Cytotoxische werkzaamheid van fotodynamische therapie bij osteosarcoomcellen<em&gt; In Vitro</em

Samenvatting

Het protocol hier vermeld kan de evaluatie van de effectiviteit van fotodynamische therapie (PDT) in cellijnen en de optimalisering van de PDT instellingen alvorens de therapie diermodellen.

Samenvatting

De laatste jaren is het moeilijk een efficiëntere therapie tegen kanker met minder systemische bijwerkingen geweest. Daarom fotodynamische therapie is een nieuwe benadering voor een tumor selectieve behandeling.

Fotodynamische therapie (PDT) die gebruik maakt van een niet-toxisch fotosensibilisator (PS), dat na activering met licht van een bepaalde golflengte in aanwezigheid van zuurstof, genereert zuurstof radicalen die een cytotoxische reactie ¹ wekken. Ondanks de goedkeuring van bijna twintig jaar geleden door de FDA, is PDT tegenwoordig alleen gebruikt voor een beperkt aantal soorten kanker (huid, blaas) en nononcological aandoeningen (psoriasis, actinische keratose) ² te behandelen.

Het grote voordeel van het gebruik van PDT is de mogelijkheid om een ​​lokale behandeling, die systemische bijwerkingen voorkomt voeren. Bovendien kan de behandeling van tumoren bij gevoelige locaties (bijvoorbeeld rond zenuwen of bloedvaten). Hier, een intraoperative toepassing van PDT wordt beschouwd in osteosarcoom (OS), een tumor van het bot, om de primaire tumor satellieten richten achtergelaten in tumor omliggende weefsel na chirurgische resectie van de tumor. De behandeling is gericht op het verminderen van het aantal herhalingen en op het verminderen van het risico van (postoperatieve) metastase.

In de huidige studie geven we in vitro PDT procedures om de optimale PDT instellingen voor effectieve behandeling van veel gebruikte OS cellijnen die worden gebruikt om de menselijke ziekte reproduceren gevestigde intratibial OS muismodellen stellen. De opname van de PS mTHPC werd onderzocht met een spectrofotometer en fototoxiciteit werd uitgelokt met laserlicht excitatie van mTHPC bij 652 nm tot celdood beoordeeld met een WST-1 test en door het tellen van de overlevende cellen induceren. De gevestigde technieken stellen ons in staat om de optimale PDT instellingen voor toekomstige studies in diermodellen definiëren. Ze zijn gemakkelijk en snel hulpmiddel voor de evaluatie van de werkzaamheid van PDT in vivo.

Inleiding

Staat vandaag of the art behandeling van osteosarcoom (OS), een primaire bottumor, omvat een combinatie van neo adjuvante chemotherapie en chirurgie. Deze behandeling regime onthulde een verhoging van de overleving van patiënten met gelokaliseerde ziekte van ongeveer 20% voor het gebruik van chemotherapie, om nog 60-70% ^{3, 4.} Echter, in de laatste twee decennia, de algehele overleving van OS patiënten met plaatselijke ziekte is plateaued ^{4, 5.} Bovendien 30-40% van de patiënten een recidief binnen 3 jaar na diagnose en patiënten met metastasen steeds een slechte overleving van 20-30% ^{4, 6, 7} hebben. De uitkomst van deze patiënten te verbeteren, moeten nieuwe therapeutische strategieën worden ontwikkeld.

Fotodynamische therapie (PDT), een vrij nieuwe therapie tegen kanker, maakt gebruik van licht van een specifieke golflengte voor excitatie van een photosensiTizer (PS), dat zich ophoopt in de tumorcellen na injectie in de bloedbaan. Laserlicht excitatie van de PS genereert zuurstofradicalen in aanwezigheid van zuurstof cytotoxische reactie in tumorcellen en celdood induceren. Naast deze primaire mechanisme, twee extra PDT opgeroepen biologische processen bijdragen aan verminderde tumorgroei: PDT veroorzaakt vasoconstrictie en bloedpropvorming van de tumor microvasculature en bijgevolg lokale hypoxie en anoxie in de tumor, wat leidt tot tumor infarct. Tenslotte PDT gewond en stervende tumorcellen leiden tot een lokale immuunreactie, een vrij unieke eigenschap van PDT. Dit houdt het complementsysteem en de activering van antigeen-presenterende dendritische cellen ^8. Zo worden voorwaarden geschapen voor de presentatie van tumorantigenen met daaropvolgende activatie van lymfoïde cellen, leidend tot tumorspecifieke immuniteit.

Tot dusver is PDT gebruikt om verschillende soorten wekedelentumoren en hyperpl behandelenazië, zoals actinische keratose, Barrett-slokdarm, endobronchiale tumoren, blaaskanker, basaalcelcarcinoom en palliatieve behandeling van hoofd-halskanker ^2. De behandeling is bekend dat lokale, grootschalige necrose met weinig bijwerkingen, en heeft dus de potentie om tumorweefsel selectief roeien. Ondanks deze voordelen, de toepassing van PDT blijft technisch veeleisender dan de toediening van chemotherapeutische geneesmiddelen. Met het oog op maximale efficiëntie, de PS concentratie, blootstelling aan licht en de totale licht energie-overdracht te realiseren moeten worden geoptimaliseerd. Dit kan in vivo experimenten, maar vanwege het relatief grote aantal parameters die moeten worden geoptimaliseerd, is het efficiënter om eerst te bepalen optimale omstandigheden in vitro.

In de hieronder beschreven experimenten hebben we de in vitro werkzaamheid van PDT getest met PS 5,10,15,20-tetrakis (meta-hydroxyfenyl) chlOrin, afgekort mTHPC (Figuur 1A). mTHPC is de werkzame stof in het geneesmiddel foscan, die momenteel wordt gebruikt in de kliniek voor palliatieve behandeling van hoofd-en halskanker. Het is een van de meest potente PS, induceren massieve celbeschadiging reeds bij lage concentraties, en werd aangetoond superieur aan andere PS zijn in termen van weefselpenetratie ^{9, 10.} Het licht absorptiespectrum (figuur 1B) toont twee prominente pieken, een bij 417 nm en een tweede bij 652 nm, die worden gebruikt voor weefsellokalisatie van het verzamelen PS en PDT inductie, respectievelijk.

Momenteel is een liposomale formulering voor mTHPC is in ontwikkeling. Hier beschrijven we de procedures om de opname van deze liposomale formulering te kwantificeren, en PDT presteren in twee menselijke OS cellijnen, de lage metastatische HOS en de hoge metastatische 143B cellen. Sommige van de hier gepresenteerde gegevens zijn eerder ¹¹ vermeld. The hier beschreven aanpak stelt ons in staat om het effect van een metastatische fenotype op PDT effectiviteit te bestuderen. 143B cellen, orthotopically geïnjecteerd in de achterste ledematen van immuun deficiënte SCID muizen veroorzaken intratibial metastasizing primaire tumoren, een model nauw nabootsen van de menselijke uitzaaiingen ziekte. Dus de voorgestelde in vitro experimenten zijn uitermate geschikt om te beoordelen de optimale instellingen PDT later gebruik in in vivo experimenten.

Protocol

1. Vergelijking van de opname van mTHPC in de respectieve lage en zeer gemetastaseerde HOS en 143B OS cellijnen

1. Bereid celcultuur medium met DMEM, Ham F12, en warmte geïnactiveerd foetaal kalf serum in een verhouding 4.5:4.5:1.
   Opmerking: De liposomale formulering van de PS mTHPC werd opgelost in water bij een eindconcentratie van 1,5 mg / ml mTHPC.
2. Plaat 0,2 x 10 ⁶ HOS en 143B cellen / putje in 6-well platen (drievoud voor elke conditie) en laat de cellen hechten overnachten.
   Opmerking: het aantal worden aangepast aan de individuele cellijnen. Een confluentie van 80-90% het meest geschikt ten tijde van het experiment.
3. Op de volgende dag, incubeer de cellen met een vaste concentratie van mTHPC voor verschillende perioden (tijdsafhankelijke opname), of met toenemende concentraties van mTHPC gedurende een vaste periode (dosis-afhankelijk opname).
4. Incubeer de cellen met mTHPC voor bepaalde tijd points of concentraties van mTHPC.
   Opmerking: In dit onderzoek, zowel de HOS en 143B cellijnen werden geïncubeerd met 0,6 ug / ml mTHPC voor 0, 2.5, 5, of 10 uur, of 0, 0,6, 2,5 en 10 ug / ml mTHPC 5 uur. De toegepaste perioden en doseringen kunnen variëren afhankelijk van de cellijn die wordt gebruikt.
5. Vergeet niet om altijd in het donker of in gedempt licht omstandigheden aan direct licht blootstelling van de cellen te voorkomen.
6. Na incubatie van de cellen bij de aangegeven omstandigheden, zuig het medium en was de cellen driemaal met PBS. Vervolgens maak de cellen met 0,5 ml trypsine / EDTA en tel de cellen.
7. Na losmaken, centrifuge de cellen bij 400 g gedurende 5 minuten, zuig het medium en resuspendeer de cellen in PBS tot een uiteindelijke dichtheid van 200.000 cellen / ml.
8. Pipetteer 100 ul van de verkregen celsuspensie (bijvoorbeeld 20.000 cellen) in een 96-wells plaat en meet de fluorescentie van deze cellen in een fluorescentie spectrofotometer. De instellings voor mTHPC fluorescentie metingen zijn: 417 nm voor de excitatie en 652 nm voor de emissie.
9. Om de hoeveelheid per cel geïnternaliseerd mTHPC berekening normaliseert de relatieve fluorescentie eenheid (RFU) voor het aantal cellen en celvolume als volgt:
10. Bereid een standaard curve met behulp van verschillende concentraties mTHPC in PBS 0-4 ug / ml (gebruik drievoud metingen). Pipetteer 100 ul van elke verdunning in een 96-wells plaat en meet de fluorescentie van de putten met de in stap 1.6 beschreven instellingen.
11. Verdeel de RFU (verkregen 20.000 cellen) door de helling van de lineaire standaardkromme van mTHPC, waarin de concentratie van mTHPC (in ug / ml) in de put geeft.
12. Verdeel deze mTHPC concentratie 10 aan de totale hoeveelheid mTHPC in een putje (in mg, die 100 gl celsuspensie) krijgen en verdeel deze waarde door de hoeveelheid van 20.000 cellen.
13. Bereken het volume met de formule voor een bol: (4/3 x π) xr ^3. Haal de straal r van de diameter van 20 getrypsiniseerd cellen onder een microscoop en deze waarde te delen door 2.
14. Tenslotte normaliseren alle waarden die verkregen HOS-cellen na 10 uur incubatie (dosisafhankelijk opname) of behandeld met 10 ug / ml mTHPC (tijdsafhankelijke opname), die zijn ingesteld op 100%.

2. Meting van de fototoxiciteit van PS in vitro

1. Seed 3000 cellen / putje in een 96-well plaat (drievoud voor elke concentratie van mTHPC gebruikt) en laat ze zich 's nachts. Evenzo bereidt een extra 96-well plaat en behandelen cellen zoals hierna beschreven, maar zet ze opzij voor fasecontrast.
   Opmerking: het aantal worden aangepast voor elke cellijn. Een confluentie van 50-60% op het moment van het experiment is ideaal.
   1. Houd in gedachten de corresponderende donkere toxiciteit controle cellen, voor elke van de mTHPC concentraties. Dese cellen die in de afwezigheid of aanwezigheid van bepaalde concentraties mTHPC worden geïncubeerd, maar niet verlicht.
2. De volgende dag, incubeer de cellen met verschillende concentraties mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0.03, 0.075, 0.15, 0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 5, en 10 ug / ml) afhankelijk van de cellijnen en houden in het donker gedurende 5 uur.
   1. Zie sectie 1.3.2
      Opmerking: De incubatietijd voor verlichting afhankelijk van de cellijn en de PS gebruikt, daarom is het raadzaam om verschillende concentraties en verschillende tijdstippen testen afzonderlijke experimenten.
3. Na incubatie gedurende de vermelde periode, was de cellen tweemaal met PBS en voeg nieuwe vers medium zonder mTHPC.
4. Verlicht de cellen met een 652 nm diodelaser, specifiek voor de mTHPC absorptiespectrum (zie Figuur 1).
   1. Stel de laser 21,88 mW / cm ² vermogen op een hoogte van 13,5 cm distance van de cellen teneinde een energie dosis van 5 J / cm ² krijgen. Verlichten de cellen voor 230 sec. Niet verlichten de donkere toxiciteit controle cellen (met en zonder mTHPC).
      Opmerking: Draag altijd een bril om de ogen te beschermen tegen het laserlicht gebruikt voor excitatie van de PS.
5. Na belichting, houden de cellen in het donker bij 37 ° C gedurende 24 uur. Vervolgens voeg water oplosbare tetrazolium (WST-1) reagens (10 μl/100 ul medium).
6. Drie uur na de toevoeging van de WST-1 reagens, meet de absorptie van de afzonderlijke putjes van de 96-well plaat bij 415 nm.
7. Om het percentage overlevende cellen berekenen set het gemiddelde van de verkregen resultaten voor de niet mTHPC behandelde cellen voor elke conditie 100% (dwz verlicht zonder mTHPC en nonilluminated zonder mTHPC) waarden.

3. Schatting van het aantal cellen door Celtelling

1. Seed 20.000 cellen / well in een 24-well plaat en laat ze zich 's nachts.
2. Incubeer de cellen gedurende 5 uur met mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6 en 1,25 ug / ml) en verlichten ze als hierboven beschreven.
3. Verzamel het medium, was de cellen eenmaal met PBS, trypsinize ze en verzamel door centrifugatie bij 400 xg gedurende 5 minuten.
4. Na centrifugatie zuig het medium en resuspendeer de cellen in 200 pl vers medium.
5. Tel de cellen in een Neubauer kamer.

Resultaten

Met de hier gerapporteerde technieken onderzochten we mTHPC-gebaseerde PDT in menselijke OS cellen. Ten eerste, de tijd en dosis afhankelijke opname van mTHPC onderzocht in lage metastatische HOS en in de zeer metastatische 143B OS cellijnen. mTHPC opname kan worden beoordeeld door het meten van de fluorescentie van mTHPC met een fluorescentie spectrofotometer (figuur 2, weergegeven met toestemming van Reidy et al.. ^11). Figuur 2A illustreert de opname van mTHPC op e...

Discussie

Om optimale cytotoxiciteit in reactie op PDT bereiken, is het cruciaal om de juiste laserlicht instellingen en incubatietijden kiezen. De hier beschreven procedures zijn consistent en efficiënt naar PS opname te bepalen en PDT geïnduceerde cytotoxiciteit kwantificeren in vitro. De specifieke absorptie golflengten van de PS mTHPC, kan de cellulaire PS opname worden bepaald in een directe wijze en het PS kan worden geactiveerd om cytotoxische reactieve zuurstof species genereren.

Met ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DMEM	PAA GmbH, Freiburg, Duitsland	E15-883
HAM F12	PAA GmbH, Freiburg, Duitsland	E15-817
Heat-inactivated foetaal runderserum	GIBCO, Basel, Zwitserland	10500-064
mTHPC	biolitec Research GmbH, Jena, Duitsland		Aangezien deze liposomale formulering afkomstig is van R&D is er op dit moment geen catalogusnummer beschikbaar. Voorraad: 1,5 mg/ml; geleverd in een 9:1-mengsel van dipalmitoylfosfatidylcholine (DPPC) en dipalmitoylfosfatidylglycerol (DPPG; >99% zuiverheid)
Spectramax Gemini XS plate reader	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	ID# 861
Microscope Zeiss Observer.Z1	Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Duitsland
Ceralas PDT 652 nm Laser	biolitec AG, Jena, Duitsland	LD652nm2W400u
Wateroplosbaar tetrazolium (WST) reagens	Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Zwitserland	1644807