Method Article

Methoden voor de kwantitatieve detectie van antilichaam-geïnduceerde complement activatie op de rode bloedcellen

DOI:

10.3791/51161

⸱

January 29th, 2014

 ,  , 
1Department of Immunopathology, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory Academic Medical Center, University of Amsterdam, 2Department of Hematology, Academic Medical Center, University of Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we twee assays voor het meten van complement activatie geïnduceerd door antilichamen tegen rode bloedcellen. Het grote voordeel boven de huidige assays is de kwantitatieve en eenvoudig te interpreteren natuur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antilichamen tegen rode bloedcellen (RBC's) kan leiden tot activatie resulteert in een versnelde klaring via complement receptoren in de lever (extravasculaire hemolyse) of tot intravasculaire lysis van erytrocyten vullen. Antistoffen (bijv. ABO) of auto-antilichamen tegen RBC antigenen (zoals in auto-immune hemolytische anemie, AIHA) leidt tot activatie vullen potentieel schadelijk en kan - vooral wanneer die tot intravasculaire lysis - fataal 1. Momenteel vullen wordt geactiveerd door een (auto)-antilichamen op rode bloedcellen wordt beoordeeld in vitro met behulp van de Coombs-test weerspiegelt complement afzetting op RBC of door een nonquantitative hemolytische assay reflecterende RBC lysis 1-4. Echter, om de werkzaamheid van complement-remmers te beoordelen, is het verplicht om kwantitatieve technieken. Hier beschrijven we twee dergelijke technieken. Eerst een test om C3 en C4 depositie detecteren op rode bloedcellen die wordt geïnduceerd door antilichamen in patiëntenserum voorafwoordigd. Hiervoor wordt FACS-analyse gebruikt fluorescent gemerkt anti-C3 of C4 anti-antilichamen. Vervolgens wordt een kwantitatieve hemolytische test beschreven. In deze test, complement-gemedieerde hemolyse geïnduceerd door patiënt serum gemeten te maken van spectrofotometrische detectie van de vrijgekomen hemoglobine. Beide testen zijn zeer reproduceerbaar en kwantitatief, vergemakkelijken studies van antilichamen geïnduceerde complement activatie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antilichamen tegen rode bloedcellen (RBC's) kan worden geïnduceerd door transfusie van rode bloedcellen een antigeen tot expressie die niet aanwezig ontvanger RBC. Deze allo-antilichamen kunnen ernstige acute hemolytische transfusiereacties als gevolg van activering op de volgende transfusie 5 aanvullen veroorzaken. In auto-immune hemolytische anemie (AIHA), patiënten autoantilichamen tegen hun eigen RBCs. Dit leidt tot versnelde goedkeuring van de cellen via de interactie van IgG gebonden aan RBC met Fcy-receptoren op fagocyten in de milt en / of bij auto-antilichamen kunnen complement via complement receptoren in de lever 6,7 activeren. Fu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van Bromelaïne-behandelde rode bloedcellen

  1. Wassen 0-getypte rode bloedcellen 3x met 1x PBS (centrifugeren bij 664 g gedurende 2-5 min).
  2. Incubeer 1 volume verpakte erytrocyten met twee volumes 0,5% bromelaïne oplossing 10 minuten bij 37 ° C.
  3. Was de cellen 3x met 1x PBS.
  4. De cellen kunnen worden opgeslagen als een 3% oplossing bij 4 ° C in 1 x PBS gedurende ten minste een week.

2. C3 en C4 Deposition analyse over RBC door FACS

  1. Warmte-inactivatie van het vereiste hoeveelheid patiënt serum (of andere anti-RBC antilichaam bron) door verwarmen van het monster gedurende 30....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 2a toont een representatief scatterplot voor RBC. Geschikt gating voor enkele rode bloedcellen kan worden gezien in de FSC-W - FSC-Een perceel (P1). Gewoonlijk ongeveer 95% van RBC vallen binnen deze poort P1 (enkelvoudige cellen), maar wanneer een hoog percentage patiënten serum wordt gebruikt, kan dit dalen tot 70-80%, vooral als anti-RBC IgM aanwezig in de patiënt serum.

Representatieve resultaten voor de invloed van AIHA patiëntenserum op C4 depositie Figu.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bovenstaande tests zijn reproduceerbaar en robuust. Ze zijn eenvoudig uit te voeren en het is mogelijk om ze uit te voeren met veel monsters tegelijk (een 96 putjes plaat). Daarom zou deze aanpak ook geschikt voor een volledig geautomatiseerd systeem, bijvoorbeeld een ELISA-robot systeem. In tegenstelling tot de momenteel gebruikte technieken, deze tests zijn kwantitatieve en dit zal helpen bijvoorbeeld in de studie van het effect van complement inhibitors. Bovendien is de interpretatie doel, namelijk .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SZ en DW krijgen een onbeperkte subsidie ​​van Viropharma.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PBSFresenius Kabi 
BSASigmaB-4287 
BarbitalFagron0261This chemical is subject to drug regulation.
Sodium BarbitalFagron0263This chemical is subject to drug regulation.
GelatinMerck1.0470.0500 
Sodium chlorideMerck1.06404.1000 
Magnesium ChlorideMerck1.05833.0250 
Calcium chlorideMerck1.0238.0500 
Dylight 488 amine reactive dyePierce46402 
Dylight 650 amine reactive dyePierce62265 
αC5 (Eculizumab)Alexion Pharmaceuticals 
FACS (Canto)BDAny FACS can be used that has the appropiate lasers.
Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) Thermo Labsystems1500-193Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used
BD FACSDiva software v 6.1.2BD643629Any compatible FACS analysis software can be used
Bromelain SanquinK1121 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
  2. Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Complement ActivationAntibody DepositionFlow CytometryHemolytic AssayRed Blood CellsC3 C4 DetectionQuantitative AnalysisSpectrophotometric DetectionPatient SerumAnti C5 Antibody

Related Articles