Verminderde Itraconazol Concentratie en duur succesvol zijn in het behandelen van<em&gt; Batrachochytrium dendrobatidis</em&gt; Infectie in Amfibieën

Samenvatting

Batrachochytrium dendrobatidis infectie bij amfibieën kan worden geëlimineerd met behulp van een verminderde concentratie (0.0025%) en de kortere duur (vijf minuten baden voor zes dagen) van itraconazol dan algemeen wordt gebruikt. Minder sterfte en minder negatieve bijwerkingen werden waargenomen met behulp van deze aangepaste behandeling protocol.

Samenvatting

Amfibieën ervaren de grootste daling van alle gewervelde klasse en een belangrijke oorzaak van deze daling is een pathogene schimmel, Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), die de ziekte chytridiomycose veroorzaakt. Captive verzekering kolonies zijn belangrijk wereldwijd bedreigde soorten amfibieën en kan de enige levensader voor die in kritieke uitsterven bedreigd zijn. Handhaving van ziektevrije kolonies is een prioriteit van captive-managers, nog veilige en effectieve behandelingen voor alle soorten en heel levensstadia niet geïdentificeerd. De meest gebruikte chemotherapeutische behandeling itraconazol, hoewel de dosering gebruikelijke schadelijk sommige individuen en soorten kunnen worden. We voerden een klinische behandeling proef om te beoordelen of een lager en veiliger, maar effectieve dosis itraconazol kan worden gevonden om Bd infecties te genezen. We vonden dat door het verminderen van de behandeling concentratie ,01-,0025% en beperking van de behandelingsduur van 11-6 Dagen van 5 min baden, kon kikkers worden genezen van Bd infectie met minder bijwerkingen en minder-behandeling gerelateerde mortaliteit.

Inleiding

Amfibieën zijn momenteel de grootste afname van de biodiversiteit van alle gewervelde taxa ^1. Chytridiomycose, een huidziekte veroorzaakt door de chytrid schimmelpathogeen Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), is een van de belangrijkste oorzaken van deze dramatische dalingen ² Bd is de slechtste pathogeen op verslag voor het veroorzaken van het verlies aan biodiversiteit. Infecteert meer dan 600 soorten amfibieën en heeft veroorzaakte daling in meer dan 300 soorten, waarvan maar liefst 200 soorten bedreigde of uitgestorven ^2,3 zijn geworden. De amfibie chytrid schimmel is niet gastheerspecifiek en het is onduidelijk welke kwaliteiten van de host kan voor Bd infectie tot vooruitgang leidt tot een ernstige ziekte. Chytridiomycose veroorzaakt dood door verstoren ionenkanalen in de huid, waardoor verlies aan elektrolyten en hartfalen ^4. Ook, Bd supernatant (die geen Bd zoosporen) veroorzaakt een immuunreactie kikkerlarven ⁵ leading onderzoekers geloven Bd produceert een giftig bijproduct ^6.

Omdat veel soorten zijn snel dalende, captive assurance koloniën en fokprogramma's zijn belangrijk instandhoudingsmaatregelen, en kan de enige levensader voor sommige soorten. Opzetten en onderhouden van ziektevrije kolonies is een uitdaging voor amfibie beheer faciliteiten. De huidige chemotherapeutische werkwijzen voor het behandelen Bd infecties, hoewel effectief, schadelijk voor de dieren die behandeld kunnen worden, en geen enkele behandeling methode is succesvol tussen soorten en leeftijdsgroepen amfibieën ⁷ geweest.

Enkele klinische proeven van behandelingen voor Bd infectie zijn uitgevoerd ^7. De drie meest gebruikte behandelmethoden zijn warmte therapie, chlooramfenicol en itraconazol. Warmte therapie is een nonchemotherapeutic behandeling die lijkt weinig bijwerkingen, kan op verschillende levensstadia en is algebondgenoot effectief. In een behandelingsproef, Chatfield en Richards-Zawacki ⁸ vonden dat 96% van de behandelde dieren infecties na gehuisvest bij 30 ° C gedurende 10 dagen had gewist. Hoewel deze proef was niet 100% succes, het dient als referentie voor anderen om warmtetherapie hun eigen soort beoordelen. Warmte therapie, hoewel effectief voor veel soorten onpraktisch voor vele alpine soorten die niet bij hoge temperaturen gedurende lange tijd. Chlooramfenicol, antibacterieel, is met succes gebruikt om Bd in vele soorten behandeling, en remt schimmelgroei in vitro. Als antibacteriële, de chlooramfenicol niet de schimmel specifiek aanvallen, maar is bekend apoptose te veroorzaken in eukaryote cellen ^9. Er wordt gespeculeerd dat chlooramfenicol therapie apoptose veroorzaakt in de huid, het doden van intracellulaire sporangia, hoewel het exacte werkingsmechanisme is niet bekend. Hoewel er geen klinisch onderzoek is uitgevoerd, en daaromdosis en duur van de behandeling zijn niet onderzocht, huidige behandelprotocollen vergen doorgaans onderdompeling gedurende 2-4 weken ^10,11, waardoor deze behandeling onpraktisch voor terrestrische amfibieën. Chlooramfenicol is ook beperkt in sommige landen diergeneeskundig gebruik omdat de blootstelling is geassocieerd met een zeldzame vorm van aplastische anemie ^12.

Itraconazol, een azole antifungale, is de meest gebruikte voor de behandeling van Bd-infectie bij amfibieën in gevangenschap. Het meest gebruikte protocol baden dieren in een 0,01% itraconazol oplossing gedurende vijf minuten per dag gedurende 11 opeenvolgende dagen. Dit protocol werd afgeleid van standaarden voor zoogdierlijke toediening en, terwijl effectief voor amfibieën, is niet gebaseerd op klinische studies amfibieën ^11,13. Dit protocol kan negatieve bijwerkingen in bepaalde soorten veroorzaken, vooral in het genus Rana en kikkervisjes en de recente Metamorphs ^11.Tadpole behandeling succesvol is geweest met een veel lagere concentratie (0,0005%) van itraconazol, maar werd geassocieerd met depigmentatie ^14. Deze zelfde concentratie werd uitgetest op recente Metamorphs en vond succesvol bij de behandeling van infectie ¹⁵ te zijn. Omdat er risico van negatieve bijwerkingen van itraconazol behandeling, hebben sommige beoefenaars ene helft van de gebruikelijke concentratie (0,005%) gedurende 11 opeenvolgende dagen gebruikt en vond dit succesvol te zijn in het genezen van Bd infecties ¹⁶ te zijn.

De huidige studie is een samenvatting van een klinisch onderzoek naar de behandeling met behulp van itraconazol aan Bd infectie ¹⁵ te behandelen. Het protocol beschrijft een poging om de laagste dosis en behandelingstijd die zowel veilig als effectief voor de behandeling Bd besmette dieren met itraconazol vinden. Dieren die in deze studie waren recente Metamorphs van golf kust padden, Incilius nebulifer.

Protocol

Ethiek Goedkeuring: Dit onderzoek en de methoden zijn goedgekeurd door Animal Gebruik en onderhoud Comite Tulane University (protocol nr. 0407.).

1. Testen op Bd Infectie

1. Zwabberen voor Bd
   1. Wattenstaafje dieren met een steriel wattenstaafje vijf maal op de ventrum, vijf keer op elke dij, elke kant, en elke ledemaat voor een totaal van 45 slagen. Zwabberen is een niet-invasieve methode voor de monsterneming voor Bd op amfibie huid.
   2. Voorzichtig draai de swab tijdens en tussen slagen te zorgen voor de grootste hoeveelheid DNA wordt verzameld op het wattenstaafje.
   3. WINKEL swabs in 1,5 ml microbuisjes bij -20 ° C.
2. DNA-extractie en qPCR assay
   1. Uittreksel genomisch DNA van de uitstrijkjes met een commercieel verkrijgbare DNA isolatie kit, volgens de instructies van dierlijk weefsel.
   2. Analyseer de geëxtraheerde DNA met behulp van kwantitatieve real time PCR (qPCR) volgende Boyle et al. ^17, met de volgende wijzigingen.:
   3. Verdunnen DNA-extractie monsters 01:10 met dubbele gedemineraliseerd water.
   4. Voeg 0,7 ul van runderserumalbumine (BSA) PCR inhibitie voorkomen.
   5. Zijn een interne positieve controle in elk monster te verzekeren PCR remming werd geen resultaten beïnvloeden.
   6. Voer monsters met een positieve en negatieve controle en een reeks verdunning normen zoöspore (infectie) laad schatten.

2. Enting

1. Cultuur Bd
   1. Bereid trypton bouillon door toevoeging van 10 g trypton 1 L omgekeerde osmose of gedeïoniseerd water, autoclaaf (121 ° C gedurende 40 min.) en afgekoeld. Eenmaal afgekoeld tot 23 ° C, voeg 1 ml penicilline-streptomycine.
   2. Grow Bd stam (JEL411 van J. Longcore, geïsoleerd van Guabal, Panama uit een Phyllomedusa maki) in een tryptone bouillon gedurende zeven dagen bij 23 ° C.
2. Breng de broth cultuur trypton en agar platen.
   1. Platen, voeg 10 g trypton en 10 g agar 1 L omgekeerde osmose of gedeïoniseerd water en autoclaaf (121 ° C gedurende 40 min).
   2. Zodra de geautoclaveerde mengsel is afgekoeld om te raken, maar voordat het stolt, giet in petrischaaltjes, 1/4-1/3 vol, in een laminaire stroming kap.
   3. Wanneer agar volledig is gestold en afgekoeld, voeg 0,5 ml Bd bouillon aan elke plaat en verdeel gelijkmatig over de plaat. Laten drogen.
   4. Zodra de platen worden geënt met Bd zoösporen, Seal-platen met Parafilm.
   5. Laat platen geïncubeerd bij 23 ° C gedurende 5-7 dagen. Controleer zoospore beweging om de levensvatbaarheid te garanderen voor enting.
3. Vloed platen voor zoospore enting oplossing
   1. Na de 5-7 dagen van Bd incubatie en groei, overstromen elk bord met 5 ml leidingwater leeftijd en laat zoösporen tot de media voor 10 min in te voeren.
   2. Giet de zoospore Suspension in een draagbare container.
   3. Schatting zoöspore concentratie met een hemocytometer.
   4. Verdun het mengsel tot een concentratie van 1 x 10 ⁶ per 3 ml met leidingwater leeftijd.
4. Inoculeren dieren
   1. In individuele 50 ml containers, te enten elk dier door het gieten van 3 ml inoculum mengsel over haar ventrum. Laat extra inoculum te druppelen in de basis van de inoculatie container.
   2. Elk dier zal in inenting container blijven gedurende 24 uur voor infecties zorgen.
   3. Na 24 uur van inenting, terugkeren dieren aan individuele gedesinfecteerd terraria.
   4. Laat infectie bouwen voor twee weken. Bevestig infectie met wattenstaafje en qPCR resultaten, en beginnen met de behandeling.
   5. Voor Bd-negatieve controles, overstroming Bd-vrij agar platen met 5 ml jaar leidingwater, en mock enten de dieren met behulp van dezelfde methoden als hierboven.

3. Behandelschema

1. Prepare behandeling bad
   1. Voeg 2,50 ml waterige itraconazol (1% Trisporal OS) om 1 L Amphibian Ringer-oplossing (0,0025% itraconazol - de laagste effectieve behandeling concentratie).
      1. Amfibie Ringer's oplossing recept: 1 L omgekeerde osmose of gedeïoniseerd water, 6,6 g natriumchloride, 0,15 g kaliumchloride, 0,15 g calciumchloride en 0,2 g natriumbicarbonaat. Autoclaaf oplossing (121 ° C gedurende 40 min) en laat afkoelen tot kamertemperatuur.
      2. Voor 0,01% itraconazol behandeling concentratie, voeg 10,00 ml waterige itraconazol (1% Trisporal OS) om 1 L Amphibian Ringer-oplossing
      3. Voor 0,005% itraconazol behandeling concentratie, voeg 5,00 ml waterige itraconazol (1% Trisporal OS) om 1 L Amphibian Ringer-oplossing.
   2. Voor Bd-positieve en Bd-negatieve controles, baden dieren in Amphibian Ringer-oplossing zonder itraconazol.
2. Behandeling
   1. Plaats individuele amfibieën in gedesinfecteerd 50 ml containers met 35 ml van de behandeling oplossing.
   2. Zorgen voor dieren zijn volledig gedekt gedurende vijf minuten onder voorzichtig schudden van de container.
   3. Terug dieren ontsmet terraria. Herhaal dit voor zes dagen.
3. Zorgen voor de behandeling succes
   1. Proefdieren voor Bd infectie op de dag dat de behandeling begint.
   2. Proefdieren voor Bd infectie een week na de behandeling is voltooid, en een keer per week gedurende vier weken voor infecties zorgen heeft ontruimd.

4. Bd als Biohazard

1. Desinfecteren individuele terraria wekelijks.
   1. Baad de terraria en behandeling containers in een 10% bleekwater oplossing bad.
   2. Tweemaal Spoel elk gebleekt container met stromend water.
   3. Verpakking laten drogen voor 24 uur voor hergebruik.
2. Draag schone nitril handschoenen bij het hanteren van dieren om kruisbesmetting te voorkomenvan Bd ziekteverwekker. Wijzig handschoenen tussen de behandeling van elk dier.
3. Desinfecteer alle vloeibare afvalstoffen voorafgaand aan verwijdering door het brengen van de oplossing tot 10% bleekmiddel.
4. Autoclaaf alle vaste afvalstoffen die mogelijk wordt blootgesteld aan Bd alvorens ze te verwijderen.

Resultaten

Itraconazol behandeling werd als succesvol beschouwd indien alle dieren waren Bd-negatieve vier weken na de behandeling beëindigd. Voorafgaand aan de behandeling begonnen, twee weken na de inenting, alle BD-geënte dieren werden besmet, met een gemiddelde zoospore belasting van 1,121.7 (± 17.34), terwijl vier weken na de behandeling beëindigd, de Bd-positieve controle dieren een gemiddelde zoospore belasting van 16,765.12 gehad ( ± 14.643,08).

Behandeling van In...

Discussie

Met behulp van dit protocol konden we de behandeling dosering en het tijdstip van itraconazol behandeling voor Bd bij amfibieën veilig en effectief te verminderen. De laagste behandelingsdosering en tijd (0,0025% voor zes dagen) was een succesvolle behandeling voor subklinisch geïnfecteerde I. nebulifer. De effectiviteit van zowel een lagere dosering en duur van de behandeling tonen de noodzaak van klinische behandeling proeven voor Bd infectie behandelingen, want er zijn geen veilige en effec...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox	Janssen Pharmaceutica Inc.
NaCl	Fisher Scientific	S640-500
KCl	Fisher Scientific	BP366-1
CaCl2	Fisher Scientific	BP510-100
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-500
Steriele wattenstaafjes	Medical and Wire Equipment	MW113
1.5 ml Microtubes	Sarstedt	73.703.217
Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69581
7500 Real-time PCR	Applied Biosystems	4351104
VIC IPC	Applied Biosystems	4308323
BSA	Applied Biosystems	AM2618
Agar	Invitrogen	30391023
Tryptone	Invitrogen	Q10029
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Petrischaal	Sigma Aldrich	CLS430589