ECM Eiwit nanovezels en nanostructuren Engineered behulp-Surface geïnitieerde Vergadering

Samenvatting

Werkwijze voor nanovezels en complexe nanostructuren verkrijgen uit een of meerdere extracellulaire matrixeiwitten beschreven. Deze methode maakt gebruik van proteïne-oppervlak interacties vrijstaande eiwit gebaseerde materialen maken met instelbare samenstelling en architectuur voor gebruik in een verscheidenheid van tissue engineering en biotechnologische toepassingen.

Samenvatting

De extracellulaire matrix (ECM) in weefsels wordt gesynthetiseerd en geassembleerd door cellen Een 3D-fibrillaire, eiwitten zullen vormen met strak gereguleerd vezeldiameter, samenstelling en organisatie. Naast het verlenen van structurele steun, de fysische en chemische eigenschappen van de ECM speelt een belangrijke rol in verschillende cellulaire processen, waaronder hechting, differentiatie en apoptose. In vivo wordt het ECM geassembleerd door blootstelling cryptische zelfassemblage (fibrillogenese) locaties binnen proteïnen . Dit proces verschilt voor verschillende eiwitten, maar fibronectine (FN) fibrillogenese is goed gekarakteriseerd en dient als een modelsysteem voor cel-gemedieerde ECM montage. Specifiek cellen gebruiken integrine receptoren op het celmembraan FN dimeren en actomyosine gegenereerde contractiele krachten binden ontvouwen en bloot bindingsplaatsen voor montage in onoplosbare vezels. Deze receptor gemedieerde proces maakt cellen te monteren en het organiseren van de ECM van de cellulaire weefsel scales. Hier presenteren we een oppervlak geïnitieerde genaamde methode samenstel (SIA), die celgemedieerde matrix samenstel recapituleert met proteïne-oppervlak interacties ECM eiwitten ontvouwen en assembleren in onoplosbare vezels. Eerst worden ECM eiwitten geadsorbeerd op een hydrofoob polydimethylsiloxaan (PDMS) oppervlak waar ze gedeeltelijk denatureren (uitgevouwen) en cryptische bindende domeinen bloot. Ongevouwen eiwitten worden vervolgens overgebracht in welbepaalde micro-en nanopatronen via microcontact printen op een thermisch gevoelige poly (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) oppervlak. Thermisch geactiveerd ontbinding van de PIPAAm leidt tot eindassemblage en het vrijkomen van onoplosbare ECM eiwitten nanovezels en nanostructuren met goed gedefinieerde geometrieën. Complexe architecturen zijn mogelijk door technische gedefinieerde patronen op de PDMS stempels gebruikt voor microcontact afdrukken. Naast FN kan SIA proces gebruikt laminine, fibrinogeen en collageen type I en IV van meerdere componenten ECM nanostruc creërenturen. Aldus kan SIA worden gebruikt om ECM-eiwitten gebaseerde materialen ingenieur nauwkeurige controle over de eiwitsamenstelling, vezelvorm en steiger architectuur om de structuur en samenstelling van de ECM recapituleren in vivo.

Inleiding

De extracellulaire matrix (ECM) in weefsels bestaat uit multifunctionele proteïnen betrokken bij fysische en chemische regulatie van verschillende celprocessen zoals hechting, proliferatie, differentiatie en apoptose ^1-3. De ECM wordt gesynthetiseerd, geassembleerd, en georganiseerd door de cellen en de samenstellende eiwitfibrillen hebben unieke composities, vezelgrootte, geometrieën en onderling verbonden architecturen die variëren met het type weefsel en het ontwikkelingsstadium. Recent onderzoek heeft aangetoond dat de ECM leerzame aanwijzingen kan geven aan cellen om gemanipuleerde weefsels maken ^4, wat suggereert dat recapituleren de ECM in termen van samenstelling en structuur kan de ontwikkeling van biomimetische materialen zorgen voor tissue engineering en biotechnologische toepassingen leiden.

Een aantal fabricage methoden ontwikkeld polymere scaffolds die aspecten van de ECM kunnen nabootsen in weefsels ingenieur. Bijvoorbeeld, elektrospinnen en fase gescheidenatie hebben zowel vermogen gedemonstreerd poreuze matrices van vezels te vormen met een diameter van enkele tientallen micrometers tot tientallen nanometers ^5-7. Beide technieken hebben ook aangetoond dat zeer poreuze matrices van nanovezels cel adhesie en infiltratie in de scaffold ⁸ kan ondersteunen. Echter, deze aanpak beperkt in de mogelijke vezel geometrieën, oriëntaties en 3D-architecturen die kunnen worden gemaakt. Electrospinning geeft gewoonlijk steigers met ofwel willekeurig georiënteerde of zeer gerichte vezels terwijl fasescheiding produceert steigers met willekeurig georiënteerde vezels. Er zijn ook beperkingen op de materialen, met onderzoekers gewoonlijk gebruik van synthetische polymeren, zoals poly (ε-caprolacton) ⁸ en poly (melkzuur-co-glycolzuur) ^9, die vervolgens worden bekleed met ECM eiwitten celadhesie bevorderen. Natuurlijke biopolymeren worden ook gebruikt, zoals collageen type I ^{10, 11} gelatine, fibrinogeen ^12,chitosan ^13, en zijde ^14, maar vertegenwoordigen slechts een klein deel van de eiwitten in de eigen weefsel. De meeste weefsels bevatten een groter milieu van ECM eiwitten en polysacchariden zoals fibronectine (FN), laminine (LN), Type IV collageen en hyaluronzuur die moeilijk of onmogelijk te nanovezels Bestaande methoden fabriceren zijn.

Om deze uitdaging aan te pakken, hebben we onze onderzoeksinspanningen op het nabootsen van de manier waarop cellen synthetiseren, assembleren en te organiseren ECM eiwitfibrillen in hun omgeving gericht. Hoewel de specifieke fibrillogenese proces varieert voor verschillende ECM eiwitten typisch een conformationele verandering van de ECM eiwitmolecuul wordt veroorzaakt door een enzymatische of-receptor veroorzaakte interactie, die cryptische zelfassemblage plaatsen blootstelt. Hier gebruiken we FN als modelsysteem om beter inzicht in de fibrillogenese proces. Kort FN homodimeren binden aan integrine receptoren op het celoppervlak via de RGD aminozuursequentie in het 10e type IIIk herhaal eenheid. Eenmaal gebonden, de integrines uit elkaar via actomyosine contractie en vouw de FN dimeren cryptische zelfassemblage websites bloot. De blootstelling van deze FN-FN bindingsplaatsen kan de FN dimeren te monteren in een onoplosbare fibrillen direct aan het celoppervlak ^15. Werk in cel-vrije systemen heeft aangetoond dat cryptische FN-FN bindingsplaatsen kunnen worden onthuld door ontvouwen behulp denatureermiddelen ¹⁶ of oppervlaktespanning bij een lucht-vloeistof-vaste stof grensvlak ^17-19. De FN vezels die door deze technieken zijn beperkt tot specifieke vezels afmetingen en geometrieën en zijn meestal gebonden aan een oppervlak.

Hier beschrijven we een aanpak genoemd oppervlak geïnitieerd assemblage (SIA) ²⁰ dat deze beperkingen overwint door gebruik te maken van eiwit-oppervlakte interacties tot vrijstaande onoplosbare nanovezels, nanofabrics (2D vellen) en andere nanostructuren bestaande uit een of meerdere ECM eiwitten (figuur 1 maken ). In dit process, worden ECM eiwitten geadsorbeerd uit een compacte, bolvormige conformatie in oplossing en gedeeltelijk gedenatureerd (uitgevouwen) op een patroon, hydrofoob polydimethylsiloxaan (PDMS) stempel. De ECM eiwitten worden dan overgebracht in deze toestand op een thermisch responsieve poly (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) oppervlak door microcontact afdrukken ^22. Wanneer gehydrateerd met 40 ° C water de PIPAAm blijft solide, maar wanneer afgekoeld tot 32 ° C het door een lagere kritische oplostemperatuur (LCST) wanneer hydrofiel wordt geeft zwelt met water en vervolgens lost, loslaten van de geassembleerde ECM nanostructuren uit van het oppervlak. De SIA methode biedt controle over de afmetingen met nanometer-schaal precisie. Door het regelen van belangrijke parameters zoals de samenstelling, vezel geometrie en architectuur, is het mogelijk om vele eigenschappen van de ECM gevonden in vivo recapituleren en geavanceerde steigers voor tissue engineering en biotechnologische toepassingen te ontwikkelen.

Protocol

1. Fabricage van Master Mold Met behulp Fotolithografie

1. De ECM-eiwit nanovezels, nanofabrics en nanostructuren worden gefabriceerd worden eerst ontworpen met behulp van Computer Aided Design (CAD)-software. Deze CAD-bestand wordt vervolgens overgebracht naar een fotomasker. Het type fotomasker hangt af van de resolutie van de functies; met een-transparantie basis photomask voldoende voor functie maten omlaag naar ~ 10 micrometer. Kleinere functies <10 urn zal een chromen op glas fotomasker nodig. Alle van de nanovezels en nanostructuren hier gepresenteerd werden vervaardigd met behulp van een op transparantie gebaseerde photomask, en dus waren nanometerschaal in dikte, maar niet laterale dimensies.
   Opmerking: Het is belangrijk om onderscheid te maken welke regio's van de fotomasker donker zal zijn (voorkomen dat UV-licht door) en die transparant zullen (laten UV-licht door te laten), omdat dit, samen met de aard van de fotolak (positief of negatief) , zal de uiteindelijke topografie van de meester mal dicteren.
2. Voor fabricage van de master schimmel begint, gedehydreerd een 4 "siliciumwafel door het op een kookplaat ingesteld op 150 ° C gedurende 15 minuten.
3. Centreer de wafer op het vacuüm boorkop van een spin-coater. Giet SU8-2015 negatieve fotoresist op het midden van de wafel en verder gieten in concentrische cirkels tot ongeveer tweederde van de wafel bedekt.
   Opmerking: Bewaar de fles SU8 dicht bij de wafer bij gieten om de vorming van luchtbellen te minimaliseren.
4. Programmeer de spincoater als volgt:
   • Spread cyclus: 500 rpm met een versnelling van 100 rpm / sec gedurende 10 sec.
   • Centrifuge: 4000 rpm met een versnelling van 100 rpm / sec gedurende 30 sec.
   Opmerking: Deze spincoating recept zal een fotoresistlaag die ~ 10 pm dik te vormen. Door de draaisnelheid of de SU8 formulering kan de dikte worden aangepast.
5. Zachte bak de wafer door het op een kookplaat ingesteld tot 95 ° C gedurende 3 minuten.
6. Expose de wafer met UV-licht doorhet fotomasker voor een totale dosering van 140 mJ / cm ^2.
   Opmerking: SU8 is een negatieve fotolak ook regio's waar UV-licht is in staat om door de photomask te passeren na het ontwikkelen blijft en wordt opgevoed functies op de meester mal.
7. Na blootstelling bak de wafer door het op een kookplaat ingesteld op 95 ° C gedurende 4 minuten.
8. Ontwikkel de wafer door het in SU8 ontwikkelaar voor 3 minuten. Na 3 minuten, spoel de wafer met isopropylalcohol. Indien een witte film wordt geproduceerd tijdens het spoelen, wordt de wafel niet volledig ontwikkeld en moet weer in de ontwikkelaar nog 30 seconden worden geplaatst. Spoel opnieuw met isopropylalcohol. Herhaal dit proces tot een witte film niet gevormd tijdens de isopropylalcohol spoelen.
9. Droog de wafer in een stikstofstroom en in een 150 mm petrischaal bescherming tegen stof.

2. Het maken van de PDMS Postzegels

1. Bereid de PDMS prepolymeer door het combineren van het elastomeer basis en verharder in een10:01 w / w verhouding. Typisch 80 g basis en 8 g verharder worden gebruikt om te zorgen voor voldoende PDMS aan de master schimmel in een 1 cm dikke laag bedekken.
2. Mix en ontgas de PDMS met een middelpuntzoekende mixer ingesteld op het volgende:
   • Mix: 2.000 rpm gedurende 2 min.
   • Ontgas: 2.000 rpm gedurende 2 minuten.
3. Als een mixer niet beschikbaar is meng de PDMS met de hand gedurende 10 minuten met behulp van een 10 ml serologische pipet. Ontgas het mengsel door het in een vacuüm exsiccator gedurende 30 minuten om luchtbellen te verwijderen.
4. Giet genoeg PDMS pre-polymeer over de meester mal (patroon silicium wafer) aan een 1 cm dikke laag te vormen. Hard de PDMS door bakken bij 65 ° C gedurende 4 uur en bij kamertemperatuur gedurende 48 uur.
5. Eenmaal uitgehard, kunnen de gebieden met de patronen worden uitgesneden om de PDMS postzegels vormen. Om de functie zijkant te onderscheiden van de achterkant van de PDMS stempel, snijd een inkeping uit een van de hoeken aan de achterzijde van de stempel.

3. Microcontact Printing van ECM Patterns

1. Clean 25 mm diameter glazen dekglaasjes door sonicatie in 95% ethanol gedurende 1 uur en vervolgens droog in een 65 ° C oven.
2. Bereid de PIPAAm oplossing door het oplossen PIPAAm in 1-butanol in een concentratie van 10% (w / v, kenmerkend 1 g in 10 ml).
3. Centreer een glazen dekglaasje op de vacuümklem van de spincoater en pipet 200 ul van de oplossing PIPAAm zodat het volledige glasoppervlak bedekt.
4. Spincoat het dekglaasje bij 6.000 rpm gedurende 1 minuut.
5. Reinig de PDMS stempels door sonicatie in 50% ethanol gedurende 30 minuten en vervolgens droog onder een stikstofstroom.
   Opmerking: Drogen en volgende stappen moeten in een bioveiligheid kast worden uitgevoerd om de steriliteit voor toepassingen waar de ECM nanostructuren zal worden gebruikt met cellen te behouden.
6. Coat het patroon oppervlak van elke PDMS stempel met 200 pl van de eiwitoplossing, typisch 50 ug / ml in steriel gedestilleerd water FN. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
   Opmerking: This coating volume voor een 1,5 cm ² PDMS stempel en moeten worden aangepast aan de grootte van de PDMS stempel, de ECM eiwitten gebruikt en de concentratie van de ECM eiwitten in oplossing.
7. Was de PDMS stempels in gedestilleerd water om overtollig eiwit en goed afdrogen onder een stroom van stikstof te verwijderen.
   Opmerking: Al het water links op de stempel zal de voortijdige ontbinding van de PIPAAm coating triggeren op het dekglaasje blokkeren en de correcte eiwit overdracht.
8. Voor steriele fabricage, plaatst de PIPAAm-gecoate dekglaasjes in een gesloten petrischaaltje en steriliseer behulp van UV-blootstelling, 45 min onder de UV licht in een bioveiligheid kast is voldoende. Als steriliteit niet nodig deze stap worden weggelaten.
9. Voer microcontact afdrukken door het plaatsen van de functie van het PDMS stempel in contact met de PIPAAm-gecoate dekglaasje. Indien nodig, een tang om licht te tikken op de achterkant van de stempels om eventuele luchtbellen te verwijderen en zorgen voor een gelijkmatige contact.
10. Na 5 kmn, trek het PDMS stempel van het dekglaasje.
11. In dit stadium kunnen andere ECM eiwitten worden gevormd om complexere en multicomponent structuren. Tot 3 drukken zijn geverifieerd om te werken met dit proces, en meer kan haalbaar zijn.

4. Vrijgave van ECM nanovezels en nanostructuren

1. Plaats de patroon PIPAAm gecoate dekglaasje in een 35 mm petrischaal en inspecteer het patroon trouw gebruik fasecontrastmicroscopie. Afhankelijk van het patroon kan een CCD-camera nodig zijn om de kenmerken van de patroon lossen. Fluorescentie microscopie kan worden gebruikt om het patroon ontvangen de ECM eiwitten fluorescent gelabelde inspecteren.
2. Voeg 3 ml van 40 ° C gedestilleerd water aan de petrischaal en laat het water geleidelijk afkoelen.
3. Het oplossen van de PIPAAm laag en de afgifte van het ECM-eiwit patronen kunnen worden gevolgd met fasecontrastmicroscopie. Als de toepassing het gebruik van optische tec niet toelaathniques de vrijgave kan worden gevolgd door meting van de temperatuur van de oplossing. Typisch wordt het water gekoeld tot kamertemperatuur, ver onder de LCST van PIPAAm (32 ° C) die de ECM eiwitten nanostructuren zijn vrijgegeven.
4. Na de release, zijn de nanovezels, nanofabrics en andere nanostructuren in het water drijven. Om ze te gebruiken voor verdere toepassingen moeten ze worden gemanipuleerd. De exacte benadering is afhankelijk van het experimentele doel en kunnen stappen zoals immobiliseren op een oppervlak bewegen met een micromanipulator systeem of inbedding in een hydrogel.

Resultaten

SIA is in staat technische ECM-eiwit nanovezels met nauwkeurige controle over afmetingen vezels. Om dit aan te tonen, werden arrays van FN nanovezels met vlakke afmetingen van 50 x 20 micrometer patroon op een PIPAAm gecoate dekglaasje (Figuur 2A). Na het loslaten, de vezels gecontracteerd omdat ze onder een inherente pre-stress als patroon op de PIPAAm oppervlak (Figuur 2B). Analyse van de FN nanovezels bleek zij monodisperse pre-release met een gemiddelde lengte van 50,19 ± 0,49 pm en...

Discussie

De SIA-methode hier gepresenteerde bootst cel gemedieerde matrix assemblage en maakt de engineering van ECM eiwitten nanovezels en nanostructuren met variabele grootte, organisatie en samenstelling. Hoewel niet identiek zijn aan-cel gegenereerd ECM, SIA creëert ECM bestaat uit nanoschaal eiwitfibrillen ²⁰ dat omkeerbaar vouwen ondergaan / ontvouwen tijdens mechanische belasting ²¹ en kunnen cellen binden ^20. Dit biedt een unieke mogelijkheid om ECM-eiwit materiaal dat veel eigenschappen ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm	Polysciences	21458-10	40,000 Mw
Sylgard 184 Silicone kit (PDMS)	Dow Corning		Mix 10 delen basis met 1 deel uitharder.
Butanol
Fibronectin	BD biosciences	354008	Menselijke, 1mg
Laminin	BD biosciences	354239	Ultrazuiver, muis, 1mg
Negative Photoresist	Microchem	SU8-2015
SU8 Developer	Microchem
Sonicator Branson M3510	Branson Ultrasonic Corporation	CPN-952-318
Thinky ARE-250 Mixer	Thinky Corporation
Spincoater	Specialty Coating Systems	G3P-8
Glazen deksel 25mm diameter, No 1.5	Fisher Scientific	12-545-86