Het analyseren Craniofacial Morphogenesis in zebravis behulp 4D confocale microscopie

Summary

Time-lapse confocale beeldvorming is een techniek nuttig voor het karakteriseren van embryonale ontwikkeling. Hier beschrijven we de methode karakteriseren craniofaciale morfogenese in wildtype en PDGFRA, Smad5 en SMO mutant embryo's.

Abstract

Time-lapse beeldvorming is een techniek waarmee de directe observatie van het proces van morfogenese of het genereren van vorm. Door hun optische helderheid en ontvankelijkheid voor genetische manipulatie, heeft de zebravis embryo uitgegroeid tot een populaire modelorganisme waarmee time-lapse analyse van morfogenese voeren in levende embryo's. Confocale beeldvorming van een levende zebravis embryo vereist dat een van belang zijnd weefsel aanhoudend is gemerkt met een fluorescerende marker, zoals een transgen of geïnjecteerd kleurstof. De werkwijze vereist dat het embryo wordt verdoofd en bewaard op zodanige wijze dat gezonde ontwikkeling normaal verloopt. Parameters voor de beeldvorming moet worden ingesteld om rekening te houden driedimensionale groei en aan de eisen van het oplossen van individuele cellen terwijl het krijgen van snelle snapshots van ontwikkeling in evenwicht te brengen. Onze resultaten tonen het vermogen om op lange termijn te voeren in vivo beeldvorming van fluorescentie gelabelde zebravis embryo en gevarieerde weefsel gedrag detecterende craniale neurale dat craniofaciale afwijkingen veroorzaken. Ontwikkelingsstoornissen vertragingen veroorzaakt door de anesthesie en montage zijn minimaal, en embryo's zijn ongedeerd door het proces. Time-lapse afgebeeld embryo's kunnen worden teruggestuurd naar vloeibaar medium en vervolgens afgebeeld of vastgesteld op latere punten in ontwikkeling. Met een toenemende overvloed van transgene zebravis lijnen en goed gekarakteriseerd lot mapping en transplantatie technieken beeldvorming elke gewenste weefsel mogelijk. Als zodanig, time-lapse in vivo beeldvorming combineert krachtig met zebravissen genetische methoden, waaronder analyses van mutant en gemicroinjecteerd embryo's.

Introduction

Craniofacial morfogenese is een complexe multi-step proces dat gecoördineerde interacties tussen verschillende celtypen vereist. De meeste craniofaciale skelet is afgeleid van neurale cellen, waarvan vele moeten migreren van de dorsale neurale buis in tijdelijke structuren genoemd pharynxbogen ^1. Zoals met veel weefsels, morfogenese van het craniofaciale skelet is ingewikkelder dan kan worden begrepen door statische beelden van embryo op specifieke ontwikkelingsstoornissen tijdstippen. Hoewel het tijdrovend om uit te voeren, in vivo time-lapse microscopie wordt een continu blik op cellen en weefsels een ontwikkelend embryo. Elk beeld in een time-lapse serie leent context aan de anderen, en helpt een onderzoeker stap in de richting afleiden waarom een verschijnsel optreedt in plaats van af te leiden wat er gebeurt op dat moment.

In vivo beeldvorming is dus een krachtig instrument voor beschrijvende experimentele benaderingendeconstrueren de routes die morfogenese begeleiden. De zebravis Danio rerio is een populaire genetisch model van gewervelde embryonale ontwikkeling, en is bijzonder geschikt voor in vivo beeldvorming van morfogenese. Modern, worden geschikte methodes voor transgenese en genomische modificatie snel voortschrijdende het aantal tools beschikbaar om zebravis onderzoekers. Deze tools verbeteren reeds robuuste methoden voor genetische manipulatie en microscopie. In vivo beeldvorming van bijna elk weefsel in bijna elke gewenste genetische context is dichter bij de werkelijkheid dan de fantasie.

Morfogenetische bewegingen van de pharynxbogen worden geleid door signalering interacties tussen de neurale lijst en de aangrenzende epitheel, zowel ectoderm en endoderm. Er zijn tal van signaalmoleculen door de epitheel uitgesproken dat nodig is om de morfogenese van craniofaciale skelet elementen te rijden zijn. Onder deze signaalmoleculen, Sonic Hedgehog (Shh) is van cruciaal belang fof craniofaciale ontwikkeling ^2-8. Shh wordt uitgedrukt door zowel de orale ectoderm en keelholte endoderm ^2,6,9,10. De expressie van Shh in het endoderm regelt morfogenetische bewegingen van de bogen ^10, het vormen van neurale binnen de bogen ¹⁰ en groei van het craniofaciale skelet ^11.

Bmp signalering is ook van cruciaal belang voor craniofaciale ontwikkeling ¹² en kunnen morfogenese van de pharynxbogen veranderen. BMP signalering regelt dorsale / ventrale patroonvorming van kuif binnen de pharynxbogen ^13,14. Verstoring van Smad5 in zebravis veroorzaakt ernstige palatinale defecten en een falen van de Meckel's kraakbeen om adequaat te smelten bij de middellijn ^15. Bovendien, de mutanten ook worden weergegeven verlagingen en smelten in het ventrale kraakbeen elementen, de ^{2e, 3e} en ^4e soms keelboog elementen gefuseerd aan de middellijn ¹⁵. Deze fusies suggereren sterk dat Bmp signalering leidt de morfogenese van deze pharyngeal elementen.

PDGF signalering is noodzakelijk voor craniofaciale ontwikkeling, maar heeft een onbekend rollen in keelboog morfogenese. Zowel de muis en zebravis PDGFRA mutanten hebben een diepgaande midfacial clefting ^16-18. Tenminste in de zebravis dit midfacial clefting is te wijten aan een falen van de juiste neurale lijst cel migratie ^16. Neurale cellen blijven PDGFRA uiten nadat ze de pharynxbogen hebt ingevoerd. Daarnaast worden Pdgf liganden uitgedrukt door gezichtsuitdrukkingen epitheel en in de pharynxbogen ^16,19,20, dus Pdgf signalering kan ook een rol spelen bij morfogenese van de pharynxbogen volgende migratie. Echter, analyses van de morfogenese van het pharynxbogen in PDGFRA mutanten zijn niet uitgevoerd.

Hier laten we zien in vivo confocale microscopie van pharynguleen-fase transgene zebravis en beschrijven van de morfogenese van het pharynxbogen binnen deze periode. We tonen verder aan weefsel gedragingen die worden beïnvloed door mutaties die de BMP PDGF en Shh signaleringsroutes verstoren.

Protocol

1. Dierhouderij en Mutant Allelen

1. Verhogen en ras zebravis als beschreven ^21.
2. Zebravis mutante allelen die in deze studie waren PDGFRA ^{B1059 16,} Smad5 ^{B1100 22} en SMO ^{b577 23.} Bronnen voor deze zebravis stammen omvatten Zirc.

2. Bereiding van oplossingen en implementeert

Opmerking: Alle oplossingen en werktuigen kunnen vooraf worden gemaakt en opgeslagen voor toekomstig gebruik.

1. Voeg embryo medium (EM) zoals eerder beschreven ^21.
2. Maak 4 g / L MS-222 (tricaïne). Los op 4 g dinatriumfosfaat (Na ₂ HPO ₄₎ in 450 ml steriel water. Voeg 2 g MS-222 aan de oplossing. Breng de pH binnen 7,0-7,2. Voeg steriel water tot een totaal volume van 500 ml.
3. Optioneel: Maak 4 g / L kruidnagelolie. Weeg 0,2 g pure kruidnagel olie in een 50 ml conische buis. Voeg EM tot een totaal volume van 50 ml. Bewaren bij 4 ° C.
4. Maak 3% methylcellulose. Breng 50 ml van EM + 0,1 M HEPES aan de kook. Haal van het vuur. Roer 1,5 g methylcellulose tot de oplossing homogeen is. Bewaren bij 4 ° C.
5. Voeg 0,2% agarose. Voeg 0,1 g agarose met 50 ml EM. Breng EM aan de kook in de magnetron of op een kookplaat en controleer of de agarose is opgelost. Aliquot in 500 gl volumes microcentrifugebuizen en bewaar bij 4 ° C. Opmerking: Volumes kan worden aangepast als dat nodig is.
6. Maak capillaire poken. Breng een druppel superlijm in een 0,9 mm ID capillair. Plaats een 4-5 cm lengte van 6 £ proef monofilament vislijn in het capillair zodanig dat ongeveer 3-4 mm van de lijn na het einde van de buis.
7. Maak twee overbrugd dekglaasjes per exemplaar. Super-lijm 22 x 22-1 dekglas op elk uiteinde van een 24 x 60-1 dekking van glas waardoor het midden vrij. Maak singles (1 kleine dekking van glas per einde) voor embryo's van minder dan een dag oud, verdubbelt (2 kleine deksel glazen bovenop elkaar per uiteinde) voor embryo 3:59 degen oud, of triples (3 kleine omslag bril op de top van elkaar per uiteinde) voor embryo's vijf dagen of ouder.
8. Vul een 10 ml spuit met een hoog vacuüm vet. Opmerking: Vacuüm vet dient als een kit om uitdroging van specimens gedurende lange perioden van tijd te voorkomen, en heeft een laag potentieel voor toxiciteit in vergelijking met meer volatiele kit.

3. Montage zebravis embryo's voor confocale microscopie (zie figuur 1)

1. Bereid verdoving medium. Smelt een hoeveelheid van 0,2% agarose door de magnetron in 20 seconden intervallen tot het volledig vloeibaar. Mix 8 gl MS-222 in 192 pl 0,2% agarose of 5 ul van 4 g / L kruidnagelolie in 195 ui van 0,2% agarose. Handhaven in een 42 ° C verwarmen blok. Let op: Langdurige blootstelling aan MS-222 veroorzaakt sterker vertraagde ontwikkeling dan kruidnagel olie doet in embryonale zebravis ^24.
2. Indien nodig: Handmatig dechorionate unhatched transgene embryo's te analyseren net vóór de analyse. Met behulp van een tang, langzaam tear het chorion open tot het embryo wordt bevrijd.
3. Verdoven van de zebravis embryo's. Voeg 1 ml van een 4 g / L voorraad van MS-222-24 ml van embryo media. Als alternatief, voeg 390 ul van 4 g / L kruidnagel olie 24 ml vis water ^24. Opmerking: Kruidnagel olie werkt langzaam, zodat het uitvoeren van deze stap minstens 15-20 minuten voor de time-lapse microscopie.
4. Plaats een kraal van vacuüm vet rond het centrum ruimte van een naar boven gerichte overbrugd dekglaasje. Duw langzaam het vacuüm vet uit de spuit, waardoor een gladde, ononderbroken strook die grenst aan en de binnenkant van de bruggen en de rand van het dekglaasje.
5. Spreid een cirkel van 4% methylcellulose in het midden van de gebrugde dekglaasje met een houten applicator.
6. Breng de embryo te beelden. Wanneer het embryo wordt verdoofd het op te stellen in een glazen pipet. Houd de pipet verticaal om het embryo te zinken naar de bodem van de vloeistof in de pipet. Beweeg de pipet in de agarose oplossing en laat het embryo te laten vallenin de agarose. Laat de vloeistof niet te verdrijven.
7. Plaats het monster. Teken enkele agarose-oplossing en het embryo in de pipet. Verdrijf het embryo in een druppel agarose oplossing bovenop de methylcellulose. Gebruik een capillair poker voor het embryo neerwaartse druk op de methylcellulose en oriënteren het embryo zoals gewenst voor de beeldvorming.
8. Seal het monster.
   1. Plaats een overbrugde dekglaasje op de top van de gemonteerde een, naar beneden gericht. Solliciteer gelijkmatige druk op beide zijden van de ingeklemd dekglaasjes tot de bruggen maken direct contact en de agarose druppel afdichtingen aan beide dekglaasjes. Controleer of de embryo goed is georiënteerd.
   2. Wrijf een houten applicator langs de glazen te glad uit scheuren en gaten in de vacuüm vet kraal. Veeg overtollig vet van de randen weg.

4. Time-lapse confocale beeldvorming van transgene zebravis embryo's

(Dit protocol is geoptimaliseerd voor een Zeiss LSM 710 confocale microscoop onsing ZEN imaging software, en kan worden aangepast voor gebruik met andere systemen.)

1. Activeren apparatuur. Zet de confocale microscoop en eventuele externe laser apparaten. Zet de computer is aangesloten op de confocale microscoop. Open confocale imaging software en selecteer "Start Systeem" om beeldopname besturingselementen opnieuw te gebruiken.
2. Bereid verwarmde podium. Verlaag de enscenering platform van de confocale microscoop en verplaats de objectieven uit positie. Vervang de standaard podium met een elektronisch verwarmde podium. Zet de bedieningseenheid voor de verwarmde podium en stel de temperatuur 29,5 ° C.
3. Plaats het model in het gezichtsveld. Plaats de gemonteerde monster op het podium. Verplaats de 20X objectief op zijn plaats en verhogen de enscenering platform. Activeer het zichtbare licht emitter en kijk door het oculair. Centreer hoofd van het embryo in het gezichtsveld.
4. Definieer experiment instellingen.
   1. Activeer fluorescentie kanalen door te selecterende fluorescente golflengte te detecteren en kies kleur opzoektabellen (LUT) voor elk kanaal. Gebruik eventueel handmatige bediening in de software aan te zetten de nodige lasers (bijv. 561 nm voor RFP). Voor elke fluorescentie kanaal, stel de laser intensiteit tot 10,0 en de fotomultiplier voltage (HV of winst) tussen 600-700. Stel de middeling tot 4 en de bitdiepte 16 bit.
   2. Activeer de Z-stack en tijdreeksen modules. Stel de pinhole voor een 5 micrometer of kleiner Z-resolutie, en stel de Z-interval voor de voorgestelde optimale afstand.
      Opmerking: In het algemeen, 5 urn Z-resolutie maakt elk beeld Z-stack snel genoeg worden verzameld een "momentopname" van het embryo op een bepaald tijdstip tegelijkertijd sanering van afzonderlijke cellen. Het verlagen van de middeling vermindert ook de hoeveelheid tijd die per beeld.
   3. Definieer de tijd tussen twee beelden (meestal 10-20 min) en de totale lengte van het experiment.
5. Stel positionelegegevens.
   1. Draai de camera om live-modus. Pas focus en verhogen laserintensiteit indien nodig fluorescentie te bekijken. Stel de digitale zoom tot 0,6 voor een breder zicht, indien gewenst.
   2. Plaats de fase zodanig dat alle structuren van belang zijn zichtbaar en er is ruimte in het gezichtsveld voor uitgroei dorsaal en ventraal. Focus via het embryo aan de boven-en ondergrenzen van de fluorescentie. Stel de eerste en laatste Z-stack slice posities ten minste 100 micrometer of meer buiten deze grenzen.
6. Optimaliseren van fluorescentie-intensiteit.
   1. Stel de weergave LUT aan indicator bereik. Fluorescerende structuren moet nu wit, en de rest van het gezichtsveld moet blauw (geen detectie) of zwart zijn.
   2. Verhoog HV / gain tot een niveau net onder waar verzadigd (rood) pixels verschijnen. Pas zo nodig gecompenseerd zodat een meerderheid van de achtergrond wordt niet gedetecteerd (blauw). Opmerking: Kleinere pinhole diameter en verhoogde laserintensiteit beide verbeteren image definitio, maar laserintensiteit moet laag gehouden worden om levende weefsels te behouden. Verhoogde HV / gain en pinhole diameter (<5 micrometer) zijn over het algemeen de voorkeur aan grotere laserintensiteit.
   3. Houd de pinhole diameter breed genoeg om beelden te verzamelen in een tijdig, gemiddeld sets tot 4. Het Z-interval moet altijd worden ingesteld op de voorgestelde optimale afstand voor de pinhole diameter. Voer korte scans (gemiddelde = 1) met verschillende instellingen, en gebruik de minimale laser intensiteit die gewenste resolutie bereikt.
7. Het experiment voor de gewenste tijdsduur. Daarna verwijder embryo uit de verwarmde podium en langzaam scheiden de dekglaasjes. Dompel het dekglaasje en embryo in EM in een 30 mm petrischaal. Met behulp van een glazen pipet voorzichtig te wassen het embryo uit van het dekglaasje en verwijder het dekglaasje van de petrischaal. Plaats het embryo in een 28,5 ° C incubator te blijven ontwikkelen.
8. Vergelijk groei. Na afloop van het experiment, individuele positieve Zstack beelden van-agarose gemonteerde broer embryo's die op dezelfde wijze werden opgevoerd met het model aan het begin van het experiment, maar zijn gerezen in EM in een 28,5 ° C incubator.
9. Meet pharynxbogen, indien nodig. Metingen kunnen worden uitgevoerd in een aantal confocale software suites. Metingen hier gevonden werden uitgevoerd met behulp Fiji25 door het importeren en Z-projecteren. Lsm dossiers van individuele frames.

Results

In wild-type embryo's, volgende neurale bevolking, de pharynxbogen verlengen langs de anterior / posterior en dorsale / ventrale assen tijdens het verplaatsen in een rostrale richting (Film 1). Op 30 uur na de bevruchting (HPF), de voorste / achterste lengte van de eerste keelboog ligt tussen 1,8-1,9 maal de dorsale / ventrale hoogte. Dorsale / ventrale rek verloopt gestaag, sneller dan anterieure / posterieure verlenging tot 36,5 HPF. Vanaf hier dorsale / ventrale hoogte plateaus ongeveer 104 micro...

Discussion

Time-lapse confocale microscopie is een krachtig hulpmiddel voor de analyse van ontwikkeling. Hier tonen we het nut van de methode in het bestuderen keelboog morfogenese in zebravis die mutant voor belangrijke signalerende wegen met behulp van een transgeen dat neurale lijst cellen etiketten zijn. In aanvulling op het weefsel niveau analyseert, time lapse analyses zijn ook van toepassing op analyses op een cellulair schaal ^28. Veel gebruikte zebravis methoden kunnen eveneens in time-lapse microscopie experime...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 lb Test monofilament line	Cortland Line Company	SLB16
Agarose I	Amresco	0710
Argon laser	LASOS Lasertechnik GmbH	LGN 3001
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C8106
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID	FHC	30-31-0
Clove oil	Hilltech Canada, Inc.	HB-102
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
Isotemp dry-bath incubator	Fisher Scientific	2050FS
Laser scanning microscope	Carl Zeiss AG	LSM 710
Magnesium sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Microscope cover glass, 22 x 22-1	Fisher Scientific	12-542-B
Microscope cover glass, 24 x 60-1	Fisher Scientific	12-545-M
Potassium chloride	Fisher Scientific	M-11321
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786
Sodium chloride	Fisher Scientific	M-11624
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S7907
TempController 2000-2	PeCon GmbH
Tricaine-S	Western Chemical, Inc.