Neuronale membraan mensenhandel stelt dynamisch plasmamembraaneiwit beschikbaarheid en significant invloed neurotransmissie. Tot op heden, is het een uitdaging om neuronale endocytische handel in volwassen neuronen te meten. Hier beschrijven we een zeer effectieve, kwantitatieve methode om snelle veranderingen in de oppervlakte-eiwit expressie ex vivo bij acute plakjes hersenen te meten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Gereglementeerde endocytische mensenhandel is het centrale mechanisme faciliteren van een verscheidenheid van neuromodulatory gebeurtenissen, door het dynamisch regelen van receptor, ionkanalen en vervoerder oppervlak cel presentatie op een minuten tijdschaal. Er is een grote diversiteit van mechanismen die endocytisch handel in individuele eiwitten controleren. Studies die de moleculaire onderbouwing van mensenhandel hebben voornamelijk ingeroepen oppervlak biotinylatie om kwantitatief veranderingen in membraaneiwit oppervlakte-expressie te meten in reactie op exogene prikkels en genetische manipulatie. Echter, deze benadering is voornamelijk beperkt tot gekweekte cellen, die niet trouw kunnen weerspiegelen de fysiologisch relevante mechanismen die een rol spelen bij volwassen neuronen. Bovendien kan gekweekte cel benaderingen regio-specifieke verschillen in de handel mechanismen onderschatten. Hier beschrijven we een aanpak die celoppervlak biotinylering uitstrekt tot de acute hersenen slice voorbereiding. Wijaantonen dat deze methode zorgt voor een high-fidelity aanpak van snelle veranderingen in de membraan eiwitoppervlak niveaus in volwassen neuronen te meten. Deze benadering is waarschijnlijk brede bruikbaarheid op het gebied van neuronale endocytische handel hebben.
Inleiding
Endocytische mensenhandel is een alomtegenwoordige cellulair mechanisme dat verfijnt de plasmamembraan presentatie van een verscheidenheid van integrale membraaneiwitten. Endocytosis levert vitale voedingsstoffen aan het intracellulaire milieu 1 en ongevoelig receptor signalering in respons op receptoractivering 2. Endocytische recycling terug naar de plasmamembraan kan bovendien versterken cellulaire signalering door verhogend eiwit expressie op het celoppervlak 3. Bovendien worden membraantransport verstoringen betrokken bij tal van ziekten en pathologische omstandigheden 4,5, gewezen op de noodzaak om de moleculaire mechanismen die eiwit endocytische mensenhandel regeren onderzoeken. Hoewel veel eiwitten gebruiken klassieke clathrin-afhankelijke internalisatie mechanismen, steeds meer aanwijzingen over de afgelopen jaren laat zien dat meerdere clathrin-onafhankelijke endocytische mechanismen regelen de endocytische potentieel van een toenemende aanbod vaneiwitten 6,7. Zo heeft de noodzaak om endocytische mechanismen vergemakkelijken handel in fysiologisch relevante systemen te onderzoeken flink gegroeid.
In de hersenen, endocytische mensenhandel van receptoren, ionkanalen en neurotransmitter transporters heeft een primaire rol bij het vaststellen van synaptische plasticiteit 8-11 en de reactie op drugs 12-15, uiteindelijk invloed neuronale prikkelbaarheid en synaptische reacties. Tot dusver heeft de meerderheid van de neuronale mensenhandel studies beroepen op heterologe expressie systemen of gekweekte primaire neuronen, die geen van beide kan een getrouw beeld geven mechanismen een rol spelen bij volwassen neuronen. Hier melden wij een aanpak die oppervlak biotinylatie gebruikt om oppervlakte-eiwit niveaus in acute hersenenplakken afgeleid van volwassen knaagdieren kwantitatief te meten. Met deze aanpak, presenteren we data die aantonen dat de muis striatale dopamine transporter snel internaliseert in rereactie op forbol-ester gemedieerde proteïne kinase C (PKC) activatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke behandeling en weefsel oogst werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Universiteit van Massachusetts Medical School Institutional Animal Care gebruik Comite (IACUC), naar aanleiding van de goedgekeurde protocol # A1506 (Melikian, PI).
Vereiste oplossingen
Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) - Make dagverse
125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2PO 4, 1,2 mM MgCl2, 2,4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO 3, en 11 mM glucose
Opmerking: Bereid ACSF als een 10x voorraad oplossing, met uitzondering van NaHCO3 en glucose. Maak 1x werkende oplossingen dagelijks van de 10x voorraad, aan te vullen met verse NaHCO3 en glucose.
Sucrose aangevuld ACSF (SACSF) - Make dagverse
250 mM sucroos, 2,5 mM KCI, 1,2 mM NaH 2PO 4, 1,2 mM MgCl2, 2,4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO 3, en 11 mM glucose
Opmerking: Bereid SACSF als een 10x voorraad oplossing, met uitzondering van NaHCO3 en glucose. Maak 1x werkende oplossingen dagelijks van de 10x voorraad, aan te vullen met verse NaHCO3 en glucose.
Sulfo-N-hydroxysuccinyl-SS-biotine (sulfo-NHS-SS-biotine, Pierce Chemical Company)
De oplossingen moeten 200 mg / ml in DMSO en zijn bestand tegen meerdere vries / dooi cycli. Monsters opgeslagen bij -20 ° C. De succinyl ester snel gehydrolyseerd in een waterige oplossing, zodat werkende oplossingen moeten onmiddellijk worden voorbereid voorafgaand aan de toepassing te plakken.
Slice Quench Solution
ACSF aangevuld met 100 mM glycine
RIPA Lysis Buffer
10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 1% Triton-X-100, 0,1% SDS, 1% Na deoxycholaat
RIPA met proteaseremmers (RIPA / PI) - Make dagverse
RIPA aangevuld met 1 uM leupeptine, 1 uM pepstatine, 1 uM aprotinine en 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride.
1. Bereid Brain Slices
- Maak verse 1x SACSF en 1x ACSF
- Chill SACSF op ijs in een kleine beker. Dit wordt gebruikt om de vers geoogste muizenhersenen houden.
- Verzadigen de ACSF en SACSF met zuurstof door borrelen met 95% / 5% O 2 / CO 2, 20 minuten op ijs.
- P30-38 muizen worden gebruikt voor optimale levensvatbaarheid van weefsel. Sacrifice dieren door cervicale dislocatie en onthoofding, en snel hersenen te verwijderen in prechilled, zuurstofrijk SACSF.
- Met behulp van een trillende microtoom, maken 300 micrometer hersenen secties in regio van belang.
- Desgewenst kan plakken verder ontleed voorafgaand aan terugwinning te verrijken voor bepaalde hersengebieden of afzonderlijke rechter en linker hemisferen respectievelijk gebruikt als controle en experimentele segmenten,.
- Met behulp van een brand-gepolijste Pasteur pipet plakjes kamers set in 24-well platen bodem mesh.
- Laat plakjes om te herstellen voor 40 min, 31 ° C in zuurstofrijk ACSF, met voortdurende, zachte borrelen.
2. Drug Treatment (indien van toepassing) en Slice Biotinylatie
- Na herstel, wassen segmenten 3x in voorverwarmde (37 ° C), geoxygeneerde ACSF borrelen constant met 95% / 5% O 2 / CO 2.
- Voeg testverbindingen en incubeer met continue zuurstoftoevoer.
- Voor het gemak, voeg een 1/10 ste volume van 10x geconcentreerde drug, en meng door voorzichtig omkeren.
- Schud platen voorzichtig in een waterbad op de gewenste temperatuur.
- Na behandeling met geneesmiddelen, snelchill plakjes door het wassen 3x in ijskoud ACSF.
3. Biotinyleren oppervlakte-eiwitten
- Bereid 1,0 mg / ml sulfo-NHS-SS-biotine ijskoude ACSF onmiddellijk voor etikettering.
- Voeg 0,75 ml sulfo-NHS-SS-biotine te plakken en incubeer plakjes op ijs, 45 min.
- Was de plakjes drie keer snel met ijskoude ACSF, vervolgens incubeer gedurende 10 minuten in ijskoud ACSF op ijs.
- Was de plakjes drie keer met ijskoude slice afschrik buffer en incubeer met 0,75 ml slice afschrik buffer twee keer, 25 min, op ijs om gratis sulfo-NHS-SS-biotine lessen.
4. Bereid weefsellysaten
- Was de plakjes drie keer in ijskoud ACSF en breng elke plak een microcentrifugebuis met behulp van een brand gepolijste Pasteur pipet.
- Zachtjes pellet slice door centrifugeren 200 xg, 1 min en zorgvuldig aspireren resterende ACSF.
- Voeg 400 ul ijskoude RIPA / PI en breken weefsel door en neer te pipetteren eenmaal door een P200 pipette.
- Transfer gedissocieerd slice / RIPA naar een nieuwe buis en incubeer 30 min, 4 ° C, roteren, om lysis te voltooien.
- Pellet celresten door centrifugeren, 18.000 x g, 15 min, 4 ° C.
- Bepaal lysaat eiwit gebruikmaking van de BCA eiwit assay, met runderserumalbumine (BSA) als standaard.
5. Isoleer Gebiotinyleerd Eiwitten
- Optimaliseer Bead / totaal eiwitverhouding.
Opmerking: Individuele eiwitexpressieniveaus kan sterk variëren tussen verschillende hersengebieden. Tenzij alle gebiotinyleerde eiwit in een gegeven hoeveelheid weefsel lysaat wordt vastgelegd, is het niet mogelijk om eventuele veranderingen in de oppervlakte-expressie nauwkeurig te detecteren. Daarom is het noodzakelijk om empirisch bepalen van de optimale kraal / totaal eiwit verhouding voor een bepaald eiwit / hersengebied voor inschepen op een nieuw segment biotinylering studie.- Incubeer 25 ul streptavidine agarosekorrels met toenemende hoeveelheids van weefsel lysaat (naar schatting bereik 25-200 ug), en ga dan verder zoals hieronder beschreven voor het binden, was-en elutie.
- Kwantificeren van de resulterende immuunreactieve bands en kiezen voor een kraal / lysaat verhouding in het lineaire bereik van de binding die nauwkeurige kwantificering van verhoogd of verlaagd eiwit oppervlakte-expressie mogelijk wordt.
- Bereid Streptavidine-agarose kralen
- Bepaal totale kraal volume nodig voor alle monsters. Bereid een voldoende kraal volume voor dat bedrag plus een extra (dwz 4 monsters bij 25 ul / monster = 100 pl kralen + een extra = 125 pi kralen.
- Vortex Streptavidine kraal voorraad en pipet uit gewenste volume. Bij gebruik van een P200 pipet, knipte het eind van de tip om verstopping of kraal schade te voorkomen.
- Was kralen 3 keer in 0,5-1,0 ml RIPA / PI conserveringsmiddelen, vortexen na elke toevoeging RIPA en verzamelen kralen tussen wasbeurten verwijderen door centrifugeren 18.000 xg, 1 min bij kamertemperatuur.
- Aspireren off buffer tussen de wasbeurten met een glazen Pasteur pipet bevestigd aan een thermoskan. Een plastic P200 uiteinde bevestigd aan het uiteinde van de glazen Pasteur pipet levert fijnere controle bij aspireren. Het is niet noodzakelijk geheel verwijderen van alle buffer van de eerste twee wassen, aangezien het risico aanzuigen kralen in de pipet. Na de laatste wasbeurt, verwijder zoveel overtollige buffer mogelijk zonder opzuigen van de kralen.
- Voeg RIPA / PI kralen terug naar hun oorspronkelijke volume te brengen, en neer te pipetteren tot resuspendeer. Vermijd vortexen op dit punt, zoals kralen zal vasthouden aan de buiswand.
- Aliquot kralen in microcentrifugebuizen met een P200 met de punt afgesneden. Pipet op en neer meerdere malen tussen de monsterneming te verzekeren kralen blijven gelijkmatig geschorst en verdeeld onder de buizen.
- Bind gebiotinyleerde eiwitten aan kralen streptavidine
- Verdeel cellysaten de buizen die de agarose korrels. Voor experimenten whe re meerdere monsters worden vergeleken, zorg ervoor dat dezelfde hoeveelheid eiwit te gebruiken voor elk monster voor nauwkeurige vergelijkingen.
- Voeg extra RIPA / PI monsters een 200 ul minimaal volume te brengen. Dit zorgt ervoor dat de monsters voldoende tijdens de incubatie zal mengen en ook verenigt het eiwit concentraties over monsters.
- Plaats buisjes in een rol rotator en meng gedurende de nacht bij 4 ° C.
- In afzonderlijke buizen, afzien van een equivalent van het totale lysaat volume gebruikt voor elk monster. Alternatief, als de monstervolumes hoog, een fractie van het totale lysaat volume kan plaats gereserveerd om maximale laadvolume op SDS-PAGE gels tegemoet. Deze zullen worden gebruikt om de oppervlakte-expressie normaliseren de totale hoeveelheid eiwit.
- Voeg hetzij een gelijk volume van 2x of 1/5 volume 6x SDS-PAGE monsterbuffer en hetzij incuberen bij 4 ° C, parallel met kraal monsters of bewaar bij -20 ° C totdat de monsters geanalyseerd.
- Pellet parels door centrifugeren 18.000 xg, 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig supernatant en wassen kralen drie keer met 0,75 ml RIPA. Om kraal verlies te minimaliseren, laat een klein hoofd volume buffer boven kralen tussen de wasbeurten. Na de laatste wasbeurt, verwijder zoveel RIPA mogelijk, zonder verstoring van de kraal pellet.
- Elueer gebiotinyleerde eiwitten uit streptavidineparels doordat de disulfidebinding. Voeg 25 ul 2x SDS-PAGE reducerende sample buffer, vortex goed en draai monsters 30 min, kamertemperatuur.
Opmerking: Veel membraaneiwitten hebben een sterke neiging te aggregeren wanneer gekookt in SDS-PAGE sample buffer, ernstig afbreuk hun elektroforetische mobiliteit. Als dit het geval is voor het eiwit wordt onderzocht, voorkomen verwarming van de monsters en in plaats daarvan elueren langzaam bij kamertemperatuur. Als koken is absoluut noodzakelijk (bijvoorbeeld als een ander eiwit onderzocht in parallel vereist koken), sample buffer kan worden aangevuld met 2 M ureum (eindconcentratie) om aggregatie te minimaliseren. Hoewel effectief in het verminderen van aggregatie in sommige gevallen ureum compromissen vaak band optredens. - Analyseer de monsters door immunoblot.
- Ontdooi totale lysaat monsters en draaien parallel met kraal monsters, 30 min, kamertemperatuur.
- Afzonderlijke eiwitten op SDS-PAGE gels.
- Identificeer eiwit (s) van belang door immunoblotting.
- Wees er zeker van dat bands worden gedetecteerd in het lineaire bereik van detectie voor kwantificering.
- Om te verzekeren dat de biotinylatiereagens geen toegang tot intracellulaire eiwitten verkregen via beschadigde / gecompromitteerd cellen. Dit wordt het beste bereikt door immunoblotting parallel voor een intracellulair eiwit specifiek voor het celtype onderzocht.
- Kwantificeren band dichtheden en bereken de relatieve eiwitoppervlak dichtheid als een procent van de totale hoeveelheid eiwit expressie niveau.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De neuronale dopamine transporter is geïnternaliseerd in reactie op PKC activering in cellijnen 16-20. Ondanks vele rapporten waaruit blijkt dat PKC-geïnduceerde DAT oppervlak verliezen in een verscheidenheid van cellijnen en expressie-systemen, is het een uitdaging om deze bevinding in gekweekte dopaminerge neuronen 21-23 bevestigen. We gebruikten muis striatale plakjes direct testen of DAT internaliseert in reactie op PKC activering bij volwassen dopaminerge neuronen. Na slice voorbereiding, werd...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Ondanks jarenlange kennis die endocytische mensenhandel kritisch gevolgen synaptische signalering in de hersenen, het is een uitdaging om kwantitatief veranderingen in eiwitoppervlak expressie in volwassen neuronen meten bewezen. In dit werk, melden wij een betrouwbare benadering van oppervlakte-eiwit ex vivo labelen in acute hersenen plakjes. Hersenen slice preparaten hebben een jarenlange geschiedenis van nut voor elektrofysiologische opnames, omdat ze onderhouden synaptische verbindingen en mobiele levensvat...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen financiële belangen die strijdig zijn met dit werk.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidies DA15169 en DA035224 om HEM
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Millicell mesh-bottomed inserts (8 µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | Deze kunnen met de hand worden gewassen en hergebruikt |
Referenties
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
- Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
- Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).
- Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
- Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
- Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
- Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
- Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
- Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
- Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
- Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
- Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
- Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
- Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
- Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
