Dit manuscript presenteert een techniek om de krachten te passen of release op hechtende cellen of weefsels met behulp van unidirectionele stretching.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Stretching micropatterned Cellen op een PDMS membraan
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Mechanische krachten op cellen en / of weefsels spelen een belangrijke rol in talrijke processen. We hebben een apparaat om cellen op een polydimethylsiloxaan (PDMS) membraan, geschikt imaging strekken ontwikkeld. Deze techniek is reproduceerbaar en veelzijdig. De PDMS membraan kan worden micropatterned om cellen of weefsels te beperken tot specifieke geometrie. De eerste stap is micropatterns drukken op de PDMS membraan met een diepe UV techniek. De PDMS membraan wordt vervolgens gemonteerd op een mechanische brancard. Een kamer is gebonden bovenop het membraan met biocompatibele vet glijden tijdens het traject mogelijk. De cellen worden gezaaid en mogen verspreiden voor enkele uren op de micropatterns. Het monster kan meerdere malen worden uitgerekt en zonder rek met behulp van een micrometrische schroef. Het duurt minder dan een minuut om het traject van toepassing zijn op haar volle omvang (ongeveer 30%). De hier gepresenteerde techniek heeft een gemotoriseerd apparaat, dat nodig is voor een niet bevattenpplying herhaalde cycli stretch snel en / of computergestuurde strekken, maar dit kan worden uitgevoerd. Uitrekken van cellen of weefsel kan van belang zijn voor vragen met betrekking tot cel krachten, cel reactie op mechanische stress of weefsel morfogenese. Deze video presentatie zal laten zien hoe je typische problemen die zich kunnen voordoen bij het doen van dit soort schijnbaar eenvoudige experiment te voorkomen.
Inleiding
De cellen samenstellen van een weefsel in hogere organismen zijn onderworpen aan mechanische spanningen en rekkrachten afkomstig hetzij van de externe omgeving of uit de omliggende cellen 1,2. Cellen moeten zich aanpassen aan en tegen deze krachten, om de integriteit van het weefsel te behouden. Dergelijke krachten zijn ook belangrijk voor weefsels morfogenese tijdens ontwikkeling 3,4. Toepassing mechanische krachten op gekweekte cellen is een manier om te bootsen wat zou gebeuren in een weefsel, maar met een kwantitatieve en onafhankelijke regeling van celvorm en celvervorming 5,6. Hiervoor kunnen verschillende technieken worden gebr....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Passivering van de PDMS
- Knip een stuk PDMS ongeveer 35 mm x 20 mm uit een vooraf gemaakte blad (bijvoorbeeld GelPak, zoals vermeld in de tabel van materialen).
- Verwijder de bovenste en onderste beschermende lagen kunststof (indien nodig) en gebruik pincet om de PDMS plaatsen in een plastic (niet celcultuur behandeld) petrischaal.
- Was de PDMS met 70% ethanol gedurende 5 minuten op een rotator bij 30 oscillaties / min.
- Droog het oppervlak door stromende lucht op.
- Verlicht met diepe UV (λ = 180 nm) gedurende 5 min bij een afstand van de UV-lampen van ongeveer 5 cm (zie Materialen blad voor referentie licht, parameter....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De in deze video protocol techniek de vordering van krachten op het terugtrekken vezels mitotische zoogdiercellen. Immers, tijdens de celdeling, in de mitotische fase zoogdiercellen trekken de vorm van een bol nemen en achter dunne actine kabels omgeven door membraan die zijn bevestigd aan het substraat. Deze kabels (retractie vezels), zijn het geheugen van de cel geometrie voordat je in divisie. Maken micropatterns met diepe UV door een fotomasker op PDMS dunne film (figuur 1) kon de geometrische.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel deze techniek vele malen gebruikt en getest, zijn er verschillende belangrijke stappen die leiden tot een mislukt experiment.
Over het PDMS:
Voor dit werk, GelPak, een commercieel beschikbare dunne PDMS vel, werd gebruikt. Alternatief PDMS platen kunnen direct worden gegoten uit PDMS mix. Wij raden u aan GelPak omdat het meer reproduceerbaar, en minder kans op breken in vergelijking met op maat gemaakte PDMS.
Over het apparaat:
<.......Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk is opgericht door Institut Curie, Parijs, Frankrijk. De mechanische brancard werd ontworpen door Damien Cuvelier (Institut Curie) en is vervaardigd door GREM (mecanique-grem.com). Het patroon op PDMS is ontwikkeld door Ammar Azioune (Bordeaux II University).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| GelPak | GelPak | PF-60-X4 | Er zijn verschillende diktes/plakkerigheid beschikbaar. Een alternatief zou zijn om zelf uw PDMS te gieten |
| Siliconenvet | GE Bayer Silicones | Baysilone-Paste | Deze is biocompatibel |
| Rektoestel | GREM mécanique | Stretcher 2011 | |
| EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) | Sigma | 3450 | 6 maanden stabiel bij -20 °C |
| NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide natriumzout) | Sigma | 56485 | Beschermen tegen vocht |
| Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg) | SurfaceSolutions (Zurich) | ||
| Synthetische Kwarts fotomasker | Toppan | Neem standaard binaire fotomasker in Kwarts | |
| Fibronectine uit runderenplasma | Sigma | F1141 |
Referenties
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
- Terenna, C. R., et al. Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast. Curr. Biol. 18
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
