
2. Verzamel ongeveer 10 ml van de eerste leegte urine. Verwerk de urine onmiddellijk na monstername zonder opslag of koeling. Isoleer de urine exosomes in duplo met de gemodificeerde precipitatie methode; één van de duplo voor DNA, totaal RNA en eiwit-extractie, terwijl de andere is voor het kwantificeren van urine exosome deeltjes.
   OPMERKING: Een 24 uur urine kan worden verzameld voor exosome isolatie door opslag bij 4 ° C.

2. Verwijdering van de Cel Debris en Tamm-Horsfall Protein (THP)

1. Transfer urinemonsters 15 ml centrifugebuizen. Centrifugeer 10 ml urine bij 17.000 xg gedurende 10 min bij 37 ° C om cellen en celresten (figuur 1) te elimineren.
2. Met behulp van een pipet het supernatant naar een nieuwe buis voor verdere verwerking. Resuspendeer de pellet in 500 ui van isolatie-oplossing (250 mM sucrose, 10 mM beproeftanolamine, pH 7,6) gevolgd door 10 min incubatie met DL-dithiothreitol (DTT: eindconcentratie van 200 mg / ml) bij 37 ° C.
   OPMERKING: DTT toegevoegd aan THP die exosomes opsluit afbreken, wat leidt tot verminderde opbrengsten. Zorg ervoor dat de pellet ongestoord tijdens de overdracht van het supernatant te verlaten, en bevestigen dat het bovenstaande is duidelijk van pellet.
3. Vortex pellet samples elke 2 min totdat de pellet volledig is opgelost. Voeg vervolgens 500 ul van isolatie oplossing van de opgeloste pellet.
4. Onmiddellijk na de toevoeging van isolatie oplossing van de pellet gecentrifugeerd bij 17.000 xg gedurende 10 min bij 37 ° C. Pipetteer het supernatant en combineer met eerder verzamelde supernatant.
5. Resuspendeer de pellet in 50 ul van isolatie oplossing voor SDS-PAGE-analyse.
   OPMERKING: PBS of TBS kan worden gebruikt in plaats van isolatie oplossing van het pellet te resuspenderen.

3. Isolatie van exosome Pellet

1. Tot 11 ml van de verzamelde supernatant, voeg 3,3 ml ExoQuick-TC reagens en incuberen bij 4 ° C gedurende ten minste 12 uur.
   OPMERKING: De verhouding van het volume supernatant aan ExoQuick-TC reagens kan worden aangepast aan verhogen of exosomaal opbrengst verlagen. We zagen dat mindere hoeveelheden toegevoegd reagens van kleinere opbrengsten van exosomen.
2. Na incubatie gecentrifugeerd sample / ExoQuick-TC mengsel bij 10.000 xg gedurende 30 min bij 25 ° C.
3. Breng het supernatant naar een nieuwe buis voor SDS-PAGE-analyse.
4. De exosome pellet kan worden opgeslagen bij -80 ° C voor DNA, RNA en eiwit-extractie en kwantificering van exosome deeltjes met CD9 ELISA ^11.
   OPMERKING: De exosome pellet kan worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende 1 jaar met beperkte bevriezen en ontdooien.

4. Biomarker detectie en analyse van exosome Pellet

1. Voor stroomafwaartse analyses extract DNA, RNA en eiwit van de exosoom pellet met de DNA / RNA / eiwit isolatie kit en een RNA isolatie kit volgens de instructies van de fabrikant. Bepaal concentraties met een Nanodrop spectrofotometer door het meten van absorptie bij 260 en 280 nm met 2 pl monster.
2. Uitvoeren van kwantitatieve real-time RT-PCR (qPCR) met behulp van TaqMan microRNA assays (in ons geval, gebruikten we de menselijke miR-192- en miR-1207-5p-specifieke assays) of miRNA-specifieke primers.
3. Voor SDS-PAGE-analyse, gebruik 4-12% Bis-Tris gel en gescheiden eiwitmonsters door ééndimensionale elektroforese. Visualiseren gels met de zilverkleuring kit volgens de instructies van de fabrikant.
4. Voer western blot analyse met PVDF membranen volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik konijn polyklonale antilichaam tegen apoptose-gebonden gen-2 interactie eiwit X of ALIX en muis monoklonaal antilichaam tegen tumor gevoeligheid gen 101 eiwit of Tsg101 in de western blot detectie. Kwantificeren van de dichtheid van de bands door open toegang NIH ImageJ software (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ofeen soortgelijk programma.
5. Kwantificeren het aantal urine exosome deeltjes verkregen met een CD9 ELISA kit volgens de instructies van de fabrikant.

Resultaten

Urine exosomen dragen eiwit, miRNA en mRNA biomarkers afgescheiden van renale epitheelcellen. De isolatie en detectie van deze exosomes kan een nuttig diagnostisch hulpmiddel voor vroege detectie van nier- ziekten zoals diabetische nefropathie. Er zijn verschillende methoden voor de isolatie van exosomen van urinemonsters verzameld van menselijke proefpersonen. We hebben eerder dan zes werkwijzen urine exosome isolatie en onderzocht resulterende eiwit, mRNA en miRNA niveaus ^11. Ons doel hier was om te beschri...

Discussie

De meeste methoden waarbij het neerslaan van exosomen uit urine niet te pakken verwijdering van de polymere netwerk gevormd door Tamm-Horsfall eiwit (THP). Dit eiwit is aanwezig in grote hoeveelheden in urine, waar het vermoedelijk vallen exosomes tijdens de eerste lage snelheid centrifugatie. In het gewijzigde methode gereduceerd we THP middels DTT vóór exosome precipitatie. Zoals getoond in figuur 2, werd een grotere hoeveelheid THP waargenomen in ongewijzigde urine en pellet, zonder THP in het uitein...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Corning 15 ml Centrifuge Tube	Corning (Sigma Aldrich)	CLS430791
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	P8340
Centrifuge	Sorvall
DL-dithiothreitol	Sigma Aldrich	D9779	gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van 200 mg/ml
Novex NuPAGE SDS-PAGE systeem (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well	Invitrogen	NP0321BOX	Voor SDS-PAGE analyse
ECL Advance Western blotting detectiekit	GE Healthcare Life Sciences	RPN2135	Voor western blot detectie van biomarkers
Exoquick-TC Reagens	System Biosciences (SBI)	EXOTC50A-1	Voor exosome isolatie
Exosome CD9 ELISA Complete Kit	System Biosciences (SBI)	EXOEL-CD9-A-1	Voor exosome kwantificering
AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit	Qiagen	80004	Voor DNA, RNA, Eiwit isolatie
Rneasy MinElute Cleanup kit	Qiagen	74204
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrofotometer	Thermo Scientific		Voor Eiwit Kwantificering
ProteoSilver Zilver Stain Kit	Sigma Aldrich	PROTSIL1-1KT	Voor het kleuren van SDS-PAGE gels
Xcell SureLock Mini-Cell Elektroforese Systeem	Life Technologies		Voor het uitvoeren van de SDS-PAGE gels
TaqMan microRNA assays	Life Technologies		Voor RT-PCR assays
qBasePlus v1.5 software	Biogazelle NV		Voor analyse van RT-PCR assay data
Konijn polyklonaal antilichaam tegen ALIX	Millipore		Voor western blot detectie van biomarkers
Muis monoklonaal antilichaam tegen TSG101	Abcam		Voor western blot detectie van biomarkers