De BoTest Matrix botulinum neurotoxine (BoNT) opsporingsanalyses snel te zuiveren en te kwantificeren BoNT uit een reeks van monstermatrices. Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van BoNT uit zowel vaste als vloeibare matrices en demonstreren van de test met BOTOX, tomaten en melk.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie en kwantificering van botulineneurotoxine uit complexe matrices gebruiken BoTest Matrix Testen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Nauwkeurige detectie en kwantificering van botulinum neurotoxine (BoNT) in complexe matrices is vereist voor de farmaceutische-, milieu-, en voedsel steekproeven. Rapid BoNT testen van levensmiddelen is nodig tijdens uitbraak forensisch onderzoek, patiënt de diagnose en voedselveiligheid testen is nauwkeurig de werkzaamheid is vereist voor BoNT-based drug fabricage van de producten en de veiligheid van de patiënt. Het op grote schaal gebruikt bioassay in muizen voor BoNT testen is zeer gevoelig, maar mist de precisie en doorvoer nodig is voor een snelle en routinematige BoNT testen. Bovendien is de bioassay's gebruik van dieren heeft geleid tot oproepen van geneesmiddel regelgevende instanties en voorstanders van dieren-rechten in de VS en het buitenland om de muis bioassay voor BoNT testen vervangen. Verschillende in vitro vervangende tests zijn ontwikkeld die goed werken met gezuiverd BoNT in eenvoudige buffers, maar de meeste niet aangetoond voor testen in zeer complexe matrices zijn. Hier, een protocol voor de detectie vanBoNT in complexe matrices met de BoTest Matrix assays gepresenteerd. De test bestaat uit drie delen: Het eerste deel omvat de voorbereiding van de monsters voor het testen, het tweede deel is een immunoprecipitatie stap met behulp van anti-BoNT-antilichaam beklede paramagnetische kralen te zuiveren BoNT uit de matrix, en het derde deel kwantificeert de geïsoleerde Bont proteolytische activiteit met behulp van een fluorogeen reporter. Het protocol is geschreven voor high throughput testen in 96-well platen met zowel vloeibare als vaste matrices en is ongeveer 2 uur handmatig preparaat met in totaal assay tijd van 4-26 uur, afhankelijk van het type monster toxine belasting en de gewenste gevoeligheid. Gegevens zijn weergegeven voor BoNT / A test met fosfaat gebufferde zoutoplossing, een geneesmiddel, kweeksupernatant, 2% melk en verse tomaten en omvat bespreking van kritische parameters voor de test succesvol.
Inleiding
Botulinum neurotoxinen (Bonts) zijn de dodelijkste bekende stoffen, met intraveneuze menselijke dodelijke doses geschat op 1-3 ng / kg 1,2. Zeven structureel vergelijkbare serotypen van BoNT, A tot en met G, bestaan elk uit een zware keten domein verantwoordelijk voor celbinding, opname en translocatie naar het cytosol en een lichte keten die een zink-endopeptidase 3-5 codeert. De exquise toxiciteit van BoNT voortvloeit uit, voor een deel, de specifieke binding en inwerking motorische neuronen in de neuromusculaire verbinding 6. Eenmaal binnen het neuron, het lichte keten endopeptidase splitst specifiek een of meer van de oplosbare ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van Assay Reagents
- Ontdooi 200x dithiothreitol (DTT), 10x Matrix bindingsbuffer (10x Binding buffer hierna), 10x neutralisatie buffer (pH alleen voedsel of onevenwichtige monsters) en BoTest 10x reactiebuffer (10X Reaction Buffer hierna) bij kamertemperatuur (KT) gedurende 15 min of totdat het volledig ontdooid. Zie tabel 1 voor een overzicht van buffers en reagentia die in dit protocol. Zie tabel 2 voor een lijst van materialen en apparatuur die nodig is voor dit protocol.
- Vortex de ontdooide buffers 5 seconden om te mengen. 10x neutralisatiebuffer 200xDTT en 10x Reaction buffer moet duidelijk zicht....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een diagram waarin de stappen beschreven protocol wordt getoond in figuur 2. De test vereist tussen 4-26 uur in beslag, afhankelijk van het type monster en de gewenste assaygevoeligheid, maar slechts ~ 2 uur van hands-on tijd. De test wordt uitgevoerd in 96-well platen en afhankelijk van het soort test wordt uitgevoerd, kan triplo getest tot 20 monsters waaronder normen per plaat.
Figuur 3 toont representatieve analyseresultaten met BoNT / A holotoxine spike.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft de procedures voor het kwantificeren BoNT / A-complex, holotoxine of Clostridium kweeksupernatant in complexe matrices. Het protocol is hetzelfde, echter, bij het testen van andere BoNT serotypen (bijv. BoNT / B, E en F) met hun respectievelijke Matrix assays 56,60, hoewel assaygevoeligheid zullen verschillen en serotypes en assays. Dit protocol houdt geen rekening met elk type monster mogelijk enkele wijzigingen nodig zijn, afhankelijk van de specifieke vloeistofmo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
FM Dunning, TM Piazza, F. Zeytin, en WC Tucker zijn medewerkers of eigenaren van BioSentinel Inc BioSentinel momenteel produceert en commercialiseert een aantal van de reagentia die in dit rapport.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag H. Olivares en D. Ruge bedanken voor waardevolle discussies en adviezen. Dit onderzoek werd mede ondersteund door een NSF SBIR award (IIP-1127245 om BioSentinel Inc) en het Ministerie van Defensie contract (W81XWH-07-2-0045 te BioSentinel Inc).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit | BioSentinel | A1015 | Detectie kits voor BoNT/B en F zijn ook beschikbaar. |
| Varioskan Flash fluorescence microplate reader | Thermo Fisher Scientific | 5250040 | Meeste monochromator- of filter-gebaseerde units met 434 nm excitatie en 470 nm en 526 nm emissie mogelijkheid kunnen worden gebruikt. |
| 96-well Magnetic Bead Separation Plate | V&P Scientific | VP771H | Andere magnetische platen kunnen worden gebruikt, maar de plaat moet worden ontworpen om de kralen naar de zijkant van de put te scheiden. |
| Magnetic Bead-Compatible Plate Washer | BioTek | ELx405 VSRM | Optioneel, alleen vereist voor geautomatiseerd plaat wassen. Andere magnetische kralen-compatibele plaatwasmachines kunnen ook worden gebruikt, maar moeten worden getest voor gebruik. |
| Microcentrifuge | Optioneel, alleen vereist voor monsters die centrifugatie nodig hebben. | ||
| MixMate plate mixer | Eppendorf | 22674200 | |
| Orbital Shaker | Gebruikt bij kamertemperatuur of bij 25 °C Als temperatuurcontrole beschikbaar is | ||
| EDTA-vrije Protease Inhibitor Tablets | Roche | 4693132001 | Alleen vereist voor voedsel- of milieutests. Protease-remmers moeten EDTA-vrij zijn. |
| BoNT/A | Metabiologics | Optioneel, alleen vereist voor standaardisatie en kwantificeringsdoeleinden | |
| Zwarte, Platte bodem 96-well Platen | NUNC | 237105 | Platen mogen niet worden behandeld |
| 96-well Plate Sealing Tape | Thermo Fisher Scientific | 15036 |
Referenties
- Arnon, S. S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. 285, 1059-1070 (2001).
- Gill, D. M. Bacterial toxins: a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 46, 86-94 (1982).
- Montal,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
