Het analyseren Craniofacial Morphogenesis in zebravis behulp 4D confocale microscopie

Summary

Time-lapse confocale beeldvorming is een techniek nuttig voor het karakteriseren van embryonale ontwikkeling. Hier beschrijven we de methode karakteriseren craniofaciale morfogenese in wildtype en PDGFRA, Smad5 en SMO mutant embryo's.

Abstract

Time-lapse beeldvorming is een techniek waarmee de directe observatie van het proces van morfogenese of het genereren van vorm. Door hun optische helderheid en ontvankelijkheid voor genetische manipulatie, heeft de zebravis embryo uitgegroeid tot een populaire modelorganisme waarmee time-lapse analyse van morfogenese voeren in levende embryo's. Confocale beeldvorming van een levende zebravis embryo vereist dat een van belang zijnd weefsel aanhoudend is gemerkt met een fluorescerende marker, zoals een transgen of geïnjecteerd kleurstof. De werkwijze vereist dat het embryo wordt verdoofd en bewaard op zodanige wijze dat gezonde ontwikkeling normaal verloopt. Parameters voor de beeldvorming moet worden ingesteld om rekening te houden driedimensionale groei en aan de eisen van het oplossen van individuele cellen terwijl het krijgen van snelle snapshots van ontwikkeling in evenwicht te brengen. Onze resultaten tonen het vermogen om op lange termijn te voeren in vivo beeldvorming van fluorescentie gelabelde zebravis embryo en gevarieerde weefsel gedrag detecterende craniale neurale dat craniofaciale afwijkingen veroorzaken. Ontwikkelingsstoornissen vertragingen veroorzaakt door de anesthesie en montage zijn minimaal, en embryo's zijn ongedeerd door het proces. Time-lapse afgebeeld embryo's kunnen worden teruggestuurd naar vloeibaar medium en vervolgens afgebeeld of vastgesteld op latere punten in ontwikkeling. Met een toenemende overvloed van transgene zebravis lijnen en goed gekarakteriseerd lot mapping en transplantatie technieken beeldvorming elke gewenste weefsel mogelijk. Als zodanig, time-lapse in vivo beeldvorming combineert krachtig met zebravissen genetische methoden, waaronder analyses van mutant en gemicroinjecteerd embryo's.

Introduction

Craniofacial morfogenese is een complexe multi-step proces dat gecoördineerde interacties tussen verschillende celtypen vereist. De meeste craniofaciale skelet is afgeleid van neurale cellen, waarvan vele moeten migreren van de dorsale neurale buis in tijdelijke structuren genoemd pharynxbogen ^1. Zoals met veel weefsels, morfogenese van het craniofaciale skelet is ingewikkelder dan kan worden begrepen door statische beelden van embryo op specifieke ontwikkelingsstoornissen tijdstippen. Hoewel het tijdrovend om uit te voeren, in vivo time-lapse microscopie wordt een continu blik op cellen en weefsels een ontwikkelend embryo. Elk beeld in een time-l....

Protocol

1. Dierhouderij en Mutant Allelen

1. Verhogen en ras zebravis als beschreven ^21.
2. Zebravis mutante allelen die in deze studie waren PDGFRA ^{B1059 16,} Smad5 ^{B1100 22} en SMO ^{b577 23.} Bronnen voor deze zebravis stammen omvatten Zirc.

2. Bereiding van oplossingen en implementeert

Opmerking: Alle oplossingen en werktuigen kunnen vooraf worden gemaakt en opgeslagen voor toekomstig gebruik.

1. Voeg embryo medium (EM) zoals eerder beschreven ^21.
2. Maak 4 g / L MS-222 (tricaïne). Los op 4 g dinatriumfosfaat (Na ₂ HPO....

Results

In wild-type embryo's, volgende neurale bevolking, de pharynxbogen verlengen langs de anterior / posterior en dorsale / ventrale assen tijdens het verplaatsen in een rostrale richting (Film 1). Op 30 uur na de bevruchting (HPF), de voorste / achterste lengte van de eerste keelboog ligt tussen 1,8-1,9 maal de dorsale / ventrale hoogte. Dorsale / ventrale rek verloopt gestaag, sneller dan anterieure / posterieure verlenging tot 36,5 HPF. Vanaf hier dorsale / ventrale hoogte plateaus ongeveer 104 micro.......

Discussion

Time-lapse confocale microscopie is een krachtig hulpmiddel voor de analyse van ontwikkeling. Hier tonen we het nut van de methode in het bestuderen keelboog morfogenese in zebravis die mutant voor belangrijke signalerende wegen met behulp van een transgeen dat neurale lijst cellen etiketten zijn. In aanvulling op het weefsel niveau analyseert, time lapse analyses zijn ook van toepassing op analyses op een cellulair schaal ^28. Veel gebruikte zebravis methoden kunnen eveneens in time-lapse microscopie experime.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 lb Test monofilament line	Cortland Line Company	SLB16
Agarose I	Amresco	0710
Argon laser	LASOS Lasertechnik GmbH	LGN 3001
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C8106
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID	FHC	30-31-0
Clove oil	Hilltech Canada, Inc.	HB-102
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
Isotemp dry-bath incubator	Fisher Scientific	2050FS
Laser scanning microscope	Carl Zeiss AG	LSM 710
Magnesium sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Microscope cover glass, 22 x 22-1	Fisher Scientific	12-542-B
Microscope cover glass, 24 x 60-1	Fisher Scientific	12-545-M
Potassium chloride	Fisher Scientific	M-11321
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786
Sodium chloride	Fisher Scientific	M-11624
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S7907
TempController 2000-2	PeCon GmbH
Tricaine-S	Western Chemical, Inc.