Stretching micropatterned Cellen op een PDMS membraan

Samenvatting

Dit manuscript presenteert een techniek om de krachten te passen of release op hechtende cellen of weefsels met behulp van unidirectionele stretching.

Samenvatting

Mechanische krachten op cellen en / of weefsels spelen een belangrijke rol in talrijke processen. We hebben een apparaat om cellen op een polydimethylsiloxaan (PDMS) membraan, geschikt imaging strekken ontwikkeld. Deze techniek is reproduceerbaar en veelzijdig. De PDMS membraan kan worden micropatterned om cellen of weefsels te beperken tot specifieke geometrie. De eerste stap is micropatterns drukken op de PDMS membraan met een diepe UV techniek. De PDMS membraan wordt vervolgens gemonteerd op een mechanische brancard. Een kamer is gebonden bovenop het membraan met biocompatibele vet glijden tijdens het traject mogelijk. De cellen worden gezaaid en mogen verspreiden voor enkele uren op de micropatterns. Het monster kan meerdere malen worden uitgerekt en zonder rek met behulp van een micrometrische schroef. Het duurt minder dan een minuut om het traject van toepassing zijn op haar volle omvang (ongeveer 30%). De hier gepresenteerde techniek heeft een gemotoriseerd apparaat, dat nodig is voor een niet bevattenpplying herhaalde cycli stretch snel en / of computergestuurde strekken, maar dit kan worden uitgevoerd. Uitrekken van cellen of weefsel kan van belang zijn voor vragen met betrekking tot cel krachten, cel reactie op mechanische stress of weefsel morfogenese. Deze video presentatie zal laten zien hoe je typische problemen die zich kunnen voordoen bij het doen van dit soort schijnbaar eenvoudige experiment te voorkomen.

Inleiding

De cellen samenstellen van een weefsel in hogere organismen zijn onderworpen aan mechanische spanningen en rekkrachten afkomstig hetzij van de externe omgeving of uit de omliggende cellen ^1,2. Cellen moeten zich aanpassen aan en tegen deze krachten, om de integriteit van het weefsel te behouden. Dergelijke krachten zijn ook belangrijk voor weefsels morfogenese tijdens ontwikkeling ^3,4. Toepassing mechanische krachten op gekweekte cellen is een manier om te bootsen wat zou gebeuren in een weefsel, maar met een kwantitatieve en onafhankelijke regeling van celvorm en celvervorming ^5,6. Hiervoor kunnen verschillende technieken worden gebruikt. Men kan drukken op de cellen (de volledige cel of deel daarvan), bijvoorbeeld met AFM of derivaten ^7,8 en rek het substraat de cellen groeien op.

De methode beschreven in dit document laat zien hoe een vliegtuig substraat bedekt met cellen strekken. Deze techniek werd oorspronkelijk ontwikkeld ter beoordeling van de rol van krachten op mitotic zoogdiercellen ^9. Mitotische cellen verbonden blijven op het substraat door retractie vezels en strekken de membraan een kracht uitgeoefend op de vezels, die op zijn beurt veroorzaakt de rotatie van de mitotische spoel. Het belang van het combineren van lijm micropatterns en stretching is om onafhankelijke controle van de krachten en de vorm van individuele cellen te bereiken. Het is bijvoorbeeld mogelijk om een ​​eivormige cel uitstrekken tot een perfect isotroop ronde vorm, terwijl uniaxiale rek wordt toegepast. Als de cellen niet worden gevlochten op micropatterns, eenassige stretching resultaten in cel rek, met de meeste cellen met een lange as in lijn met de stretch as. Het is dan moeilijk om het effect van de lange as uitlijning en het effect van het traject toegepast om de cellen te scheiden.

Het apparaat is geschikt voor elke live cell imaging, inclusief lange time lapse fluorescentie microscopie, en drugs kan tijdens het experiment worden toegevoegd. De diepe UV's micropatterning methode ¹⁰werd in detail beschreven in Azioune et al.. ¹¹ Patterning op PDMS werd beschreven in Azioune et al.. ¹² De huidige stretching protocol is een video-versie van Carpi et al.. ¹³

Protocol

1. Passivering van de PDMS

1. Knip een stuk PDMS ongeveer 35 mm x 20 mm uit een vooraf gemaakte blad (bijvoorbeeld GelPak, zoals vermeld in de tabel van materialen).
2. Verwijder de bovenste en onderste beschermende lagen kunststof (indien nodig) en gebruik pincet om de PDMS plaatsen in een plastic (niet celcultuur behandeld) petrischaal.
3. Was de PDMS met 70% ethanol gedurende 5 minuten op een rotator bij 30 oscillaties / min.
4. Droog het oppervlak door stromende lucht op.
5. Verlicht met diepe UV (λ = 180 nm) gedurende 5 min bij een afstand van de UV-lampen van ongeveer 5 cm (zie Materialen blad voor referentie licht, parameters variëren voor verschillende lampen).
6. Bereid 200 ul van EDC / NHS oplossing bij PDMS stuk (dit moet vers worden bereid voor gebruik omdat de reactiviteit van de oplossing vervalt in enkele hr). 1 ml 0,05 M MES + 0,5 M NaCl bij pH 6,0, voeg 11,5 mg Sulfo-NHS en 19,2 mg EDC.
7. Breng dePDMS vellen uit de petrischaal om het deksel van de petrischaal, die niet zijn belicht. Dit zal ervoor zorgen dat de omgeving van de PDMS zijn zeer hydrofoob en de volgende stap te vergemakkelijken.
8. Voeg EDC / NHS oplossing en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
9. Spoel EDC / NHS met water.
10. Add PLL-g-PEG-oplossing (0,5 mg / ml in 10 mM HEPES pH 8,6) en incubeer van 3 uur 's nachts bij kamertemperatuur.
11. Spoel de PLL-g-PEG met water. Gepassiveerd PDMS (gefunctionaliseerd met PLL-g-PEG) worden enkele dagen bewaard bij 4 ° C.

2. Patroonvorming van de PDMS

1. Neem een PDMS vel en plaats het op een synthetische kwarts fotomasker met het microfeatures voor patronen (zie figuur 1). Plaats de PDMS zijkant voorzien van het PLL-g-PEG geconfronteerd met de chromen kant van de fotomasker.
2. Belichten gedurende 7 min door het fotomasker op afstand van de UV-lampen van ongeveer 5 cm.
3. Voeg water op het masker + PDMS en schil de PDMS langzaam het masker af.
4. Incubeer met fibronectine bij 50 mg / ml in HEPES buffer bij pH 8,6 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Het is mogelijk om anderen ECM eiwitten te gebruiken, maar deze zijn niet getest met dit protocol.
5. Spoelen met PBS.

3. Het toestel bevestigen

1. Monteer de eerder gepassiveerd PDMS op de stretching apparaat (zie Overleg voor het oplossen van problemen).
   1. Bevestig een zijde van de PDMS het vaste deel van de brancard.
   2. Bevestig de andere kant van het mobiele gedeelte van de stretcher zonder klemmen te veel van het PDMS vel.
2. Snijd een rechthoek van PDMS (22 mm x 19 mm) in een dikke PDMS steek en snij een rechthoek binnen om een pool (of frame) hebben dat de cellen en media behouden (zie figuur 2).
3. Voeg siliconenvet onder deze PDMS zwembad en plaats deze op de top van de PDMS vel het creëren van een medium behoud zwembad. Het vet zal het glijden van het zwembad over de PDMS vel mogelijk te maken tijdens het uitrekken.

4. Patroonvorming van de Cellen

1. Maak de cellen van een 50% confluentie kolf met Versene.
2. Tel de cellen en resuspendeer ze in een concentratie van 200.000 cellen / ml.
3. Voeg 1 ml celsuspensie in het zwembad (zie Overleg voor meer informatie).
4. Laat de cellen binden aan de patronen voor 10-30 min (afhankelijk van het celtype, RPE-1 cellen 10 min en HeLa-cellen 20 min. duren).
5. Zachtjes spoelen van de drijvende cellen met in evenwicht medium (evenwicht middelgroot incubator).
6. Laat de cellen verspreid voor een paar uur op de patronen (RPE-1 zal minstens 2 uur nodig hebben; HeLa cellen 3 uur nodig).
7. Voeg een dekglaasje bovenop de pool verdamping en middelgrote lekkage indien het PDMS onderbrekingen voorkomen.
8. Plekje op een omgekeerde microscoop en start beeldvorming. Vermijd het gebruik van olie immersie obstellingen als het niet zal werken als gevolg van focus problemen.

5. Stretching

1. Draai de micrometrische schroef tijdens het corrigeren van de fase positie in de x-, y-en z-as (voornamelijk x). De positie van het podium moet worden gecorrigeerd aan de verbreding van de PDMS en het verlies van de focus tegen te gaan. (Zie "Tijdens de rekken" paragraaf in de discussie).

Resultaten

De in deze video protocol techniek de vordering van krachten op het terugtrekken vezels mitotische zoogdiercellen. Immers, tijdens de celdeling, in de mitotische fase zoogdiercellen trekken de vorm van een bol nemen en achter dunne actine kabels omgeven door membraan die zijn bevestigd aan het substraat. Deze kabels (retractie vezels), zijn het geheugen van de cel geometrie voordat je in divisie. Maken micropatterns met diepe UV door een fotomasker op PDMS dunne film (figuur 1) kon de geometrische...

Discussie

Hoewel deze techniek vele malen gebruikt en getest, zijn er verschillende belangrijke stappen die leiden tot een mislukt experiment.

Over het PDMS:

Voor dit werk, GelPak, een commercieel beschikbare dunne PDMS vel, werd gebruikt. Alternatief PDMS platen kunnen direct worden gegoten uit PDMS mix. Wij raden u aan GelPak omdat het meer reproduceerbaar, en minder kans op breken in vergelijking met op maat gemaakte PDMS.

Over het apparaat:

<...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Er zijn verschillende diktes/plakkerigheid beschikbaar. Een alternatief zou zijn om zelf uw PDMS te gieten
Siliconenvet	GE Bayer Silicones	Baysilone-Paste	Deze is biocompatibel
Rektoestel	GREM mécanique	Stretcher 2011
EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)	Sigma	3450	6 maanden stabiel bij -20 °C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide natriumzout)	Sigma	56485	Beschermen tegen vocht
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurich)
Synthetische Kwarts fotomasker	Toppan		Neem standaard binaire fotomasker in Kwarts
Fibronectine uit runderenplasma	Sigma	F1141