Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Synthese van een inteïne gemedieerde Kunstmatige Protein Hydrogel

11.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51202

⸱

27 januari 2014

 , 
1Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University, College Station, 2Department of Microbial and Molecular Pathogenesis, Texas A&M Health Science Center, Texas A&M University, College Station

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren de synthese van een split-inteïne gemedieerde proteïne hydrogel. De bouwstenen van deze hydrogel twee eiwitten copolymeren elk een subeenheid van een trimere eiwit dat fungeert als een verknopingsmiddel en een helft van een gespleten intein. Menging van de twee copolymeren eiwit activeert een inteïne trans-splicing reactie, waarbij een polypeptide eenheid die zelf-assembleert een hydrogel. Deze hydrogel is zeer pH-en temperatuur-stabiele compatibel met organische oplosmiddelen en gemakkelijk bevat functionele globulaire eiwitten.

Samenvatting

We presenteren de synthese van zeer stabiele eiwit hydrogel gemedieerd door een split-inteïne gekatalyseerde eiwit trans-splicing reactie. De bouwstenen van deze hydrogel twee eiwitten blokcopolymeren elk een subeenheid van een trimere eiwit dat fungeert als een verknopingsmiddel en een helft van een gespleten intein. Een sterk hydrofiel willekeurige spoel wordt ingebracht in een van de blok-copolymeren voor waterretentie. Menging van de twee eiwitten blokcopolymeren activeert een inteïne trans-splicing reactie, waarbij een polypeptide eenheid met verknopingsmiddelen aan beide uiteinden die snel zelf-assembleert een hydrogel. Deze hydrogel is zeer stabiel onder zowel zure als basische omstandigheden, bij temperaturen tot 50 ° C en in organische oplosmiddelen. De hydrogel snel hervormingen na-afschuiving veroorzaakte breuk. Oprichting van een "docking station peptide" in de hydrogel bouwsteen maakt handig integreren van "docking eiwit"-gelabeld doelwit eiwitten.De hydrogel is compatibel met weefselgroei kweekmedia, ondersteunt de diffusie van 20 kDa moleculen en maakt de immobilisatie van biologisch actieve globulaire eiwitten. De toepassing van het inteïne-gemedieerde proteïne hydrogel als een organisch-oplosmiddel-compatibele biokatalysator werd gedemonstreerd door inkapseling van het mierikswortel peroxidase enzym en bevestigende zijn activiteit.

Inleiding

Hydrogelen geheel gemaakt van eiwitten dragen het potentieel om uiteenlopende gebieden als tissue engineering, drug delivery en biofabrication 1 aanzienlijke vooruitgang. Zij bieden voordelen ten opzichte van traditionele synthetische polymeren hydrogels zoals biocompatibiliteit en potentieel invasief ondersteunen de opname van bioactieve globulaire eiwitten.

In dit werk beschrijven we de ontwikkeling van een nieuw eiwit hydrogel gevormd via een split-inteïne-eiwit gemedieerde trans-splicing reactie en de toepassing ervan als een eiwit immobilisatie steiger (figuur 1). De bouwstenen van deze hydrogel twee eiwitten blokcopolymeren die elk de N-of C-terminale fragment van een split inteïne (IN en IC) en een subeenheid van een multimeer proteïne crosslinker. De inteïne DnaE van Nostoc punctiforme (NPU) werd gebruikt als de splitsing intein 2,3 en een kleine trimere eiwit (12 kDa) Cuta van Pyrococcus horikoshii </ Em> werd als crosslinker eiwit 4,5. Verschillende verknopingsmiddelen zijn verbonden door intein gekatalyseerde trans-splicing reactie leidt tot de vorming van een sterk verknoopte proteïnenetwerk (hydrogel). NPU intein werd gekozen vanwege de snelle reactiekinetiek (t1 / 2 = 63 sec) en hoge trans-splicing opbrengst (bijna 80%) 2,3. De Cuta eiwit werd gekozen als crosslinker vanwege zijn hoge stabiliteit. Cuta trimeren een denaturatie temperatuur dichtbij 150 ° C en bewaar trimere quaternaire structuur in oplossingen die zoveel 5 M guanidine hydrochloride 4,6. Aangezien subeenheid uitwisseling tussen verschillende verknopingsmiddelen is een belangrijke bijdrage van de oppervlakte fysieke hydrogel erosie 7, dient de sterke inter-subeenheid interactie Cuta dergelijke subeenheid uitwisseling ontmoedigen, waardoor een stabielere hydrogel. Een van deze bouwstenen bevat ook een sterk hydrofiel peptide S-fragment als het midden-blok naar water gemakkelijkretentie 8.

Menging van de twee hydrogel bouwstenen initieert een trans-splicing reactie tussen de IN en IC intein fragmenten, waardoor een langere polypeptideketen met verknopingsmiddelen aan beide terminals. Crosslinkers van meerdere dergelijke moleculaire eenheden met elkaar, waarbij een zeer verknoopte hydrogel netwerk (figuur 1A). Een specifiek "docking station peptide" (DSP) is opgenomen in een van de hydrogel bouwstenen stabiele immobilisatie van een "docking eiwit" (DP)-gemerkt doeleiwit in de hydrogel vergemakkelijken. Het gebruik van een split inteïne de hydrogel samenstel bemiddelen niet alleen extra flexibiliteit hydrogel proteïne synthese, maar ook zorgt voor een hoge dichtheid, gelijkmatige belasting van het doeleiwit de gehele hydrogel, als doeleiwitten worden geladen voordat hydrogelvorming.

De intein gemedieerde proteïne hydrogel zeer staBLE in waterige oplossing met weinig tot geen detecteerbare erosie na 3 maanden bij kamertemperatuur. Stabiliteit wordt vastgehouden in een breed scala van pH (6-10) en temperatuur (4-50 ° C), en de hydrogel is ook compatibel met organische oplosmiddelen. Deze hydrogel wordt gebruikt voor de immobilisatie van twee globulaire eiwitten: green fluorescent protein (GFP) en mierikswortelperoxidase (HRP). Hydrogel invangen deze proteïne om biokatalyse uitgevoerd in een organisch oplosmiddel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Plasmideconstructie

OPMERKING: Alle genen werden geamplificeerd onder standaard PCR-reacties gebruik Phusion High-Fidelity DNA Polymerase per specificaties van de fabrikant. Primers gebruikt voor klonering zijn eerder 9 beschreven. Alle constructen zijn vermeld in tabel 1.

  1. Om Cuta-NpuN (N, tabel 1) te genereren:
    1. PCR versterken Cuta en NpuN genen van plasmiden pET30-Cuta-Tip1 10 en KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, respectievelijk, met de juiste primers.
    2. Digest deze fragmenten met de geschikte restrictie-enzymen en invoegen deze fragmenten achtereenvolgens in de pET26b vector tussen de T7 promotor en een C-terminaal tag 6xHistidine N (figuur 2A) genereren.
  2. Genereren NpuC-S-Cuta (C, tabel 1):
    1. PCR Amplify NpuC, Cuta en S fragmentatiet [AG 3 (PEG)] 10 van plasmide KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, pET30-Cuta-Tip1 10 en pQE9 AC 10 ATRP 12, respectievelijk, met de juiste primers.
    2. Digest deze fragmenten met de geschikte restrictie-enzymen en na elkaar plaats deze fragmenten in de vector pET26b tussen T7-promoter en een C-terminale naar C 6xHistidine (figuur 2B) genereren.
  3. : Tot NpuC-S-SH3 lig-Cuta (C-SH3 lig, tabel 1) genereren
    1. PCR Amplify Cuta behulp van primers die een SH3 lig (PPPALPPKRRR) en een flexibele linker (GGGGS) 2 tot fragment SH3 lig-Cuta genereren.
    2. Vervang de Cuta gen uit C met fragment SH3 lig-Cuta.
  4. Om SH3-GFP (Tabel 1) genereren:
    1. Versterken het SH3-gen uit plasmide pJD757 13 via degeschikte primers.
    2. Strijk dit fragment aan het GFP-gen en steek deze in de pET26b vector tussen de T7 promoter (figuur 2C) en een C-terminale 6xHistidine tag.

2. Eiwitexpressie

  1. Transformeren 50 pl chemisch competente Escherichia coli BL21 (DE3) met het geschikte expressieplasmide.
  2. Na transformatie, serieel verdunnen deze cellen en plaat ze op Luria-Bertani (LB) / agarplaten die 50 ug / ml kanamycine.
  3. Incubeer de platen die getransformeerde cellen bij 37 ° C voor ~ 15 uur.
  4. Na incubatie, kies een plaat die 50-100 kolonies bevat en resuspendeer alle kolonies in 5 ml LB-bouillon.
  5. Transfer suspensie 1 L LB-bouillon die kanamycine (50 ug / ml) en cellen groeien bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm. Bewaken van de absorptie bij 600 nm (OD 600). Grow cultuur tot OD 600 ~ 0.8.
    1. Voor C-en C-SH3 LIG, induceren eiwitexpressie door toevoeging isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) aan de kweek (1 mM eindconcentratie) en incubeer de kweek bij 37 ° C gedurende 4 uur onder schudden bij 250 rpm.
    2. Voor N en SH3-GFP Koel de cultuur ~ 18 ° C door onderdompeling van de kolf in een ijs-waterbad ~ 5 minuten. Induceren eiwit expressie door IPTG toe te voegen aan de cultuur (1 mM eindconcentratie) en incubeer de cultuur bij 18 ° C gedurende 14-18 uur onder schudden bij 250 rpm.
  6. Na eiwitexpressie centrifugeer de kweken bij 6000 g gedurende 20 min bij 4 ° C om de pellet te verzamelen. WINKEL celpellet bij -80 ° C tot gebruik.

3. Protein Purification

  1. Zuivering van N (denaturerende omstandigheden)
    1. Resuspendeer celpellets in buffer A (Tabel 2) en 10 ml / g nat pellet.
    2. Immerse de pellet suspensie in een ijs-waterbad en verstoren cellen door sonicatie (Amp 10, met 1 sec puls en 6 sec pauze gedurende 1 minuut).
    3. Centrifugeer het lysaat bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
    4. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in buffer DA (bevattende 8 M ureum) en de suspensie gecentrifugeerd bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
    5. Passeren de bovenstaande vloeistof op een 5 ml Ni-nitrilotriazijnzuur (NTA) kolom vooraf in evenwicht met buffer DA.
    6. Waskolom met 30 mi buffer DA gesupplementeerd met 45 mM imidazool. Elueer gezuiverde eiwit met 20 mi buffer DA aangevuld met 150 mM imidazool.
    7. Verlaag de ureumconcentratie in het proteïne monster <1 mM van een van de volgende methoden aangegeven in 3.1.7.1 of 3.1.7.2:
      1. Dialyze eiwit in DPBS buffer (tabel 2) bij 4 ° C geïncubeerd met buizen met <20 kDa.
      2. Centrifuge gezuiverd eiwit in een 30 & #160; kDa ultrafiltratie kolom centrifugeren op 2800 x g, 4 ° C totdat het volume kleiner dan 1 ml. Voeg 14 ml DPBS buffer aan de kolom om het eiwit monster te verdunnen. Herhaal het centrifugeren / verdunningsstappen nog drie keer.
    8. Na bufferuitwisseling, voeg dithiothreitol (DTT) het gezuiverde eiwit (laatste 2 mM) en concentreer eiwit ~ 100 mg / ml door centrifugeren door een 30 kDa ultrafiltratie kolom centrifugeren op 2800 x g, 4 ° C.
    9. Aliquot de geconcentreerde proteïneoplossing en bewaar bij -80 ° C tot gebruik.
  2. Zuivering van C en C-SH3 lig (native voorwaarde)
    1. Resuspendeer celpellets in buffer B (pH 6,0) (Tabel 2) aangevuld met 1 x proteaseremmer cocktail aan 10 ml / g nat pellet. Gebruik zure buffer om proteolytische afbraak van het doeleiwit minimaliseren.
    2. Verstoren celsuspensie door sonicatie zoals beschreven in 3.1.2. Centrifugeer de lysaten bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C en bewaar het supernatant.
    3. Pass oplosbare lysaat through 5 ml column Ni-NTA eerder geëquilibreerd met buffer B.
    4. Was de kolom met buffer B gesupplementeerd met 45 mM imidazool, en elueer het doeleiwit in 20 ml buffer B aangevuld met 150 mM imidazool.
    5. Voor C, doorgaan naar stap 3.2.6. Voor C-SH3 lig, het uitvoeren van een aanvullende ionenwisseling zuiveringsstap om gedeeltelijk afgebroken eiwit te verwijderen zoals aangegeven in stappen 3.2.5.1 naar 3.2.5.3
      1. Verminder NaCl-concentratie in C-SH3 lig tot <1 mM volgens de in 3.1.7 beschreven procedure.
      2. Laad het doeleiwit op een 5 ml anionenwisselaar kralen agarosematrix kolom vooraf geëquilibreerd met natriumfosfaatbuffer (50 mM, pH 7.0).
      3. Elueer doeleiwit uit de kolom door het uitvoeren van een gradiënt van een oplossing die 10 mM Tris-HCl pH 8,0 buffer een oplossing met dezelfde buffer aangevuld met 1 M NaCl. Neem monsters tijdens eiwitelutie en zwembad monsters met de hoogste zuiverheid gebaseerd op natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE).
    6. Bufferuitwisseling het gezuiverde eiwit in DPBS buffer, zoals beschreven in 3.1.7.
    7. Voeg DTT aan het gezuiverde eiwit (eindconcentratie 2 mM) en concentreer het eiwit -100 mg / ml met een 30 kDa ultrafiltratie spin-kolom zoals beschreven in 3.1.8. Aliquot en bewaar geconcentreerd eiwit bij -80 ° C tot gebruik.
  3. Zuivering van SH3-GFP
    1. Resuspendeer celpellets behulp Buffer A bij 10 ml / g nat pellet.
    2. Verstoren pellet schorsing door sonicatie zoals beschreven in 3.1.2.
    3. Centrifugeer het lysaat bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C en verzamel de bovenstaande vloeistof.
    4. Passeer de supernatant (oplosbare lysaat) door middel van een 5-ml-kolom Ni-NTA vooraf in evenwicht metBuffer A.
    5. Waskolom met 30 ml Buffer A, aangevuld met 45 mM imidazool. Elueer gezuiverde eiwit met 20 ml Buffer A, aangevuld met 150 mM imidazool.
    6. Bufferuitwisseling het gezuiverde eiwit in DPBS buffer met behulp van een aanpak vergelijkbaar met die in 3.1.7 beschreven en concentreer het eiwit ~ 150 mg / ml met behulp van een 30 kDa ultrafiltratie spinkolom zoals beschreven in 3.1.8.
    7. Aliquot en bewaar gezuiverd eiwit bij -80 ° C tot gebruik.
  4. SDS-PAGE-analyse van gezuiverde monsters die Cuta
    1. Verdun elk gezuiverd eiwit in tweemaal gedestilleerd water om de concentratie van NaCl tot ~ 1 mM verminderen. Op dit NaCl concentratie meeste Cuta trimeer eiwitten lopen als monomeren op SDS-PAGE gels.
    2. Meng monsters met 2x SDS-monsterbuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% Glycerol, 10% w / v SDS, 0,1% w / v broom-fenol blauw, 2% β-mercaptoethanol), geïncubeerd bij 95 ° C gedurende 5 minuten.
    3. Laad de samselen op een 12% SDS-PAGE gel. Voer elektroforese bij een constante spanning van 200 V ~ 50 minuten.
    4. Let op eiwit in de gels door kleuring met Coomassie brilliant blue R250 na de standaard protocollen (figuur 1C).

4. Hydrogel Vorming

Opmerking: het monster hydrogels in deze studie bevatten 1,6 mM van elk hydrogel bouwsteen tenzij anders vermeld. De eiwitconcentratie levert een zachte en stabiele hydrogel. VOORZICHTIG: Natriumazide (NaN3) wordt de hydrogel toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,5% w / v om bacteriële contaminatie te voorkomen. NaN 3 is zeer giftig en moet met uiterste zorg worden behandeld zoals aangegeven in het Material Safety Data Sheet.

  1. Bereken het volume van elk van de geconcentreerde eiwitten die nodig zijn om een ​​eindconcentratie van 1,6 mM bereiken in een 100 ui monster hydrogel. Bijvoorbeeld:
    Concentratie van N:100 mg / ml
    Moleculair gewicht van N: 26,3 kDa (zie tabel 1)
    Gewenste Volume: 100 pl gewenste concentratie: 1,6 mm
    figure-protocol-1
  2. Een 100 pl hydrogel (1,6 mM), meng C (x pi volume berekend volgens 4.1) met 5% NaN3 (10 pi), 100 mM DTT (5 ui) en N (y ui volume berekend volgens 4.1) in een 2 ml glazen flacon.
  3. Voeg DPBS buffer ((85 - x - y) pi) aan de flacon om een eindvolume van 100 pl te bereiken en alle componenten door een wervelende beweging met een pipetpunt handmatig mengen. Opmerking: De oplossing wordt zeer viskeus na mengen.
  4. Centrifugeer het mengsel gedurende 2 min bij 8000 xg om de luchtbellen te verwijderen.
  5. Incubeer het mengsel bij kamergedurende een nacht om de intein trans-splicing reactie tot voltooiing te komen. Bevestig hydrogel formatie door te draaien buis ondersteboven. De eiwitten zullen stromen als een hydrogel wordt gevormd.
  6. Schat de intein trans-splicing opbrengst door eerst monsters (0,5 pi elk) vóór stap na stap 4.2 en 4.5 op een SDS-PAGE gel verzameld, zoals beschreven in 3.4 (figuur 1C).

5. Immobilisatie van GFP via Docking Protein (DP) en Docking Station Peptide (DSP) Interaction

  1. Om een 50 ul-GFP gefunctionaliseerde hydrogel (1.2 mM) te maken, combineer C-SH3 lig (x pi, berekend volgens 4.1) en SH3-GFP (y pi, berekend volgens 4.1) op 1:1 molverhouding in een 1,7 ml microcentrifugebuis en incuberen van het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  2. Voeg 5% NaN3 (5 pi), 100 mM DTT (2,5 pl), (42.5 - x - y) gl DPBS dezelfde buis. Add N (y pi, berekend volgens 4.1) naar een 1:1 molverhouding van N-en C-SH3 lig te bereiken. Meng het monster met behulp van een pipet met een wervelende beweging.
  3. Centrifugeer het mengsel bij 8000 xg gedurende 2 minuten en incubeer het mengsel bij kamertemperatuur overnacht in het donker. Een hydrogel inkapselen SH3-GFP vormen tijdens incubatie.

6. Het gebruik van 1,6 mM Hydrogel als immobilisatie matrix voor enzymatische reactie in Organic Solvent

  1. Gebruik HRP als model enzym. Bereid een voorraad oplossing van HRP (28 mg / ml of 0,63 mM) in DPBS.
  2. Om een 30 ul hydrogel (1,6 mm) insluiten van HRP maken, combineren C (x pi, berekend volgens 4.1) met HRP (2 pi), 5% NaN 3 (3 pl) en DTT (1,5 pi van 100 mM) in een 1.7 ml centrifugebuis.
  3. Add N (y </ Em> ul, berekend volgens 4.1) en DPBS (23.5 - x - y) ul. Meng met een pipet tip met een wervelende beweging.
  4. Centrifugeer het mengsel bij 8000 xg gedurende 2 minuten en incubeer bij kamertemperatuur gedurende een nacht.
    LET OP: de regenten gebruikt voor de volgende activiteit test zijn zeer giftig. Gebruik specifieke veiligheidsaanbevelingen door de bijbehorende Material Safety Data Sheets.
  5. Voor enzymatische reactie onderdompelen hydrogel in 1 ml reactiecoctail die N, N-dimethyl-p-fenyleendiamine (5,8 mM), fenol (5.8 mM) en tert-butylhydroperoxide (2,9 mM) in n-heptaan 14. Handmatig verstoren de gel met behulp van een pipet om het contactoppervlak van de hydrogel en het oplosmiddel verhogen.
  6. Detect HRP product, een indofenol type kleurstof, door de optische absorptie van monsters op verschillende tijdstippen bij 546 nm in een plaatlezer (Figuur 5).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een schema voor inteïne-gemedieerde eiwit hydrogelvorming is weergegeven in figuur 1A. De bouwstenen van de hydrogel zijn de eiwit-copolymeren Cuta NpuN (N) en NpuC-S-Cuta (C) (Figuur 1A, tabel 1). NpuN / C zijn de N-/C-fragments van de natuurlijk splitsen DnaE inteïne uit Nostoc punctiforme (NPU). Cuta is een stabiele trimeric eiwit uit Pyrococcus horikoshii 4,5. Menging van gezuiverde N en C in aanwezigheid van het reductiemiddel DTT induceert de vorming van een de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit werk hebben we aangetoond de synthese van een zeer stabiele inteïne-gemedieerde proteïne hydrogel. Gebruik van een split intein kan de hydrogel voorwaardelijk worden gevormd als reactie op het mengen van twee vloeibare-fasecomponenten. Met name de splitsing intein covalent twee vloeibare fasen bouwstenen via een trans-splicing reactie, waarbij een polypeptide eenheid geflankeerd door verknoping eenheden die weer zelf assembleert een hydrogel. Het mengen geïnduceerde vorming van de hydrogel omzeilt techni...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen concurrerende financiële belangen bestaan.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag Dr David Tirrell (Caltech) erkennen voor zijn vriendelijke gift van het plasmide pQE9 AC 10 ATRP 12, dr. Tom Muir (Princeton universiteit) voor zijn vriendelijke gift van het plasmide KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japan) voor zijn vriendelijke gift van het plasmide pET30-Cuta-Tip1 10, en Dr Jay D. Keasling (UC Berkley) voor zijn vriendelijke gift van het plasmide pJD757 13 . Dit werk werd mede ondersteund door de National Science Foundation LOOPBAAN, US Air Force YIP en Norman Hackman Geavanceerde onderzoeksprogramma.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen

Phusion High Fidelity DNA polymerase

New England BioLabs

M0530S

Competent Escherichia coli BL21 (DE3)

New England BioLabs

C2527I

Luria Bertani

VWR

90003-350

Bacto Agar Media

VWR

Kanamycin sulfate

VWR

IPTG

VWR

EM-5820

Imidazole

VWR

EM-5720

Urea

VWR

EM-9510

Dithiothreitol (DTT)

Fisher

BP172-5

Protease Inhibitor cocktail

Roche Applied Science

11836153001

DPBS

VWR

82020-066

Brilliant Blue R

Acros Organics

A0297990

Sodium Azide

Fisher

AC190380050

Voorzichtig, zeer giftig

Horseradish peroxidase

Sigma

P8125-5KU

N,N-dimethyl-p-phenylene diamine

Fisher

AC408460250

Voorzichtig, zeer giftig

phenol

Fisher

AC149340500

Voorzichtig, zeer giftig

tert-butyl hydroperoxide

Fisher

AC180340050

Voorzichtig, zeer giftig

n-heptane

Acros Organics

120340010

[header]

Shaker/Incubator

Fisher Scientific

Max Q 6000

Centrifuge

Sorvall

RC 6

Sonicator

QSonica

Misonix 200

Ultrafiltration Tubes

Amicon Ultra

UFC903024

 Ni Sepharose High Performance HisTrap column

GE Healthcare Life Sciences

17-5248-01

HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column

GE Healthcare Life Sciences

17-5156-01

Plate reader

Molecular Devices

SpectraMax Gemini EM

Referenties

  1. Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels. Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).
  2. Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme. FEBS Lett. 580, 1853-1858 (2006).
  3. Zettler, J., Schutz, V., Mootz, H. D. The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction. FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).
  4. Tanaka, Y., et al. Structural implications for heavy metal-induced reversible assembly and aggregation of a protein: the case of Pyrococcus horikoshii CutA. FEBS Lett. 556, 167-174 (2004).
  5. Sawano, M., et al. Thermodynamic basis for the stabilities of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii,Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temperatures. Biochemistry. 47, 721-730 (2008).
  6. Tanaka, T., et al. Hyper-thermostability of CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly 150 degrees C. FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).
  7. Shen, W., Zhang, K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Tuning the erosion rate of artificial protein hydrogels through control of network topology. Nat. Mater. 5, 153-158 (2006).
  8. McGrath, K. P., Fournier, M. J., Mason, T. L., Tirrell, D. A. Genetically directed syntheses of new polymeric materials. Expression of artificial genes encoding proteins with repeating -(AlaGly)3ProGluGly- elements. J. Am. Chem. Soc. 114, 727-733 (1992).
  9. Ramirez, M., Guan, D., Ugaz, V., Chen, Z. Intein-triggered artificial protein hydrogels that support the immobilization of bioactive proteins. J. Am. Chem. Soc. 135, 5290-5293 (2013).
  10. Ito, F., et al. Reversible hydrogel formation driven by protein-peptide-specific interaction and chondrocyte entrapment. Biomaterials. 31, 58-66 (2010).
  11. Lockless, S. W., Muir, T. W. Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10999-11004 (2009).
  12. Shen, W., Lammertink, R. G. H., Sakata, J. K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Assembly of an artificial protein hydrogel through leucine zipper aggregation and disulfide bond formation. Macromolecules. 38, 3909-3916 (2005).
  13. Dueber, J. E., et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat. Biotechnol. 27, (2009).
  14. Bruns, N., Tiller, J. C. Amphiphilic network as nanoreactor for enzymes in organic solvents. Nano Lett. 5, 45-48 (2005).
  15. Das, D., et al. Water gelation of an amino acid-based amphiphile. Chem. Eur. J. 12, 5068-5074 (2006).
  16. Cao, Y., Li, H. Engineering tandem modular protein based reversible hydrogels. Chem. Commun. , 4144-4146 (2008).
  17. Wu, X., et al. Structural basis for the specific interaction of lysine-containing proline-rich peptides with the N-terminal SH3 domain of c-Crk. Structure. 3, 215-226 (1995).
  18. Nguyen, J. T., Turck, C. W., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N., Lim, W. A. Exploiting the basis of proline recognition by SH3 and WW domains: Design of n-substituted inhibitors. Science. 282, 2088-2092 (1998).
  19. Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins. Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Inteïne-gemedieerde synthesesplit-inteïne trans-splicingeiwitblokcopolymerenaffiniteitschromatografiehydrogelvormingenzymimmobilisatiestabiliteit in organische oplosmiddelendocking station-peptidemierikswortelperoxidase
Synthese van een inteïne gemedieerde Kunstmatige Protein Hydrogel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.