Isolatie en kwantificering van botulineneurotoxine uit complexe matrices gebruiken BoTest Matrix Testen

Summary

De BoTest Matrix botulinum neurotoxine (BoNT) opsporingsanalyses snel te zuiveren en te kwantificeren BoNT uit een reeks van monstermatrices. Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van BoNT uit zowel vaste als vloeibare matrices en demonstreren van de test met BOTOX, tomaten en melk.

Abstract

Nauwkeurige detectie en kwantificering van botulinum neurotoxine (BoNT) in complexe matrices is vereist voor de farmaceutische-, milieu-, en voedsel steekproeven. Rapid BoNT testen van levensmiddelen is nodig tijdens uitbraak forensisch onderzoek, patiënt de diagnose en voedselveiligheid testen is nauwkeurig de werkzaamheid is vereist voor BoNT-based drug fabricage van de producten en de veiligheid van de patiënt. Het op grote schaal gebruikt bioassay in muizen voor BoNT testen is zeer gevoelig, maar mist de precisie en doorvoer nodig is voor een snelle en routinematige BoNT testen. Bovendien is de bioassay's gebruik van dieren heeft geleid tot oproepen van geneesmiddel regelgevende instanties en voorstanders van dieren-rechten in de VS en het buitenland om de muis bioassay voor BoNT testen vervangen. Verschillende in vitro vervangende tests zijn ontwikkeld die goed werken met gezuiverd BoNT in eenvoudige buffers, maar de meeste niet aangetoond voor testen in zeer complexe matrices zijn. Hier, een protocol voor de detectie vanBoNT in complexe matrices met de BoTest Matrix assays gepresenteerd. De test bestaat uit drie delen: Het eerste deel omvat de voorbereiding van de monsters voor het testen, het tweede deel is een immunoprecipitatie stap met behulp van anti-BoNT-antilichaam beklede paramagnetische kralen te zuiveren BoNT uit de matrix, en het derde deel kwantificeert de geïsoleerde Bont proteolytische activiteit met behulp van een fluorogeen reporter. Het protocol is geschreven voor high throughput testen in 96-well platen met zowel vloeibare als vaste matrices en is ongeveer 2 uur handmatig preparaat met in totaal assay tijd van 4-26 uur, afhankelijk van het type monster toxine belasting en de gewenste gevoeligheid. Gegevens zijn weergegeven voor BoNT / A test met fosfaat gebufferde zoutoplossing, een geneesmiddel, kweeksupernatant, 2% melk en verse tomaten en omvat bespreking van kritische parameters voor de test succesvol.

Introduction

Botulinum neurotoxinen (Bonts) zijn de dodelijkste bekende stoffen, met intraveneuze menselijke dodelijke doses geschat op 1-3 ng / kg ^1,2. Zeven structureel vergelijkbare serotypen van BoNT, A tot en met G, bestaan ​​elk uit een zware keten domein verantwoordelijk voor celbinding, opname en translocatie naar het cytosol en een lichte keten die een zink-endopeptidase ^3-5 codeert. De exquise toxiciteit van BoNT voortvloeit uit, voor een deel, de specifieke binding en inwerking motorische neuronen in de neuromusculaire verbinding ^6. Eenmaal binnen het neuron, het lichte keten endopeptidase splitst specifiek een of meer van de oplosbare N-ethylmaleimide-gevoelige factor attachment eiwitreceptor (SNARE) proteïnen vereist voor vesikel fusie, remmende neurotransmitter en leidt tot zwakke verlamming ^7-14. Algemeen bekend als de ziekte 'botulisme, "verlamming van het diafragma en tussenribspieren door BoNT uiteindelijk totrespiratoire insufficiëntie en de dood, tenzij een vroege diagnose en behandeling zijn ontvangen.

Menselijke voedselbotulisme wordt meestal geassocieerd met BoNT serotypen A, B, E en F (BoNT / A, BoNT / B, enz.) en meestal het gevolg van de inname van besmet voedsel ^15,16, hoewel verscheidene gevallen wondbotulisme werden gemeld bij intraveneuze druggebruikers ^17,18. In de Verenigde Staten, infantiel botulisme als gevolg van de inname van Clostridium sporen door kinderen onder de leeftijd van een is de meest voorkomende vorm van botulisme ^19-21. Echter, door voedsel overgedragen BoNT uitbraken als gevolg van onjuist thuis inblikken en verwerking van levensmiddelen werden gemeld in zowel de Verenigde Staten en in het buitenland. Tussen 2000-2009 werden ten minste 338 gevallen van voedselbotulisme wereldwijd gemeld waaronder zes dodelijke slachtoffers ^22. De mogelijkheid om voedselbotulisme uitbraken snel en gevoelig op te sporen is een kritische indicatie dat een vroege diagnose zou kunnen helpen ^23,24. Bovendien zal detectiemethoden die kosteneffectief en routinematig testen van voedsel laten leiden tot een betere voedselzekerheid.

Neuronale specificiteit en lange biologische halfwaardetijd BoNT maakt het een krachtige therapeutische ook. In de Verenigde Staten, zijn BoNT-gebaseerde geneesmiddelen goedgekeurd door de Food and Drug Administration voor de behandeling van cosmetische voorwaarden en-neuromusculaire-gerelateerde aandoeningen, waaronder glabellalijnen, cervicale dystonie, migraine, overactieve blaas, en scheelzien. Tal van "off-label"-toepassingen zijn gedocumenteerd, met inbegrip van hoge-dosis behandelingen voor ernstige spier-disfunctie ^25-28. Nauwkeurige kwantificering toxine is essentieel voor een juiste dosering, als onderdosering kan leiden tot ineffectieve behandeling, terwijl overdosering brengt patiënten met een risico van potentieel schadelijke bijwerkingen. Helaas is er geen gestandaardiseerde potentie assayprotocol gedeeld over fabrikanten, wat resulteert in eenheid definitie ongelijkheid tussen BoNT-based drug products ^29-31.

De standaard test voor BoNT de muizen bioassay waarin BoNT-houdende monsters intraperitoneaal worden geïnjecteerd in muizen en het aantal sterfgevallen geconstateerd gedurende 1-7 dagen ^16,32,33. De muis bioassay is zeer gevoelig met detectielimiet (LOD) van 5-10 pg BoNT / A ^34, maar de ethische bezorgdheid over het gebruik van dieren, de hoge kosten van de opleiding van personeel en het onderhoud dier faciliteiten, lange assay keer, en het gebrek aan gestandaardiseerde protocollen geleid tot oproepen om gestandaardiseerde, diervrije BoNT testen en kwantificeringsmethoden ^35-39 ontwikkelen. Onlangs werden een aantal alternatieve BoNT kwantificeringsmethoden ontwikkeld die muis of bijna-bioassay gevoeligheid ^40-49 bieden. Deze methoden vaak gebruikt fluorescentie, massa-spectrometrie, of immunologische methoden en bieden testtijden aanzienlijk korter dan de bioassay in muizen zonder dierproeven. Massaspectrometrie benaderingen gecombineerd met immunologische techniqwaarden bleken te detecteren en kwantificeren BoNT in voedsel en andere complexe monsters, maar de opleiding van personeel eisen en gespecialiseerde apparatuur limiet deze assays ^50-55. De meeste andere alternatieve tests zijn niet direct van toepassing op complexe steekproeven of missen de doorvoer nodig is voor routine BoNT testen. De sterk variabele aard van voedsel monster viscositeit, pH, zoutgehalte, en matrixbestanddelen presenteert een bijzonder moeilijke uitdaging wanneer het proberen om in vitro assay methodes met gevoeligheid voor de extreme kracht van BoNT overeen te ontwikkelen. Zelfs eenvoudige en relatief goedaardige buffersystemen, zoals die welke voortvloeien uit resuspensie van BoNT gebaseerde geneesmiddelen bevatten zout, albumine, suiker en stabilisatoren (bijvoorbeeld excipiënten) die grote invloed in vitro potentie BoNT ^56. Toxine zuivering vereist voor nauwkeurige activiteit testen van alle maar de eenvoudigste monsters ^56-59.

DeBoTest Matrix testen werden ontworpen voor een snelle, high-throughput, en consistente kwantificering van BoNT van zeer complexe monsters met behulp van apparatuur vaak gevonden in onderzoekslaboratoria ^56,60. Deze testen gebruiken paramagnetische kralen covalent gebonden aan serotype-specifieke anti-BoNT antilichamen te binden en afzonderen BoNT uit een steekproef en verwijder storende matrix verbindingen door wassen. Na het wassen wordt gebonden BoNT proteolytische activiteit dan gekwantificeerd in een geoptimaliseerde reactie buffer met behulp van een verslaggever compatibel met de BoNT serotype wordt getest. Deze reporters fluorogene eiwitten bestaande uit een N-terminale cyaan fluorescerend eiwit (CFP) deel en een C-eindstandige geel fluorescerend proteïne derivaat (Venus) groep verbonden door een BoNT substraat, SNAP25 residuen 141-206 of synaptobrevin residuen 33-94 die de BoTest A / E of B / D / F / G verslaggevers, respectievelijk ^45. Reporter splitsing door BoNT wordt bewaakt door middel Förster resonance energie-overdracht (FRET). Als thij verslaggever is intact, excitatie van GVB resulteert in FRET naar Venus, afschrikken GVB emissie en spannende Venus emissie. Splitsing van de reporter door BoNT FRET voorkomt, wat leidt tot een toename GVB emissie en afname Venus emissie. BoNT activiteit kan dan kwantitatief worden gemeten met behulp van de verhouding van het GVB en Venus uitstoot. LOD onder 3 pg mogelijk uit een breed scala van voedingsmiddelen met behulp van een high-throughput 96-well plaat formaat ^56. Verhoogde gevoeligheid kan worden verkregen met grotere monstervolumes aangezien de test maakt concentratie van het toxine op de korrel oppervlak.

De BoTest Matrix assays voor Bonts A, B, E, en F werden ontwikkeld en getest met voedings-, farmaceutische, en milieu-monsters ^56,60. Hier beschrijven we de procedures voor het uitvoeren van deze tests voor de detectie van BoNT lage complexiteit (bijv. farmaceutische, BoNT in buffer) en grote complexiteit (bijvoorbeeld voeding, milieu) monsters. Specifieke verwerkingsmethodenvoor verschillende soorten monsters worden in dit protocol en soorten monsters hier niet beschreven kan meestal worden aangepast met behulp van een combinatie van de gepresenteerde methoden. Het protocol is ontwikkeld en getest met BoNT / A, maar is aan te passen aan andere BoNT serotypen middel van hun respectieve testen zoals elders ^56,60 aangetoond.

Protocol

1. Bereiding van Assay Reagents

1. Ontdooi 200x dithiothreitol (DTT), 10x Matrix bindingsbuffer (10x Binding buffer hierna), 10x neutralisatie buffer (pH alleen voedsel of onevenwichtige monsters) en BoTest 10x reactiebuffer (10X Reaction Buffer hierna) bij kamertemperatuur (KT) gedurende 15 min of totdat het volledig ontdooid. Zie tabel 1 voor een overzicht van buffers en reagentia die in dit protocol. Zie tabel 2 voor een lijst van materialen en apparatuur die nodig is voor dit protocol.
2. Vortex de ontdooide buffers 5 seconden om te mengen. 10x neutralisatiebuffer 200xDTT en 10x Reaction buffer moet duidelijk zichtbaar worden terwijl de 10x Binding buffer een troebel uiterlijk zal hebben. Verwarm de 10x reactiebuffer gedurende 5 minuten bij 37 ° C en herhaal vortexen wanneer het troebel na ontdooien.
3. Genereer 3.8 ml 1x Reaction buffer.
   1. Label een 15 ml conische buis "1x Reaction buffer" en voeg 3,42 ml moleculaire biologie leerjaar wateh, 380 ul 10x Reaction buffer en 19 pl 200x DTT. Meng buffer goed door.
   2. Snijd een EDTA-vrije proteaseremmer tablet wijken met een schone scheermesje en voeg een kwart van de tablet de reactie 1x buffer (de overige tablet gedeelte kan worden opgeslagen bij 4 ° C voor later gebruik). NB Proteaseremmers mag nodig zijn bij gebruik van gezuiverd toxine en simpele buffers (bijv. farmaceutische monsters).
   3. Vortex het 1x Reaction buffer totdat de protease tablet volledig is opgelost.
4. Verwarm de matrix A kralen (IP-A-parels hierna) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
5. Ontdooi de BoTest A / E reporter (A / E reporter hierna) bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
6. Label een 15 ml conische buis "0,5 uM A / E reporter" en voeg 45 ul van de 20 uM A / E reporter voorraad tot 1,8 ml 1x Reaction buffer. Meng goed door pipetteren en op te slaan op ijs beschermd tegen licht.

2. Staanard Curve Sample Generation

De standaardkromme beschreven omvat 10-30,000 sounddecoder ₅₀ / g voedsel of per ml buffer in half-log verdunningen (Tabel 3). De eindgebruiker is vrij om alternatieve concentraties gebruiken als toepasselijk.

1. Spiking en incuberen van de matrices met referentiemateriaal. Genereer de standaardcurve met behulp van een verdunningsmiddel van dezelfde matrix als onbekende, indien mogelijk, om matrix te verminderen. Gebruik gelatine fosfaatbuffer (GPB) of fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) als verdunningsmiddel of aanvullende BoNT-negatieve matrix niet beschikbaar (bijv. veld of BoNT uitbraak steekproeven). Genereer de standaard curve door stekelige BoNT / A in de matrix van de keuze na het geschikte protocol hieronder.
   1. Lage complexiteit monsters (bijv. PBS, GPB, of farmaceutische)
      1. Voeg 10 ml van de geschikte buffer om een ​​15 ml conische buis en zet apart. Dit monster wordt gebruikt als verdunningsmiddel voor de standaard curve en onbekende verdunningen (hoofdstuk 4).
      2. Voeg 1,2 ml buffer tot een microcentrifugebuis.
      3. LET OP: Deze stap maakt gebruik BoNT en uiterste voorzichtigheid moeten worden gebruikt bij de behandeling en verwijdering van eventuele reagentia en materialen die in contact komen met het toxine. Gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen en correcte verwijdering van alle materialen moeten volgens het Amerikaanse ministerie van Arbeid OSHA richtlijnen voor BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) worden uitgevoerd. Voeg BoNT / A 1,2 ml monster zodanig dat de uiteindelijke concentratie 30.000 sounddecoder ₅₀ / ml (36.000 sounddecoder ₅₀ totaal).
   2. Vloeibaar voedsel monsters (of andere complexe vloeibare monsters) Opmerking: De eerste testen wordt aanbevolen om het volume van de bovenstaande vloeistof gewonnen uit verduidelijkt monsters als de deeltjes (. Bv pulp) in vloeibare matrices bepalen zal variëren. Dit protocol veronderstelt ten minste 1,2 ml geklaarde supernatant zal worden verhaald op een 1,4 ml sample. Verhoog steekproefgrootte indien nodig.
      1. Voeg 10 ml vloeibaar voedsel aan een 15 ml conische buis en leg het opzij. Dit monster wordt gebruikt als verdunningsmiddel voor de standaardkromme en onbekende verdunningen (punt 4).
      2. Weeg een lege 1,5 ml microcentrifugebuis en noteer de massa.
      3. Voeg 1,4 ml van het vloeibare voedingsmiddel de gewogen microcentrifugebuis.
      4. Weeg de microcentrifugebuis en bereken de massa van het toegevoegde levensmiddelen monster door het aftrekken van de massa van de lege buis.
      5. LET OP: Deze stap maakt gebruik BoNT en uiterste voorzichtigheid moeten worden gebruikt bij de behandeling en verwijdering van eventuele reagentia en materialen die in contact komen met het toxine. Gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen en correcte verwijdering van alle materialen moeten volgens het Amerikaanse ministerie van Arbeid OSHA richtlijnen voor BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) worden uitgevoerd. Voeg BoNT / A op de 1,4 ml monster in een eindconcentratie van 30.000 sounddecoder ₅₀ / g voedsel.
      6. IncubatietE het verdunningsmiddel en spiked monsters bij kamertemperatuur of 4 ° C gedurende 2 uur om het BoNT tijd om met de voedselmatrix geven nabootsen van een natuurlijke besmetting.
   3. Vast voedsel monsters (of andere vaste monsters) Opmerking: De eerste testen wordt aanbevolen om het volume van de bovenstaande vloeistof hersteld van gehomogeniseerd en verduidelijkt monsters na de toevoeging van 1 ml GPB / g voedsel bepalen. Dit protocol gaat ervan uit dat ten minste 1,2 ml geklaarde supernatant zal worden verhaald op een 2 g monster. Verhoog steekproefgrootte indien nodig.
      1. Weeg 10 g monster van vaste stof in een 50 ml conische buis en zet apart. Dit wordt gebruikt als verdunningsmiddel.
      2. Weeg 2 g vast voedsel monster in een tweede 50 ml conische buis.
      3. LET OP: Deze stap maakt gebruik BoNT en uiterste voorzichtigheid moeten worden gebruikt bij de behandeling en verwijdering van eventuele reagentia en materialen die in contact komen met het toxine. Gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen en het weggooien van het materiaals moet volgens het Amerikaanse ministerie van Arbeid OSHA richtlijnen voor BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) worden uitgevoerd. Voeg BoNT / A het oppervlak van de 2 g monster tot een eindconcentratie van 30.000 sounddecoder ₅₀ / g voedsel (60.000 totaal sounddecoder _50).
      4. Incubeer het verdunningsmiddel en verrijkte monsters bij kamertemperatuur of 4 ° C gedurende 2 uur om het BoNT tijd om met de voedselmatrix geven nabootsen van een natuurlijke besmetting.
2. Monster homogenisering en buffer aanpassing. Verwerk de spiked standaardcurve monster en verdunningsmiddel boven naar soort monster gegenereerd.
   1. Lage complexiteit monsters
      1. Geen verdere monster verwerking noodzakelijk is.
   2. Vloeibaar voedsel monsters (of andere complexe vloeibare monsters)
      1. Geen enkel monster homogenisering nodig.
      2. Voeg 140 ul 10x neutralisatiebuffer aan de 1,4 ml spiked monster en 1 ml 10x Neutroion buffer op de 10 ml diluentstaat. Meng monsters goed door.
      3. Gedeeltelijk verduidelijken beide monsters door centrifugeren gedurende 10 min bij 6000 xg en 4 ° C. Verwijder direct de bovenstaande vloeistoffen en over te dragen aan nieuwe buizen.
   3. Vast voedsel monsters (of andere vaste monsters)
      1. Voeg 2 ml GPB (1 ml GPB / g voedsel) aan de 2 g BoNT /-A spiked vast voedsel monster en 10 ml GPB aan de 10 g diluentstaat.
      2. Meng de monsters met behulp van een stamper tot het goed gemengd. Afhankelijk van de aard van het monster, kunnen er kleine stukjes materiaal die niet kunnen worden gehomogeniseerd, die aanvaardbaar is. Als alternatief kan mechanische homogenisatie methoden worden gebruikt. Het gebruik van een blender is niet aanbevolen, omdat het zo goed als kunnen inactiveren aerosolize het toxine.
      3. Voeg 1/10e volume 10x Neutralisering buffer om de diluentstaat basis van het geschatte totale volume (bv. 2 ml of het volume 20 ml). Extrapolerenhet totale volume van de BoNT /-A spiked monster en voeg 1/10e volume van 10x neutralisatie buffer. Meng monsters goed door.
      4. Gedeeltelijk verduidelijken beide monsters door centrifugeren gedurende 10 min bij 6000 xg en 4 ° C. Verwijder direct de bovenstaande vloeistoffen en over te dragen aan nieuwe buizen.
3. Bereid standaardcurve seriële verdunningen te testen
   1. Met behulp van de BoNT /-A spiked standaardcurve monster als D1 en de nonspiked monster als verdunner, het genereren van de overige standaard curve monsters in 1,5 ml microcentrifugebuizen volgens Tabel 3.

3. Bereid onbekende monsters

Deze sectie kan parallel aan hoofdstuk 2 worden afgerond.

1. Bepaal het aantal en verdunningen van onbekenden. Test onbekenden in drievoud indien mogelijk.
   1. Voor kwalitatieve bepalingen, lopen de onbekenden zonder verdere verdunning dan nodig is om het monster te verwerken als descrihieronder bed.
   2. Voor kwantitatieve testen bereiden minste twee 1:10 verdunning monsters, zoals hieronder beschreven, zodat een of meer monsters binnen het lineaire bereik van de assay respons vallen. Genereer verdunningen met behulp van een verdunningsmiddel van dezelfde matrix als het onbekende, indien mogelijk, om matrix effecten te verminderen, zoals beschreven in hoofdstuk 3. Gebruik anders PBS of GPB als verdunner.
2. Het genereren en verdunnen van onbekende monsters volgens het type monster.
   1. Lage complexiteit onbekenden (bijv. PBS, GPB, of farmaceutische)
      1. Voeg minstens 750 ul onbekend bij een microcentrifugebuis met onbekende verdunning 1 genereren.
      2. Voeg 675 ul verdunner twee microcentrifugebuizen gelabeld Onbekend verdunning 2 en 3. Het verdunningsmiddel wordt hetzelfde materiaal voor standaardcurve generatie.
      3. Serieel verdunnen verdunning 1 door de overdracht 75 ul van verdunning 1 in de verdunning 2 buis en mengen.
      4. Serieel verwaterdee verdunning 2 door de overdracht 75 ul van verdunning 2 in de verdunning 3 buis en mengen.
   2. Vloeibaar voedsel onbekenden (of andere complexe vloeibare monsters) Opmerking: De eerste testen wordt aanbevolen het volume van de bovenstaande vloeistof gewonnen uit verduidelijkt monsters zoals besproken in hoofdstuk 3 te bepalen. Verhoog steekproefgrootte indien nodig.
      1. Voeg ≥ 875 ul van de vloeistof onbekende een microcentrifugebuis.
      2. Voeg 1/10e volume 10x Neutralisering buffer aan het monster (bijv. 87,5 ul van een 875 pi monster).
      3. Het monster gedeeltelijk verduidelijken door centrifugeren gedurende 10 min bij 6000 xg en 4 ° C. Onmiddellijk Breng de bovenste naar een nieuwe buis. Dit is Onbekend verdunning 1.
      4. Voeg 675 ul verdunningsmiddel twee buizen gemerkte gekend verdunning 2 en 3. Het verdunningsmiddel zal hetzelfde verwerkt materiaal voor standaardcurve generatie.
      5. Serieel verdunnen verdunning 1 door overschrijvingring 75 ul van verdunning 1 in de verdunning 2 buis en mixen.
      6. Serieel verdunnen verdunning 2 door de overdracht 75 ul van verdunning 2 in de verdunning 3 buis en mengen.
   3. Vast voedsel onbekenden (of andere vaste monsters) Opmerking: De eerste testen wordt aanbevolen om het volume van de bovenstaande vloeistof gewonnen uit verduidelijkt monsters zoals besproken in hoofdstuk 3 te bepalen. Verhoog steekproefgrootte indien nodig.
      1. Weeg 2 g vast onbekend monster in een 50 ml conische buis.
      2. Voeg 2 ml GPB (1 ml GPB / g voedsel) aan de 2 g monster van vaste stof.
      3. Meng de monsters zoals beschreven in paragraaf 3.2.3.2.
      4. Voeg 1/10e volume van 10x neutralisatie buffer om de steekproef op basis van de geschatte totale volume (bv. 0,4 ml als het volume 4 ml). Meng monsters goed door.
      5. Het monster gedeeltelijk verduidelijken door centrifugeren gedurende 10 min bij 6000 xg en 4 ° C. Immediately overdracht ≥ 750 ul supernatant naar een microcentrifugebuis. Dit is Onbekend verdunning 1.
      6. Voeg 675 ml verdunning twee buizen gemerkte gekend verdunning 2 en 3. Het verdunningsmiddel zal hetzelfde verwerkt materiaal voor standaardcurve generatie.
      7. Serieel verdunnen verdunning 1 door de overdracht 75 ul van verdunning 1 in de verdunning 2 buis en mengen.
      8. Serieel verdunnen verdunning 2 door de overdracht 75 ul van verdunning 2 in de verdunning 3 buis en mengen.

4. Final Sample Verduidelijking

Als testvloeistof of vaste voedselsteekproeven, centrifuge alle monsters gedurende 5 min bij 14.000 xg ≥ in een microcentrifuge om volledige opheldering de monsters. Verwijder direct de bovenstaande vloeistoffen en over te dragen aan nieuwe buizen.

5. Plaat Setup en BoNT / A Pull Down

1. De specifieke plaat indeling is afhankelijk van de toepassing, maar niet de buitenwereld putten gebruiken om zonaar de rand te voorkomen. Elk onbekend monster en de standaard curve monster D1-D8 vereist 3 putten terwijl monster D9 vereist 6 putten. Een voorgestelde plaatindeling wordt getoond in Figuur 1.
2. Voeg 20 ul 10x bindingsbuffer aan elk putje worden gebruikt.
3. Voeg 200 pi van elke verdunning verduidelijkt en onbekende aan elk van drie putjes (zes putjes D9) voor drievoud getest. Meng de plaat gedurende 10 sec op een microplaat mixer.
4. Voeg het IP-A kralen.
   1. Vortex het IP-A kralen voor 10 seconden op de hoogste snelheid. Verder wervelen als korrels niet volledig geresuspendeerd en homogeen.
   2. Pipetteer 20 ul IP-A-parels aan elk monster ook.
   3. Meng de plaat gedurende 30 seconden op een microplaat mixer.
5. Incubeer de plaat met behulp van een roterende plaat incubator gedurende 2 uur bij 750 rpm, 25 ° C of kamertemperatuur. Assay prestaties sterk afhankelijk van het genereren en onderhouden van de IP-A kralensuspensie tijdens alle incubatiestappen. Altijd resuspendeer kralen met een microplaat mixer na pelletiseren en onderhouden van de suspensie op met een orbitale microtiterplaat shaker tijdens alle incubatie stappen.

6. Plaat Wassen en Kraal Resuspension

1. Was de platen met de hand of met behulp van een magnetische kraal-compatibele geautomatiseerde plaatwasser. Een geautomatiseerde plaatwasser geconfigureerd voor magnetische korrels verhoogt assay doorvoer.
   1. Handmatig wassen
      1. Label een 50 ml conische buis "1x Wash buffer" en voeg 45 ml moleculaire biologie kwaliteit water en 5 ml 10x Matrix Wash Buffer. Meng buffer goed door.
      2. Verwijder de plaat uit de roterende plaat incubator.
      3. Doe de plaat onmiddellijk op een 96-well magnetisch bolletje scheiding plaat gedurende 5 minuten.
      4. Terwijl de plaat op de 96-well magnetische kraal scheiding plaat, verwijder voorzichtig en gooi de bovenstaande vloeistoffen uit de steekproef putten met behulp van een single-of multi-channel pipet. Niet aspirerenkralen-visueel toezicht op de aangezogen buffer in de pipet tip voor toevallige kraal verwijderen. Als het verwijderen is getuige, voorzichtig voeg de inhoud tip terug naar de bron, reseparate, en herhaal de verwijdering.
      5. Voeg 300 ul 1x Wash buffer aan elk monster ook.
      6. Volledig resuspendeer de korrels door mengen van de plaat gedurende 30 seconden op een microplaat mixer.
      7. Incubeer de plaat op de 96-well magnetische bead scheidingsplaat gedurende 2 minuten.
      8. Verwijder en gooi de bovenstaande vloeistoffen uit de steekproef putjes goed als voorheen.
      9. Herhaal stap 6.1.1.5-6.1.1.8 drie keer voor een totaal van 4 wasbeurten.
      10. Met de plaat op de 96-well magnetische kraal scheiding plaat visueel op de putten zelfs supernatant verwijderen te bevestigen, gebruik een pipet om overtollig resterende buffer indien nodig te verwijderen. Sommige buffer zal in de putten te blijven en de zorg moeten worden genomen om kraal verwijdering of kraal voorkomen dat ze uitdrogen.
      11. Voeg 50 ul 1x Reaction buffer aan elk monster goed en meng de plaat gedurende 30 sec op een microplaat mixer volledig resuspendeer de kralen. Indien nodig, gebruik dan een pipet om volledig resuspendeer de kralen.
   2. Geautomatiseerde Plate Wassen
      1. Setup en het programma van de wasmachine volgens tabel 4. Reinig en spoel de wasmachine met een hoge kwaliteit (bijv. nanozuiver) water.
      2. Prime de ring door het uitvoeren van het programma "Prime".
      3. Verwijder de plaat uit de roterende plaat incubator.
      4. Doe de plaat onmiddellijk op de 96-well magnetische kraal scheiding plaat op de plaat wasmachine.
      5. Ren de link programma "Master Wash". Het eerste programma stap is een 5 minuten incubatie stap waar de wasmachine stilstaat.
      6. Volgende programma voltooiing, verwijder de plaat uit de wasmachine, voeg 50 ul 1x Reaction buffer aan elk monster goed, en meng de plaat gedurende 30 seconden op een microplaat mixer volledig resuspendeer de kralen. Indien nodig, gebruik dan een pipet om volledig resuspendeer de kralen.

7. Assay Initiatie en incubatie

1. Voeg 50 ul 0,5 uM A / E reporter (zie hoofdstuk 1) aan elk monster goed en meng gedurende 30 seconden op een microplaat mixer volledig resuspendeer de kralen.
2. Voeg 100 ul water aan elke ongebruikte goed op de plaat naar de rand effecten te voorkomen.
3. Dicht de plaat met plaat afdichtband en incubeer de plaat met behulp van een roterende plaat incubator bij 750 rpm, 25 ° C of RT. Bescherm de plaat van licht tijdens de incubatie.

8. Dataverzameling en-analyse

Opmerking: Deze test is een real-time test die meerdere malen kan worden gemeten tot de gewenste gevoeligheid wordt verkregen, er geen stop reagentia vereist. Aanbevolen initiële leestijden zijn 2, 4 en 24 uur incubatie met assay gevoeligheid toeneemt met incubatietijd.

1. Het verzamelen van gegevens
   1. Bij elke lezen, haal de plaat uit de roterende plaat incubator, verwijder het zegeling tape, en onmiddellijk het bord op de 96-well magnetische kraal scheiding plaat. Laat de korrels te scheiden voor 2 minuten.
   2. Plaats de plaat in de microplaatlezer en meet de emissies op ~ 470 en ~ 526 nm onder excitatie bij ~ 434 nm.
   3. Als er extra read tijden gewenst zijn, resuspendeer de kralen voor 30 seconden op de microplaat mixer, sluit de plaat, en de terugkeer van de plaat naar de roterende plaat incubator.
2. Data-analyse
   1. Bereken de emissie-ratio voor elk monster door de relatieve fluorescentie-eenheid (RFU) waarde te delen bij 526 nm door de RFU waarde bij 470 nm.
   2. Teken de emissie verhouding ten opzichte van de log [BoNT / A] voor de standaard curve datapunten. Afhankelijk van de BoNT / A potentie geteste, een sigmoïdale dosis-respons curve verkregen (zie Representatieve resultaten).
   3. Monteer de standaard curve gegevens met de variabele helling dosis-response curve Y = Bodem + (Boven-Onder) / (1 ​​10 ^ ((logEC _50-X) * hillslope)) waarbij X delogaritme van de concentratie, Y is het antwoord, en Y begint bij Bodem en gaat naar boven met een sigmoïdale vorm.
   4. Bepaal de detectielimieten (LOD), grenzen (LOQ), en half-maximale effectieve concentratie _(EC50). Detectielimieten worden gedefinieerd als een monster met een emissiegraad minder dan 3 standaarddeviaties (SD's) in de blanco controlegroep (n = 6). Bepaalbaarheidsgrenzen gedefinieerd als een monster met een emissiegraad minder dan 10 SDs onder de blanco controles (n = 6). _EC50 wordt bepaald uit de sigmoïdale dosis-respons curve fit.
   5. Interpoleer de potentie van een onbekende monsters tegen de sigmoïdale dosis-respons standaardcurve.
      1. Voor kwantitatieve resultaten, moet het onbekende monster idealiter binnen het lineaire gebied van de standaardcurve vallen. Benaderen het lineaire gedeelte van de standaard curve door het berekenen van de totale venster 20-80% assay respons (bv. indien de emissie verhouding van de standaard curve ranges 0,5-2,5, zou het lineaire bereik het deel van de standaardcurve die varieert 0,9-2,1 zijn).
      2. Voor kwalitatieve resultaten, vergelijken het onbekende monster tegen de LOD en LOQ van de standaard curve.
      3. Niet extrapoleren onbekende monsters buiten de grenzen van de standaard curve.

Results

Een diagram waarin de stappen beschreven protocol wordt getoond in figuur 2. De test vereist tussen 4-26 uur in beslag, afhankelijk van het type monster en de gewenste assaygevoeligheid, maar slechts ~ 2 uur van hands-on tijd. De test wordt uitgevoerd in 96-well platen en afhankelijk van het soort test wordt uitgevoerd, kan triplo getest tot 20 monsters waaronder normen per plaat.

Figuur 3 toont representatieve analyseresultaten met BoNT / A holotoxine spike...

Discussion

Dit protocol beschrijft de procedures voor het kwantificeren BoNT / A-complex, holotoxine of Clostridium kweeksupernatant in complexe matrices. Het protocol is hetzelfde, echter, bij het ​​testen van andere BoNT serotypen (bijv. BoNT / B, E en F) met hun respectievelijke Matrix assays ^56,60, hoewel assaygevoeligheid zullen verschillen en serotypes en assays. Dit protocol houdt geen rekening met elk type monster mogelijk enkele wijzigingen nodig zijn, afhankelijk van de specifieke vloeistofmo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit	BioSentinel	A1015	Detectie kits voor BoNT/B en F zijn ook beschikbaar.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader	Thermo Fisher Scientific	5250040	Meeste monochromator- of filter-gebaseerde units met 434 nm excitatie en 470 nm en 526 nm emissie mogelijkheid kunnen worden gebruikt.
96-well Magnetic Bead Separation Plate	V&P Scientific	VP771H	Andere magnetische platen kunnen worden gebruikt, maar de plaat moet worden ontworpen om de kralen naar de zijkant van de put te scheiden.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer	BioTek	ELx405 VSRM	Optioneel, alleen vereist voor geautomatiseerd plaat wassen.  Andere magnetische kralen-compatibele plaatwasmachines kunnen ook worden gebruikt, maar moeten worden getest voor gebruik.
Microcentrifuge			Optioneel, alleen vereist voor monsters die centrifugatie nodig hebben.
MixMate plate mixer	Eppendorf	22674200
Orbital Shaker			Gebruikt bij kamertemperatuur of bij 25 °C Als temperatuurcontrole beschikbaar is
EDTA-vrije Protease Inhibitor Tablets	Roche	4693132001	Alleen vereist voor voedsel- of milieutests. Protease-remmers moeten EDTA-vrij zijn.
BoNT/A	Metabiologics		Optioneel, alleen vereist voor standaardisatie en kwantificeringsdoeleinden
Zwarte, Platte bodem 96-well Platen	NUNC	237105	Platen mogen niet worden behandeld
96-well Plate Sealing Tape	Thermo Fisher Scientific	15036