Een gemodificeerde precipitatiewerkwijze isoleren Urinary exosomes

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een protocol voor het isoleren van exosomen uit menselijke urine met behulp van een gemodificeerde precipitatietechniek.

Samenvatting

De identificatie van biomarkers die een vroege detectie van nierziekten in urine en plasma mogelijk maken, is al enkele jaren een gebied van actief belang. Urinaire exosome vesicles, 40-100 nm groot, worden onder normale omstandigheden vrijgegeven in de urine door cellen uit alle nefronsegmenten en kunnen eiwitten, mRNA en microRNA bevatten die representatief zijn voor hun celtype van herkomst. Onder omstandigheden van nierdisfunctie of -letsel kunnen exosomen veranderde verhoudingen van deze componenten bevatten, die kunnen dienen als biomarkers voor ziekten. Er zijn momenteel verschillende methoden beschikbaar voor het isoleren van urinaire exosomen en we hebben eerder een experimentele vergelijking van elk van deze benaderingen uitgevoerd, waaronder drie gebaseerd op ultracentrifugeren, een met behulp van een nanomembraan ultrafiltratie concentrator, een met behulp van een commercieel precipitatie reagens en een met behulp van een modificatie van de precipitatietechniek met behulp van ExoQuick reagens dat we in ons laboratorium hebben ontwikkeld. We ontdekten dat de gemodificeerde precipitatiemethode de hoogste opbrengst aan exosomedeeltjes, miRNA en mRNA produceerde, waardoor deze aanpak geschikt is voor het isoleren van exosomen voor daaropvolgend RNA-profilering. We concluderen dat de gemodificeerde exosome precipitatiemethode een snelle, schaalbare en effectieve alternatief biedt voor het isoleren van exosomen uit urine. In dit rapport beschrijven we onze gemodificeerde precipitatietechniek met behulp van ExoQuick reagens voor het isoleren van exosomen uit menselijke urine.

Inleiding

Urine exosomen zijn kleine interne blaasjes van 100 nm van multivesiculaire lichaampjes (MVB), afkomstig van alle soorten cellen onder normale en pathologische omstandigheden in de urine ruimte, met inbegrip van de glomerulaire podocytes, niertubuli-cellen en epitheelcellen van de urine drainagesystemen die lijken te worden verrijkt voor miRNAs ^{1 -2.} Veel onderzoekers hebben verschillende eiwitten aangetroffen in exosomen geïsoleerd uit urine van gezonde individuen evenals die met nier- en / of systematische ziekten ^3-5. Exosomes kan worden geïsoleerd met behulp van verschillende methoden zoals tweestaps differentiële ultracentrifugatie met of z....

Protocol

Opmerking. De stappen die betrokken zijn bij de isolatie van de urine exosomes met de gemodificeerde precipitatie werkwijze worden geïllustreerd in de Figuur 1 De eerste stappen omvatten het verwijderen van grote dode cellen en celresten door centrifugatie. De uiteindelijke pellet verkregen uit de vanuit elke volgende stap supernatant overeen met de exosoom, dat wordt opgelost in isolatieoplossing voor verdere extractie van eiwitten, RNA en DNA.

1. Het verzamelen van urine

1. Vóór urine inzameling bereiden proteaseremmer cocktail volgens de instructies van de fabrikant en voeg 3.125 ml van deze cocktail een lege s....

Resultaten

Urine exosomen dragen eiwit, miRNA en mRNA biomarkers afgescheiden van renale epitheelcellen. De isolatie en detectie van deze exosomes kan een nuttig diagnostisch hulpmiddel voor vroege detectie van nier- ziekten zoals diabetische nefropathie. Er zijn verschillende methoden voor de isolatie van exosomen van urinemonsters verzameld van menselijke proefpersonen. We hebben eerder dan zes werkwijzen urine exosome isolatie en onderzocht resulterende eiwit, mRNA en miRNA niveaus ^11. Ons doel hier was om te beschri.......

Discussie

De meeste methoden waarbij het neerslaan van exosomen uit urine niet te pakken verwijdering van de polymere netwerk gevormd door Tamm-Horsfall eiwit (THP). Dit eiwit is aanwezig in grote hoeveelheden in urine, waar het vermoedelijk vallen exosomes tijdens de eerste lage snelheid centrifugatie. In het gewijzigde methode gereduceerd we THP middels DTT vóór exosome precipitatie. Zoals getoond in figuur 2, werd een grotere hoeveelheid THP waargenomen in ongewijzigde urine en pellet, zonder THP in het uitein.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Corning 15 ml Centrifuge Tube	Corning (Sigma Aldrich)	CLS430791
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	P8340
Centrifuge	Sorvall
DL-dithiothreitol	Sigma Aldrich	D9779	gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van 200 mg/ml
Novex NuPAGE SDS-PAGE systeem (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well	Invitrogen	NP0321BOX	Voor SDS-PAGE analyse
ECL Advance Western blotting detectiekit	GE Healthcare Life Sciences	RPN2135	Voor western blot detectie van biomarkers
Exoquick-TC Reagens	System Biosciences (SBI)	EXOTC50A-1	Voor exosome isolatie
Exosome CD9 ELISA Complete Kit	System Biosciences (SBI)	EXOEL-CD9-A-1	Voor exosome kwantificering
AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit	Qiagen	80004	Voor DNA, RNA, Eiwit isolatie
Rneasy MinElute Cleanup kit	Qiagen	74204
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrofotometer	Thermo Scientific		Voor Eiwit Kwantificering
ProteoSilver Zilver Stain Kit	Sigma Aldrich	PROTSIL1-1KT	Voor het kleuren van SDS-PAGE gels
Xcell SureLock Mini-Cell Elektroforese Systeem	Life Technologies		Voor het uitvoeren van de SDS-PAGE gels
TaqMan microRNA assays	Life Technologies		Voor RT-PCR assays
qBasePlus v1.5 software	Biogazelle NV		Voor analyse van RT-PCR assay data
Konijn polyklonaal antilichaam tegen ALIX	Millipore		Voor western blot detectie van biomarkers
Muis monoklonaal antilichaam tegen TSG101	Abcam		Voor western blot detectie van biomarkers