Monitoring intraspecies competitie in een bacteriële celpopulatie door cocultivatie van fluorescerend gelabelde stammen

Samenvatting

Bacteriën kunnen tijdens hun leven schadelijke of gunstige mutaties ophopen. In een populatie van cellen kunnen individuen die gunstige mutaties hebben geaccumuleerd, snel hun medemens overtreffen. Hier presenteren we een eenvoudige procedure om intraspecies-concurrentie in een bacteriële celpopulatie in de loop van de tijd te visualiseren met behulp van fluorescerend gelabelde individuen.

Samenvatting

Veel micro-organismen zoals bacteriën verspreiden zich extreem snel en de populaties kunnen hoge celdichtheden bereiken. Kleine fracties van cellen in een populatie hebben altijd geaccumuleerde mutaties die schadelijk of gunstig zijn voor de cel. Als het fitnesseffect van een mutatie de subpopulatie een sterk selectief groeivoordeel biedt, kunnen de individuen van deze subpopulatie snel overcompeteren en zelfs hun directe medemensen volledig elimineren. Kleine genetische veranderingen en selectiegestuurde accumulatie van cellen die gunstige mutaties hebben verworven, kunnen dus leiden tot een volledige verschuiving van het genotype van een celpopulatie. Hier presenteren we een procedure om de snelle klaonale expansie en eliminatie van respectievelijk gunstige en schadelijke mutaties in een bacteriecelpopulatie in de loop van de tijd te monitoren door cocultivatie van fluorescerend gelabelde individuen van de Gram-positieve modelbacterie Bacillus subtilis. De methode is gemakkelijk uit te voeren en zeer illustratief om intraspecies concurrentie weer te geven tussen de individuen in een bacteriële celpopulatie.

Inleiding

Bodembacteriën zijn meestal begiftigd met flexibele regulerende netwerken en brede metabolische capaciteiten. Beide functies stellen de cellen in staat om hun katabole en anabole paden aan te passen om te concurreren met hun collega's en andere micro-organismen voor de voedingsstoffen, die beschikbaar zijn in een bepaalde ecologische niche¹. Als de bacteriën zich echter niet kunnen aanpassen aan hun omgeving, kunnen andere mechanismen het voortbestaan van een soort verklaren. Inderdaad, omdat veel bacteriën zich snel verspreiden en de populaties hoge celdichtheden kunnen bereiken, kunnen subpopulaties spontaan gunstige mutaties hebben geaccumuleerd die de cellen een selectief groeivoordeel bieden en daarom hun conditie verhogen. Bovendien kunnen mutatiehotspots en stress-geïnduceerde adaptieve mutagenese de evolutie van een maladapted bacterie^2,3vergemakkelijken. Accumulatie van mutaties en groei onder continue selectie is dus de oorsprong voor de enorme microbiële diversiteit, zelfs binnen hetzelfde geslacht^4,5. Net als in de natuur komt het vormen van bacteriële genomen ook voor in het laboratorium als gevolg van continue teelt onder selectie. Dit wordt geïllustreerd door de domesticatie van de Gram-positieve bacterie B. subtilis, die wereldwijd wordt gebruikt in fundamenteel onderzoek en in de industrie. In de jaren 1940 werd B. subtilis behandeld met DNA-schadelijke röntgenfoto's gevolgd door teelt onder een specifieke groeitoestand⁶. De mutaties die zich tijdens hun domesticatie in de bacteriën hebben opgehoopt, zijn verantwoordelijk voor het verlies van veel groeikenmerken, d.w.z. de B. subtilis laboratoriumstam 168 verloor het vermogen om complexe kolonies te vormen^7,8.

Tegenwoordig is voor de best bestudeerde modelbacteriën Escherichia coli en B. subtiliseen verscheidenheid aan krachtige hulpmiddelen beschikbaar om hun genomen genetisch te manipuleren om specifieke wetenschappelijke vragen te beantwoorden. Soms veroorzaakt de inactivatie van een interessant gen een ernstig groeidefect, dat dan duidelijk zichtbaar is op standaard groeimedium⁹. Mutaties die daarentegen een zwak groeidefect veroorzaken en dus slechts een geringe invloed hebben op de conditie van de stam, worden vaak genegeerd. In beide gevallen resulteren langdurige incubatie en passaging van de mutante stammen gedurende meerdere generaties echter meestal in de accumulatie van suppressor mutanten die het fenotype van de ouderstam hebben hersteld^2,9. De karakterisering van suppressor mutanten en de identificatie van de mutaties die het groeidefect van de parent mutant stam hebben hersteld is een zeer nuttige benadering die opheldering van belangrijke en vaak nieuwe cellulaire processen mogelijk maakt^10,11.

Wij zijn geïnteresseerd in de bestrijding van glutamaat homeostase in B. subtilis¹². Net als E. colireageert B. subtilis op verstoring van glutamaathomeostase (d.w.z.blok in glutamaatdegradatie²) door de accumulatie van suppressormutanten. De genomische veranderingen in deze suppressor mutanten die werden verkregen door spontane mutatie bleken glutamaat homeostase snel te herstellen^9,13. Daarom is het niet verwonderlijk dat aanpassing van B. subtilis aan een specifieke groeitoestand tijdens domesticatie van de bacterie wordt weerspiegeld in enzymsynthese en in de geëvolueerde enzymatische activiteiten, die betrokken zijn bij glutamaatmetabolisme¹². Er is gesuggereerd dat het gebrek aan exogene glutamaat in het groeimedium tijdens het domesticatieproces de drijvende kracht was voor het ontstaan en fixeren van het cryptische glutamaatdehydrogenase (GDH) gudB^CR-gen in de laboratoriumstam 168^2,14. Deze hypothese wordt ondersteund door onze observatie dat de verminderde hoeveelheid GDH-activiteit in de laboratoriumstam de bacteriën een selectief groeivoordeel biedt wanneer exogene glutamaat schaars is². Bovendien resulteert de teelt van een B. subtilis stam, het synthetiseren van de GDH GudB, bij afwezigheid van exogene glutamaat in de accumulatie van suppressor mutanten die het gudB gen²hebben geactiveerd . Het is duidelijk dat de aanwezigheid van een katabolisch actieve GDH nadelig is voor de cel omdat endogene glutamaat dat anders voor anabolisme zou kunnen worden gebruikt, wordt afgebroken tot ammonium en 2-oxoglutaraat (figuur 1). Wanneer glutamaat daarentegen door het medium wordt geleverd, heeft een B. subtilis-stam die is uitgerust met GDH-activiteit op hoog niveau een selectief groeivoordeel ten opzichte van een soort die slechts één functionele GDH synthetiseert. Het is redelijk om aan te nemen dat GDH-activiteit op hoog niveau de bacteriën in staat stelt glutamaat als tweede koolstofbron te gebruiken naast andere koolstofbronnen die door het medium² worden geleverd (zie figuur 1). GDH-activiteit heeft dus een sterke invloed op de geschiktheid van bacteriën, afhankelijk van de beschikbaarheid van exogene glutamaat.

Hier presenteren we een zeer illustratieve methode om de intraspecies-competitie tussen twee B. subtilisstammen die verschillen in een enkele locus op het chromosoom te monitoren en te visualiseren (Figuur 2). De twee stammen werden gelabeld met de yfp- en cfp-genen die coderen voor de fluoroforen YFP en GVB, en gecocultiveerd onder verschillende voedingsomstandigheden. Door na verloop van tijd te bemonsteren en door geschikte verdunningen op agarplaten te plateren, konden de overlevenden in elk van de culturen gemakkelijk worden gecontroleerd met behulp van een gemeenschappelijke stereofluorescentiemicroscoop. De procedure die in dit artikel wordt beschreven, is eenvoudig uit te voeren en geschikt om de snelle klaonale expansie en eliminatie van respectievelijk gunstige en schadelijke mutaties in een celpopulatie in de loop van de tijd te visualiseren.

Protocol

1. Voorbereiding van Agar-platen, cultuurmedia, cryostocks en preculturen

1. Bereid groeimedia en benodigde reagentia voor (zie tabel met materialen en reagentia).
2. Streep de B. subtilis stammen (b.v. BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) en BP52 (rocG⁺ gudB⁺ amyE::P_gudB-cfp) die respectievelijk één en twee actieve GDH's uitdrukken)² die zullen worden gebruikt in het concurrentie-experiment op SP medium agar platen om enkele kolonies te krijgen. Incubeer de platen 's nachts bij 37 °C.
3. Neem enkele kolonies en inenteer steriele kweekbuizen met een vloeibaar medium van 4 ml LB. Kweek de bacteriën 's nachts bij 28 °C en 220 tpm.
4. Kweek 's nachts culturen bij 28 °C om te voorkomen dat de cellen lyseren of sporuleren.
5. Meet de optische dichtheid van de culturen op een golflengte van 600 nm (OD₆₀₀) met behulp van een standaard spectrofotometer.
6. Als de culturen een OD₆₀₀ van 2,0 hebben bereikt, meng dan 0,75 ml van de culturen met 0,75 ml steriele 50% glyceroloplossing in reactiebuizen van 1,5 ml. De uiteindelijke OD₆₀₀ moet 1,0 zijn om cryostocks te verkrijgen die ongeveer 10⁸ cellen/ml bevatten.
7. Bewaar de buizen bij -80 °C.
8. Maak drie preculturen van elke soort gelabeld met de cfp en yfp die coderen voor fluorofoorgenen. Ent de preculturen (steriele kweekbuizen met 4 ml LB vloeibaar medium) in met 1 μl cellen uit -80 °C cryostocks. Incubeer de culturen 's nachts bij 28 °C en 220 tpm.

2. Cocultivatie van bacteriën, monsterverzameling en monsteropslag

1. Bereid vers 100 ml C-Glc en CE-Glc minimaal medium (zie tabel met reagentia en materialen) en breng 20 ml van elk medium over in steriele shakekolven van 100 ml.
2. Neem 0,1 ml van de preculturen die 's nachts zijn gekweekt, verdun ze met 0,9 ml LB medium in een cuvette van 1,5 ml en bepaal de OD₆₀₀.
3. Neem voor het concurrentie-experiment die preculturen van de verschillende soorten met een vergelijkbare OD₆₀₀ tussen 1,0-1,5.
4. Om gemengde celpopulaties te verkrijgen, verdun de cellen van de preculturen met de juiste OD₆₀₀ tot een OD₆₀₀ van 0,05 in 20 ml C-Glc en CE-Glc minimaal medium aangevuld met 100 ml shakekolven. Voor het concurrentie-experiment moeten de twee stammen worden gemengd in een verhouding van 1:1.
5. Neem 10 ml monsters uit de kolven, breng ze over in plastic buizen van 15 ml, oogst de cellen door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 4.000 x g in een standaard tafelcentrifuge en gooi het supernatant weg.
6. Resuspend de cellen in 0,5 ml vers LB-medium en breng de cellen over in een steriele reactiebeker van 1,5 ml. Voeg 0,5 ml 50% steriele glycerol toe, meng de suspensie door rigoureuze vortexing en bewaar de monsters in een vriezer van -80 °C tot verdere behandeling.
7. Incubeer de cellen die in de schudkolven zitten tot 24 uur bij 37 °C en 220 tpm. Houd de schudkolven in het donker om te voorkomen dat de fluoroforen op de foto worden gebleekt.
8. Neem verdere monsters van 0,1 ml na 7 uur en 24 uur groei. Meet en noteer de OD₆₀₀ van 1:10 verdunningen (in C-Glc of CE-Glc minimaal medium) van de monsters.
9. Neem de juiste hoeveelheid cellen uit elke kweek om cryostocks te maken met een OD₆₀₀ van 1,0. Bewaar de monsters bij -80 °C tot verdere behandeling.

3. Monsterbehandeling, plating en incubatie voor kwantitatieve analyses

1. Ontdooi na het verzamelen van alle monsters de cryostocks en verdun de cellen in een zoutoplossing van 0,9% (zie tabel met reagentia en materialen) tot 10^-3.
2. Plaat 0,1 ml van de 10^-3 verdunningen op SP medium agar platen en verdeel de cellen met steriele glazen pipetten.
3. Incubeer de platen 's nachts bij 37 °C in het donker totdat er enkele kolonies zijn verschenen.

4. Het tellen van de overlevenden door stereofluorescentiemicroscopie voor kwantitatieve analyse

1. Verdeel de onderkant van de agarplaat met een zwarte pen in vier delen voor een betere oriëntatie terwijl u de overlevenden onder de stereofluorescentiemicroscoop telt.
2. Plaats de plaat ondersteboven onder de microscoop en breng de kolonies scherp met behulp van de koude lichtbron.
3. Zodra de kolonies scherp zijn, schakelt u over naar de juiste filterset voor GVB om de overlevende cellen van de stam met het CFP-labelte visualiseren. Tel de overlevenden van deze stam door de kolonies te labelen met een pen en noteer het nummer.
4. Verwijder de etiketten met ethanol en schakel over naar de YFP-filterset om de overlevende cellen van de yfp-gelabeldestam te visualiseren. Tel de overlevenden opnieuw door de kolonies met een pen te labelen en noteer het nummer.

5. Monsterbehandeling en microscopie voor semiquantitatieve analyses

1. Voor illustratieve cijfers, spot 10 μl van de 10^-4 verdunning (ongeveer 100 cellen) vanaf stap 3.1 op een SP-agarplaat (zie figuur 3).
2. Incubeer de platen 's nachts bij 37 °C in het donker totdat er enkele kolonies zijn verschenen.
3. Plaats de Petrischaal zonder deksel onder de microscoop en breng de plek scherp met behulp van de koude lichtbron.
4. Maak foto's van de plekken voor illustratieve figuren. Kies een geschikte belichtingstijd voor het maken van de foto's van de kolonies met de koude lichtbron.
5. Zonder de plaat te verplaatsen, gaat u over op de CFP-filterset, past u de belichtingstijd aan en maakt u een foto. Doe hetzelfde met de YFP-filterset en sla de foto's op voor verdere analyses.

6. Gegevensanalyse

1. Gebruik software zoals Excel voor de kwantitatieve data-analyses. Bereken op basis van de getelde kolonies het percentage gele en blauwe kolonies met betrekking tot het hele aantal kolonies, dat is ingesteld op 100%.
2. Gebruik de berekende getallen om een gestapeld staafdiagram te maken (zie figuur 4 en figuur 5). Gebruik een beeldverwerkingsprogramma zoals Adobe Photoshop om samengevoegde foto's te maken van de foto's die vanaf de verschillende plekken zijn gemaakt. Als alternatief kan de vrij beschikbare software ImageJ, te downloaden van http://rsbweb.nih.gov/ij/ worden gebruikt voor beeldverwerking.
3. Open de foto's vanaf één plek die zijn gemaakt met de GVB-filterset en de YFP-filterset. Optimaliseer het contrast en de helderheid om eventuele achtergrondfluorescentie van de media te verminderen.
4. Ga naar een van de foto's en selecteer alles. Kopieer de afbeelding en plak deze op de andere afbeelding.
5. Gebruik de functie "color dodge" om de foto's samen te voegen of leg de fluorescerende foto's over elkaar met behulp van het tabblad kanalen. Samengevoegde foto's van de kolonies uit verschillende media en verschillende tijdspunten vertegenwoordigen de groei van de verschillende stammen binnen de vloeibare cultuur.

7. Specifieke tips: Dye Switch Experiment en cocultivatie van isogene stammen gelabeld met cfp en yfp

De expressie van een van de twee fluorofoor-coderende genen in B. subtilis kan de conditie en dus de groeisnelheid van de bacteriën beïnvloeden. Daarom wordt aanbevolen om de volgende experimenten uit te voeren om uit te sluiten dat de eliminatie van één concurrente stam uit de celpopulatie tijdens de teelt eenvoudigweg te wijten is aan een negatief effect van de fluorofoor:

1. Herhaal het hele experiment en cocultiveer omgekeerd gelabelde stammen (bijv. de eerdere cfp-gelabeldestam is nu gelabeld met het yfp-gen en vice versa). Hoewel omgekeerd, moeten de verkregen resultaten vergelijkbaar zijn met de eerdere observatie dat de ene stam een selectief groeivoordeel heeft ten opzichte van de andere stam.
2. Herhaal het hele experiment en cocultiveer isogene stammen gelabeld met yfp en cfp (bijv. BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) en BP41 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-cfp)). Schat het negatieve effect van een van de twee fluoroforen op de geschiktheid van de bacteriën door de samenstelling van de celpopulatie in de loop van de tijd te volgen.

Resultaten

De hier beschreven methode werd met succes toegepast om de intraspecies-concurrentie te visualiseren in een celpopulatie bestaande uit B. subtilis-stammen die werden gelabeld met de cfp- en yfp-genen die coderen voor respectievelijk de fluoroforen GVB en YFP. Zoals weergegeven in figuur 3, kan de methode worden gebruikt om intraspecies-concurrentie op een zeer illustratieve manier te visualiseren. Door de monsters op kleine gebieden te spotten, werd de klonale samenstelling van...

Discussie

Verschillende methoden zijn ontwikkeld om de competitieve fitheid van bacteriën te analyseren¹⁶. In veel gevallen werden de bacteriën gelabeld met verschillende antibioticaresistentiecassettes¹⁷. Net als bij onze aanpak maakt het labelen van de cellen met antibioticaresistentiecassettes het mogelijk om de competitieve geschiktheid van de bacteriën tijdens cocultivatie onder gedefinieerde groeiomstandigheden te evalueren. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de competitieve geschiktheid te b...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
(NH4)2SO4	Roth, Germany	3746
Agar	Difco, USA	214010
Ammonium ferric citrate (CAF)	Sigma-Aldrich, Germany	9714
CaCl2	Roth, Germany	5239
Glucose	Applichem, Germany	A3617
Glycerol	Roth, Germany	4043
K2HPO4•3H2O	Roth, Germany	6878
KCl	Applichem, Germany	A3582
KH2PO4	Roth, Germany	3904
KOH	Roth, Germany	6751
MgSO4•7H2O	Roth, Germany	P027
MnCl2	Roth, Germany	T881
MnSO4•4H2O	Merck Millipore, Germany	102786
NaCl	Roth, Germany	9265
Nutrient broth	Roth, Germany	X929
Potassium glutamate	Applichem, Germany	A3712
Tryptone	Roth, Germany	8952
Tryptophan	Applichem, Germany	A3445
Yeast extract	Roth, Germany	2363
1.5 ml Reactiebuisjes	Sarstedt, Germany	72,690,001
2.0 ml Reactiebuisjes	Sarstedt, Germany	72,691
15 ml Plastic buisjes met schroefdop	Sarstedt, Germany	62,554,001
Petrischalen	Sarstedt, Germany	82.1473
1.5 ml Polystyreen cuvettes	Sarstedt, Germany	67,742
15 ml Glas kweekbuisjes	Brand, Germany	7790 22
100 ml Schooiflacons met aluminium doppen	Brand, Germany	928 24
Steriele 10 ml glazen pipetten	Brand, Germany	278 23
Incubator (28 en 37 °C)	New Brunswick	M1282-0012
Standaard pipettenset (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1.000 μl)	Eppendorf, Germany	4910 000.034, 4910 000.042,
Tabel centrifuge voor 1.5 en 2 ml reactiebuisjes	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany	75002425
Tabel centrifuge voor 15 ml plastic buisjes	Heraeus Biofuge Primo R, Germany	75005440
Standaard spectrofotometer	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany	80-2112-21
Stereofluorescentie microscoop	Zeiss SteREO Lumar V12, Germany	495008-0009-000
Vriezer (-20 en -80 °C)	-	-
Koelkast (4 °C)	-	-
Autoclaaf	Zirbus, LTA 2x3x4, Germany	-
pH meter	pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany	766
Vortex	Vortex 3, IKA, Germany	3340000
Weegschaal	CP2202S, Sartorius, Germany	vervangen door
Zwarte pen (permanente marker)	Staedler, Germany	317-9
Powerpoint programma	Microsoft, USA	-
Office Excel programma	Microsoft, USA	-	Programma voor dataverwerking
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	vervangen door CS6, download	Computerprogramma voor beeldverwerking
Computer	PC of Mac	-
ZEN pro 2011 software voor de stereofluorescentie microscoop	Zeiss, Germany	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Verkregen via Zeiss
Specifieke oplossing recepten
SP Medium
8 g Nutrient broth
0.25 mg MgSO4•7H2O
1 g KCl
15 g agar voor solid SP medium			indien vereist
voeg 1 L met H2O toe			autoclaveer gedurende 20 min bij 121 °C
1 ml CaCl2 (0.5 M), gesteriliseerd door filtratie
1 ml MnCl2 (10 mM), gesteriliseerd door filtratie
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), gesteriliseerd door filtratie
LB Medium
10 g Tryptone
5 g Yeast extract
10 g NaCl
15 g agar voor solid LB medium			indien vereist
voeg 1 L met H2O toe			autoclaveer gedurende 20 min bij 121 °C
C-Glc minimaal Medium
200 ml 5 x C-zouten
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), gesteriliseerd door filtratie
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), gesteriliseerd door filtratie
10 ml III’ zouten
25 ml Glucose (20%)