Respiratoir falen is de belangrijkste doodsoorzaak na een cervicale dwarslaesie. Met een reproduceerbare, kwantificeerbaar en betrouwbaar preklinische diermodel van ademhalingsfalen veroorzaakt door een gedeeltelijke cervicale letsels zullen helpen om de volgende respiratoire als niet-respiratoire neuroplasticiteit begrijpen en kan getest vermoedelijke reparatiestrategieën.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een muizenmodel van cervicale Spinal Cord Injury Study Post-letsels Respiratory Neuroplasticity
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een cervicale dwarslaesie veroorzaakt permanente verlamming, en leidt vaak tot ademnood. Tot op heden zijn nog geen doeltreffende therapieën ontwikkeld te verbeteren / verbeteren van de respiratoire insufficiëntie volgende hoge cervicale dwarslaesie (SCI). Hier stellen we een muizen preklinisch model van hoge SCI bij de cervicale 2 (C2) metamere niveau om diverse post-letselvrije respiratoire neuroplasticiteit te bestuderen. De techniek bestaat uit een chirurgische gedeeltelijke schade aan het C2 niveau, dat een hemiparalysis van het membraan zal induceren door een deafferentatie van het diafragma motoneuronen van de respiratoire centra in de hersenstam. De contralaterale zijde van de schade blijft intact en kan het dier herstel. In tegenstelling tot andere gebieden van communautair belang die de motorische functie (bij de thoracale en lumbale niveau) beïnvloeden, heeft de functie van de luchtwegen geen dierlijke motivatie nodig hebben en de kwantificering van het tekort / herstel kan gemakkelijk worden uitgevoerd (membraan en diafragma zenuw opnames, hele lichaam ventilatie). Deze pre-klinische C2 SCI model is een krachtige, bruikbare en betrouwbare pre-klinisch model te bestuderen verschillende respiratoire als niet-respiratoire neuroplasticiteit gebeurtenissen op verschillende niveaus (moleculaire fysiologie) en diverse vermeende therapeutische strategieën die de ademhaling in kunnen verbeteren testen SCI patiënten.
Inleiding
Ruggenmergtrauma een gemeenschappelijk schade waargenomen in de humane populatie met dramatische incidenten, zoals permanente verlamming. De ernst van het letsel is afhankelijk van het niveau en de mate van de aanvankelijke trauma. Respiratoir falen is de belangrijkste oorzaak van sterfte bij de bovenste cervicale dwarslaesie (SCI) 1. Momenteel is de enige therapeutische behandeling aan de patiënt te plaatsen onder ventilatieondersteuning. Sinds enkele patiënten kunnen worden gespeend de ventilatoire bijstand 2, als gevolg van spontaan herstel die optreedt met post-letsels vertraging, de noodzaak om nieuwe innovatieve niet-invasieve therapieën te ontwikkelen is urgent 3. Na een goede standaard preklinisch model om het effect van een cervicale SCI op respiratoire insufficiëntie onderzoeken en derhalve de toepassing van potentiële therapeutische strategieën te bestuderen, is essentieel.
In dit technische artikel beschrijven we een bepaalde pre-klinische muizenmodel of ademhalingsstoornissen veroorzaakt door een gedeeltelijke cervicale SCI op het C2 niveau. Dit model wordt momenteel gebruikt door verschillende laboratoria over de hele wereld (voor overzichten: 4-13). Toch kunnen kleine verschillen in de chirurgische procedure worden waargenomen bij de verschillende onderzoekers dit cervicale letsels muizenmodel genereren. Het effect van een C2 SCI op de ademhalingswegen uitgang werd eerst beschreven in 1895 door Porter 14. Een cervicale hemisectie induceert een deafferentatie van het diafragma motoneuronen van de centrale aandrijving (in het rVRG in de hersenstam, figuur 1A) op de ipsilaterale zijde van schade leidt tot een stille diafragma zenuw activiteit en de daaropvolgende verlamming membraan. De contralaterale zijde blijft intact en kan het dier te overleven. Unlike verschillende SCI in een lagere spinale segment (bijvoorbeeld een contusive schade op C4 level 15), wordt de integriteit van het diafragma motoneuron kern aan beide zijden bewaard. Na een CERVical C2 letsel, kan een aantal spontane activiteit worden waargenomen op de ipsilaterale zijde (diafragma en diafragma) als gevolg van een activering van contralaterale stille synaptische paden die de spinale middellijn op het segmentale niveau C3-C6 (Crossed phrenic paden, CPP, figuur 1B) gekruist . De activering van de CPP, die, per definitie, een C2 hemisectie gecombineerd met een contralaterale phrenicotomy die een ipsilaterale gedeeltelijke diafragma zenuw herstel induceren, kan van uren tot weken na het letsel 16-18. De werkelijke gunstige effect van deze CPP route op de luchtwegen herstel beperkt 19 en verder onderzoek en behandeling worden ontwikkeld om de omvang van spontane herstel 3 verbeteren.
Dit protocol biedt een krachtige vorm van pre-klinische muismodel voor de ademhalingswegen post-letselhuidweefsel plasticiteit studeren op verschillende niveaus (ademhalingsfysiologie van pre-en diafragma motoneuronen, interneuronen, moleculaire en cellulaire enr, locomotie van het voorste ledemaat bijvoorbeeld) en een model voor invasieve en niet-invasieve therapeutische strategieën gericht op de ademhaling en bewegingsapparaat herstel na C2 gedeeltelijke cervicale ruggenmerg letsel verbeteren testen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol werd goedgekeurd door de Ethische commissie van de RBUCE-UP stoel of Excellence (Universiteit van Paris Sud, subsidieovereenkomst nr. 246556) en de Universite de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines.
1. Bereiding van gesteriliseerd chirurgische instrumenten
- Reinig de chirurgische instrumenten met laboratorium wasmiddel.
- Autoclaaf de instrumenten voorafgaand aan de operatie.
- In een chirurgische sessie steriliseren instrumenten door het plaatsen van de uiteinden in een hete kraal sterilisator gedurende 10 minuten bij 180 ° C tussen 2 operaties.
2. Bereiding van Drugs
- Bereid 2 x 1 ml spuiten voor pre-anesthetica cocktail en na de operatie drugs.
- Volgens het gewicht van de rat, bereid een spuit met pre-anaesthetica: Carprofen (5 mg / kg), buprenorfine (50 ug / kg), Baytril (5 mg / kg) en dexmedetomidine (0,5 mg / kg). Vul het volume aan met Ringer-lactaat voor 1 ml.
- Bereiden inandere spuit de ommekeer voor de pre-anesthetica: Atipamezole (500 ug / kg).
3. Anesthesie van de Rat
- Subcutaan toedienen aan het dier de oplossing van pre-anesthetica in stap 2.2 beschreven. Zet dan het dier terug in de kooi en wacht tot het kalmerend effect verschijnt.
- Plaats de rat in een gesloten kamer gevuld met 5% isofluraan in 100% O 2, en wacht tot de respiratoire ritme vertraagt (ongeveer 30 sec). Verwijder vervolgens de rat uit de kamer en plaats deze op de intubatie tafel.
4. Orotracheale intubatie
- Liggen het dier op zijn rug, zet vervolgens het hoofd door het plaatsen van een riem aan zijn voortanden aan de tafel.
- Met een glasvezel licht, het licht van de thoracale ruimte. Plaats dan een laryngoscoop (of een op maat gemaakt is, Jou et al.. 20 voor details) in de mond van het dier. Visualiseer de stembanden.
- Gleede en plaats een orotracheale gids in de luchtpijp (tussen de stembanden). Schuif de orotracheale buis (16 G katheter formaat) op de geleider.
- Verwijder de gids en controleer met een keelspiegel aan het eind van de buis orotracheale de aanwezigheid van vocht, waarin de juiste positie van de buis in de luchtpijp en niet in de slokdarm.
- Sluit de buis aan een knaagdier ventilator (683 knaagdier ventilator, Harvard Apparatus) en stel de concentratie van isofluraan tot 2% (in 100% O 2).
- Zet de orotracheale buis met chirurgische tape.
5. Spinale chirurgie
- Plaats het dier ventrale decubitus positie op een verwarmde chirurgische plaat, met de neus wijzend op 90 ° hoek met de chirurg. Handhaaf het lichaam temperatuur rond 37,5 ° C gedurende de operatie.
- Scheer het haar met tondeuse tussen de schouderbladen en verwijder het haar met een gaasje.
- Reinig de huid met betadine, daarna met 70% alcohol. Herhaal deze stap 3x.
- Een teen knijpen wordt uitgevoerd vóór het begin van de operatie om de juiste narcose diepte zorgen. Voer vervolgens een laterale incisie rostro-caudaal met een schaar tussen de schouderbladen.
- Snijd de acromiotrapezius spier rostro-caudaal door de pees om het bloeden te voorkomen. Distantiëren dan de ruitvormige spier om de spinalis spieren (rond de wervel).
- Trek de SpinaliS spier van C1 tot C3 wervel. De C2 wervel is degene met een prominente apophysis.
- Maak de spieren rond het dorsale gedeelte van de wervel door steriele wattenstaafjes.
- Start om verwijder voorzichtig de apophysis van C2 met een rongeur. Ga vervolgens zorgvuldig totdat de dorsale ruggenmerg wordt blootgesteld. Zorg ervoor dat laminectomie is een dorsale hemi laminectomie. Besteden veel aandacht aan de dura die het ruggenmerg, en slagaders in de buurt van dit gebied omsluit.
- Met een # 55 tang, ontleden rostro-caudaal de dura langs C2, daarna verder lateraal op elke rostrale en caudale kant.
- Spons de cerebrospinale vloeistof.
- Maak een laterale gedeelte onder de cervicale dorsale wortel nummer 2 met de microscissors. Controleer met een micro scalpel dat de omvang van de laesie dicht genoeg bij de middellijn van het ruggenmerg (zie figuur 2A een dorsaal aanzicht van de verwonding) te bereiken. Zo niet, dan een snede kan worden gemaakt om de schade te voltooien. In het geval van bloeden, gebruik steriele wattenstaafjes. Wees voorzichtig niet te gaan naar de contralaterale zijde, anders zal het dier niet te herstellen van de schade en zal een respiratoire insufficiëntie hebben.
- Hecht de spieren als een beschermende laag en hechtdraad terug de huid. Reinig de wond met Betadine verzadigd steriel gaasje.
- Turn-off van de isofluraan vaporizer en injecteer de omkering drugs (Atipamezole [500 ug / kg, im]), controleer dan de lichaamstemperatuur.
- Wanneer het dier begint te ademen tegen het beademingsapparaat,koppel de tracheatube van de ventilator, en verwijder vervolgens de orotracheale buis. Plaats het dier in een verwarmde kooi voor herstel.
6. Post-chirurgische zorg
Na de operatie worden de dieren voortdurend gecontroleerd om ervoor te zorgen de best mogelijke omgeving voor herstel. Antibiotica (Baytril, 5 mg / kg), anti-inflammatoire (Carprofen, 5 mg / kg) en buprenorfine (50 ug / kg) drugs worden om de 12 uur gedurende de eerste 2 dagen na chirurgie om infecties te voorkomen en verminderen het optreden van post-operatieve pijn. Ratten hebben toegang ad libitum te zacht voedsel en water (of jellified water voor de 1e dag na de operatie). Subcutane vloeistoffen kunnen worden gebruikt om uitdroging van de eerste postoperatieve dagen voorkomen. Het lichaamsgewicht en de voedselinname dagelijks gevolgd. Hun omgeving wordt verrijkt gedurende het experiment en de tijd na het letsel (dubbele huisvesting, slangen in hun kooien).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Omvang van de schade
Het succes en de reproduceerbaarheid van dit experimentele model zijn afhankelijk van de ervaring van elke manipulator / chirurg. De daaropvolgende bedrag van respiratoire herstel (diafragma zenuw activiteit en diafragma activiteit) na een C2 blessure is gecorreleerd met de resterende ventrolaterale gespaard witte stof 21. Aangezien de schade is "handgemaakt" en vereist enige oefening van de chirurg, de omvang van elke schade moet wo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Technische moeilijkheden van het maken van de C2 Injury Model
De C2 letsel muismodel is een interessant instrument om de luchtwegen na lesional neuroplasticiteit te bestuderen. De stappen die nodig zijn om een reproduceerbaar en betrouwbaar model te produceren zijn talrijk en elk kan hebben voor de resultaten van de studie. Bijvoorbeeld tijdens de intubatie proces uiterste zorg te worden genomen omdat de orotracheale buis een ontsteking van de luchtpijp kan produceren, wat...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt ondersteund door financiering van de Europese Unie Zevende Kaderprogramma (FP7/2007-2013) onder subsidieovereenkomst nr. 246556 (Europees project RBUCE-UP), HandiMedEx toegewezen door de Franse Public Investment Board. Marcel Bonay werd gesteund door de Kanselarij des Universites de Paris (Benen Poix), het Fonds de Dotatie Recherche en Sante respiratoire, en het Centre d'Assistance respiratoire à Domicile d'Île de France (CARDIF)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dier | |||
| Male Sprague Dawley Rat | Janvier | 225-250 g | |
| Chirurgische Instrumenten | |||
| Student Dumont #5 forceps | Fine Science Tool | 91150-20 | |
| Student Standard Pattern Forceps | Fine Science Tool | 91100-12 | |
| Mayo-Stille Scissors | Fine Science Tool | 14013-15 | Gebogen |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tool | 91500-09 | Recht |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tool | 15025-10 | Recht stomp/stompe |
| Friedman Pearson Rongeur | Fine Science Tool | 16121-14 | Gebogen |
| Dissecting Knife - Fine Tip | Fine Science Tool | 10055-12 | Recht |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tool | 12002-14 | Gekarteld |
| Weitlaner-Locktite Retractor | Fine Science Tool | 17012-11 | 2x3 stomp |
| Absorbeerbare chirurgische hechtingen | Centravet | BYO001 | Hechtdraadmaat 4-0 |
| Apparatuur | |||
| Hot Bead Steriliser | Fine Science Tool | 18000-45 | |
| Catheter | Centravet | CAT188 | 16 G |
| Laryngoscope | |||
| Leidraad | |||
| Laryngeale spiegel | Centravet | MIR011 | |
| Lactated Ringers | Centravet | RIN020 | |
| Spuit | Centravet | ||
| Naald | Centravet | ||
| O2 | Air Liquid | I1001M20R2A001 | |
| 683 RodentT Ventilator 115/230V | Harvard Apparatus | 55-0000 | |
| Stand-Alone Vaporizer | WPI | EZ-155 | |
| Thin line verwarmd bed | WPI | EZ-211 | |
| Luchtbus | WPI | EZ-258 | |
| Geneesmiddelen | |||
| Carprofen | Centravet | ||
| Rimadyl | Centravet | RIM011 | |
| Buprenorphine | Centravet | BUP001 | |
| Baytril | Centravet | BAY001 | |
| Dexmedetomidine | Centravet | DEX010 | |
| Atipamezole | Centravet | ANT201 | |
| Betadine oplossing | Centravet | VET002 | |
| Isofluraan | Centravet | VET066 |
Referenties
- Frankel, H. L., et al. Long-term survival in spinal cord injury: a fifty year investigation. Spinal Cord. 36, 266-274 (1998).
- Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research - a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38, 449-472 (2000).
- Zimmer, M. B., Nantwi, K., Goshgarian, H. G. Effect of spinal cord injury on the respiratory system: basic research and current clinical treatment options. J Spinal Cord Med. 30, 319-330 (2007).
- Mantilla, C. B., Sieck, G. C. Neuromuscular adaptations to respiratory muscle inactivity. Respir Physiol Neurobiol. 169, 133-140 (2009).
- Goshgarian, H. G. The crossed phrenic phenomenon and recovery of function following spinal cord injury. Respir Physiol Neurobiol. 169, 85-93 (2009).
- Nantwi, K. D. Recovery of respiratory activity after C2 hemisection (C2HS): involvement of adenosinergic mechanisms. Respir Physiol Neurobiol. 169, 102-114 (2009).
- Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
- Lane, M. A., Lee, K. Z., Fuller, D. D., Reier, P. J. Spinal circuitry and respiratory recovery following spinal cord injury. Respir Physiol Neurobiol. 169, 123-132 (2009).
- Seeds, N. W., Akison, L., Minor, K. Role of plasminogen activator in spinal cord remodeling after spinal cord injury. Respir Physiol Neurobiol. 169, 141-149 (2009).
- Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
- Vinit, S. Cervical spinal cord injuries and respiratory insufficiency: a revolutionary treatment. Med Sci (Paris. 28, 33-36 (2012).
- Kastner, A., Gauthier, P. Are rodents an appropriate pre-clinical model for treating spinal cord injury? Examples from the respiratory system). Exp Neurol. 213, 249-256 (2008).
- Vinit, S., Lovett-Barr, M. R., Mitchell, G. S. Intermittent hypoxia induces functional recovery following cervical spinal injury. Physiol Neurobiol. 169, 210-217 (2009).
- Porter, W. T. The Path of the Respiratory Impulse from the Bulb to the Phrenic Nuclei. J Physiol. 17, 455-485 Forthcoming.
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
- Goshgarian, H. G. The crossed phrenic phenomenon: a model for plasticity in the respiratory pathways following spinal cord injury. J Appl Physiol. 94, 795-810 (2003).
- Vinit, S., Gauthier, P., Stamegna, J. C., Kastner, A. High cervical lateral spinal cord injury results in long-term ipsilateral hemidiaphragm paralysis. J Neurotrauma. 23, 1137-1146 (2006).
- Fuller, D. D., Johnson, S. M., Johnson, R. A., Mitchell, G. S. Chronic cervical spinal sensory denervation reveals ineffective spinal pathways to phrenic motoneurons in the rat. Neurosci Lett. 323, 25-28 (2002).
- Dougherty, B. J., Lee, K. Z., Lane, M. A., Reier, P. J., Fuller, D. D. Contribution of the spontaneous crossed-phrenic phenomenon to inspiratory tidal volume in spontaneously breathing rats. J Appl Physiol. 112, 96-105 (2012).
- Jou, I. M., et al. Simplified rat intubation using a new oropharyngeal intubation wedge. J Appl Physiol. 89, 1766-1770 (2000).
- Fuller, D. D., et al. Graded unilateral cervical spinal cord injury and respiratory motor recovery. Respir Physiol Neurobiol. 165, 245-253 (2009).
- Vinit, S., Windelborn, J. A., Mitchell, G. S. Lipopolysaccharide attenuates phrenic long-term facilitation following acute intermittent hypoxia. Respir Physiol Neurobiol. 176, 130-135 (2011).
- Ahmad, F., Wang, M. Y., Levi, A. D. Hypothermia for Acute Spinal Cord Injury-A Review. World Neurosurg. , (2013).
- Lovett-Barr, M. R., et al. Repetitive intermittent hypoxia induces respiratory and somatic motor recovery after chronic cervical spinal injury. J Neurosci. 32, 3591-3600 (2012).
- Minor, K. H., Akison, L. K., Goshgarian, H. G., Seeds, N. W. Spinal cord injury-induced plasticity in the mouse--the crossed phrenic phenomenon. Exp Neurol. 200, 486-495 (2006).
- Baussart, B., Stamegna, J. C., Polentes, J., Tadie, M., Gauthier, P. A new model of upper cervical spinal contusion inducing a persistent unilateral diaphragmatic deficit in the adult rat. Neurobiol Dis. 22, 562-574 (2006).
- Golder, F. J., et al. Breathing patterns after mid-cervical spinal contusion in rats. Exp Neurol. 231, 97-103 (2011).
- Lane, M. A., et al. Respiratory function following bilateral mid-cervical contusion injury in the adult rat. Exp Neurol. 235, 197-210 (2012).
- Vinit, S., et al. Axotomized bulbospinal neurons express c-Jun after cervical spinal cord injury. Neuroreport. 16, 1535-1539 (2005).
- Guenther, C. H., Windelborn, J. A., Tubon, T. C., Yin, J. C., Mitchell, G. S. Increased atypical PKC expression and activity in the phrenic motor nucleus following cervical spinal injury. Exp Neurol. 234, 513-520 (2012).
- Mantilla, C. B., Gransee, H. M., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Motoneuron BDNF/TrkB signaling enhances functional recovery after cervical spinal cord injury. Exp Neurol. 247, 101-109 (2013).
- Vinit, S., Darlot, F., Aoulaiche, H., Boulenguez, P., Kastner, A. Distinct expression of c-Jun and HSP27 in axotomized and spared bulbospinal neurons after cervical spinal cord injury. J Mol Neurosci. 45, 119-133 (2011).
- Windelborn, J. A., Mitchell, G. S. Glial activation in the spinal ventral horn caudal to cervical injury. Respir Physiol Neurobiol. 180, 61-68 (2012).
- Vinit, S., Stamegna, J. C., Boulenguez, P., Gauthier, P., Kastner, A. Restorative respiratory pathways after partial cervical spinal cord injury: role of ipsilateral phrenic afferents. Eur J Neurosci. 25, 3551-3560 (2007).
- Dougherty, B. J., et al. Recovery of inspiratory intercostal muscle activity following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 183, 186-192 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
