Vouwen en Karakterisatie van een Bio-responsieve Robot van DNA Origami

Samenvatting

DNA origami is een krachtige methode voor het fabriceren van nauwkeurige objecten op nanoschaal door het zelfsamenstellen van DNA-moleculen te programmeren. Hier beschrijven we een protocol voor het vouwen van een bio-responsieve robot uit DNA origami, de zuivering en negatieve kleuring voor transmissie-elektronenmicroscopische beeldvorming (TEM).

Samenvatting

Het DNA nanorobot een holle zeshoekige nanometrische inrichting, ontworpen om in reactie op specifieke stimuli en presenteren lading binnen afgezonderd. Zowel stimuli en lading kan worden afgestemd op specifieke behoeften. Hier beschrijven we de DNA nanorobot fabricage protocol, met behulp van de DNA origami techniek. De procedure initieert door het mengen van korte enkelstrengs DNA-nietjes in een voorraad mengsel dat vervolgens naar een lange, cirkelvormige, enkelstrengs DNA scaffold wordt toegevoegd in aanwezigheid van een opvouwbare buffer. Een standaard thermo cycler geprogrammeerd om het mengen reactietemperatuur geleidelijk te verlagen om de krammen te scaffold gloeien, de drijvende kracht achter het vouwen van de nanorobot vergemakkelijken. Nadat het 60 uur vouwreactie is voltooid, wordt overmaat nietjes verwijderd met behulp van een centrifugaal filter, gevolgd door visualisatie via agarose-gelelektroforese (AGE). Tenslotte wordt een succesvolle vervaardiging van de nanorobot geverifieerd door transmissie- elektronenmicroscopie (TEM),het gebruik van uranyl-formiaat als negatief vlek.

Inleiding

De toepassingen voor nucleïnezuren nanotechnologie zijn verbazingwekkend. De volgzaamheid van de Watson-Crick baseparing en het gemak en de relatief lage kosten van grootschalige synthese van op maat gemaakte oligo ² een explosie toepassingen ³ en onderzoek op het gebied van DNA nanotechnologie gegenereerd. Structurele DNA nanotechnologie, gebaseerd op de immobiele Seeman knooppunt ^4,5 als hoeksteen maakt gebruik van DNA als een zelfassemblerende elementaire eenheid voor de constructie van willekeurige vormen ^6-8.

De recente ontwikkeling van de steigers DNA Origami ^9-techniek maakt de constructie van complexe 2D / 3D nano-architecturen ^10-12 met sub-nanometer precisie en een efficiënte route voor het bouwen van nieuwe functionele objecten met toenemende complexiteit en verbazingwekkende diversiteit. De constructie is gebaseerd op een lange scaffold enkelstrengs DNA, gewoonlijk afgeleid van een viraal genoome, die kunnen worden gevouwen door de hybridisatie van honderden korte enkelstrengs DNA-oligo genoemd nietjes. De hoge structurele resolutie verkregen met deze techniek is het directe gevolg van de natuurlijke omvang van de DNA dubbele helix, terwijl de reproduceerbaarheid van fabricage is het resultaat van afstemming van de korte enkelstrengs sequenties nietje de maximum waterstofbinding complementariteit haalbaar vergemakkelijken. Met het gebruik van een langzame temperatuur annealing de helling gemaakt laagste energie thermodynamisch voorkeur nanostructuur in hoge opbrengsten en betrouwbaarheid wordt bereikt. De eenvoudige implementatie van ontwerpregels knooppunt in een computercode kon de ontwikkeling van CAD-hulpmiddelen, zoals caDNAno ^13, dat zeer de taak van het ontwerpen van grote, complexe structuren met honderden verbonden knooppunten vereenvoudigen.

Eerder beschreven we het ontwerp van een DNA nanorobot met behulp van het gereedschap caDNAno ^14,15. Hier tonen we de fabricage envisualisatie via transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) van de nanorobot een 3D holle zeshoekige nanodevice, met afmetingen van 35 x 35 x 50 nm ^3, die een belangrijke conformationele verandering in reactie ondergaan een voorafbepaalde stimuli en dit specifieke lading, zoals eiwitten of nucleïnezuur oligo, afgezonderd binnen. Terwijl 12 laadstations zijn beschikbaar in de holle chassis, het werkelijke aantal gebonden lading verschilt met lading grootte. Lading moleculen variëren van kleine DNA-moleculen enzymen, antilichamen en 5-10 nm goud nanodeeltjes. Cargocan ofwel uniform of heterogeen, zodat elke nanorobot bevat een mengsel van verschillende moleculen. Sensing wordt bereikt via twee dubbele helix vergrendeling poorten ontwerp tot eiwitten, nucleïnezuren of andere chemische stoffen te voelen, hetzij op basis van aptasensor ^16,17 of DNA-streng verplaatsing ¹⁸ technologieën. Recente ontwikkelingen in aptameer selectie protocollen ^19-21 staat het ontwerp van nanorobots reagereneen steeds groeiend aantal moleculen en celtypen.

Eerder werk toonde een nanorobot met een specifiek antilichaam, die bij kan binden aan het antigeen ervan relais ofwel een remmend of een vruchtbare signaal naar de binnenkant van specifieke celtypen in een gemengde celpopulatie ^15. Een interessante eigenschap van deze nanodevices is hun vermogen om nog meer complexe taken en logische regeling uitvoeren met de introductie van verschillende nanorobot subtypes in één populatie. Onlangs toonden we specifieke subtypen van nanorobots uitvoeren als positief of negatief regelen, besturen van een effector populatie die een actief molecuul cargo ^22.

De hier gepresenteerde protocol beschrijft de vervaardiging, zuivering en beeldvorming van een nanorobot omheind met sensor aptameer sequenties die selectief PDGF binden aan de opening van de nanorobot ^15,22 vergemakkelijken. Het fabricageproces beschreven is vergelijkbaar met de nanorobot fabricageproces aanvankelijk afgebeeld door Douglas et al. ¹⁵ met de veranderingen die gericht zijn op vermindering van de totale duur proces, terwijl het verhogen van de opbrengst en zuivering tarieven.

Protocol

1. Voorbereiding van Staples Pool Mixture

1. Order gevriesdroogd DNA nanorobot nieten 96 putjes zoals vermeld in Tabel 1 (zie Materialen) en normaliseren tot 10 nmol. Voor een uitvoerige beschrijving van het ontwerp en de architectuur van het DNA nanorobot Zie Ben-Ishay et al. ¹⁴ en Douglas et al. ^15).
2. Reconstitueer iedere kram goed met DNase / RNase-free ultrazuiver tot een concentratie van 100 uM. Voor nietjes genormaliseerd tot 10 nmol, reconstitueren met 100 ul van ultrapuur water.
3. Zwembad samen 20 pi van elke nietje met behulp van een multichannel pipet en een steriele 55 ml oplossing bekken.
   Opmerking: Aangezien de nanorobot vorm bestaat uit 254 stapelvezels strengen (inclusief Core, randen, handvatten en Guides sequenties tabel 1), de concentratie van elk van de nietjes in het nietjes zwembad 394 nM. Het verwijderen van nietjes uit het nietje zwembad, of het toevoegen van een aantal op verschillende vollumes, kan de opbrengst aanzienlijk verminderen of anderszins gevolg ongevouwen aggregaten.

2. Voorbereiding van Fabrication Reaction Mixture

1. Voor een standaard reactiemengsel gebruiken 40 ul van M13mp18 virale genoom circulair enkelstrengs DNA, wat overeenkomt met 4 pmol steiger DNA (100 nM voorraad oplossing, zie Materials). De eindconcentratie van scaffold in de fabricage mengsel 20 nM, eindvolume 200 pl.
   1. Pas de hoeveelheid steiger DNA volgens specifieke behoeften; echter, houdt de eindconcentratie van scaffold DNA in het reactiemengsel bij een constante 20 nM.
2. Nietjes toe te voegen aan een steiger om nietjes verhouding van 1 te bereiken tot 10, respectievelijk. Voor een 20 nM steiger DNA-concentratie, elk van de uiteindelijke concentratie 254 nietjes 'is 200 nm. Voor een 200 ul laatste reactie volume toe te voegen 102 ul van de nietjes zwembad mengsel (paragraaf 1.2).
   1. Voeg specifieke Gate sequenties apart the vouwen reactiemengsel op dit moment. Deze oligo's worden apart besteld en vereisen HPLC zuivering. Zorg ervoor dat Gate oligo's aanwezig zijn in een 01:10 steiger aan Gate volgorde verhouding zijn, dat wil zeggen 200 nm van elke oligo voor een 20 nM steiger concentratie. Voor een 200 ul reactievolume vouwen, voeg 0,4 ul van elk van de vier Gate oligo in een 100 pM voorraad concentratie.
3. Voeg 10 x TAE stock buffer tot een eindconcentratie van 1 x TAE (40 mM Tris-acetaat, 1 mM EDTA) te bereiken. Voor een 200 ul reactievolume vouwen, voeg 20 ul van 10x TAE.
4. Voeg 1 M _MgCl2 tot een eindconcentratie van 10 mM. Voor een 200 ul reactievolume vouwen, voeg 2 pl 1 M _MgCl2.
5. Voeg 36 ul DNase / RNase vrij ultrapuur water om een ​​eindvolume van 200 pl te bereiken.
6. Vortex en monster 100 ul monsters in PCR flesjes.
   Opmerking: Raadpleeg thermocycler specificatie met betrekking tot de maximale reactie volumes worden gebruikt.Vermindering van het volume aan deze limieten voldoen zal de verkregen opbrengst verminderen. Reactie volumes boven de maximale opgegeven zal de opbrengsten in gevaar brengen.

3. Temperatuur Annealing Ramp van Fabrication Reaction

1. Programma thermische cycler als volgt:
   1. Helling 85 ° C tot 60 ° C met een snelheid van 5 min / ° C.
   2. Helling 60 ° C tot 4 ° C bij een snelheid van 75 min / ° C.
   3. Houd bij 4 ° C voor onbepaalde tijd.
2. Na fabricage is opslag samples beëindigd bij -20 ° C.

4. Verwijdering van Excess Staples

1. Voeg 100 ul van vouwen reactiemengsel tot een 0,5 ml centrifugaal filter met een MWCO van 100 kDa. Sla een 10 ui monster van nanorobots voorzuivering voor latere analyse.
2. Centrifugeer 10 minuten bij 9600 x g.
3. Voeg 400 gl vouwingsbuffer (1 x TAE, 10 mM _MgCl2).
4. Herhaal de stappen 4,2 en 4,3 keer meer.
5. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 9600 x g.
6. Herstel het concentraat door het plaatsen van de filter ondersteboven in een schone microcentrifugebuis en centrifugeren gedurende 1 min bij 9.600 x g. Final volumes kunnen variëren afhankelijk van het oorspronkelijke volume fabricage reactiemengsel dat in de filter werd gezet. Typisch een 25-60 ul eindvolume van geconcentreerde nanorobot monster wordt verkregen.
7. Meet concentratie van DNA in de monsters via spectrofotometer bij 260 nm. Gebruik moleculair gewicht van 5,3 ug / pmol bij de berekening van molaire concentraties van nanorobot monsters.
   Opmerking: De molaire extinctiecoëfficiënt van dsDNA, 50 ug / OD _{260 is} voldoende voor de meeste toepassingen. 48 ug / OD ₂₆₀ houdt rekening met de poly thymine ssDNA strekt de randen nietjes.

5. Agarosegelelektroforese Analyse van gevouwen Nanorobots

1. Bereiding van 0,5 x TBE (45 mM Tris-boraat, 1 mM EDTA), 2% agarosegel gesupplementeerd met 10 mM _MgCl2 (aangepast van Ernesto Castro et ^{al. 21):}
   1. Bereid 0,5x TBE buffer door verdunning van 6,25 ml van 10x TBE voorraad buffer in 118,75 ml van _DDH 2 O.
   2. Oplossen in 125 ml 0,5X TBE buffer 2,5 g agarose.
   3. Kook in de magnetron tot de agarose volledig is opgelost.
   4. Voeg 1,25 ml van 1 M MgCl ₂ tot eindconcentratie van 10 mM.
   5. Voeg 7 pl van 10 mg / ml ethidiumbromide.
   6. Wachten voor oplossing enigszins afkoelen en vul de gel lade voordat de agarosegel stolt. Installeer de gewenste kam onmiddellijk.
   7. Bereid 1 L 0,5x TBE loopbuffer door toevoeging van 50 ml 10 x TBE-buffer voorraad en 10 ml 1 M MgCl ₂ om 940 ml van DDH ₂ O.
   8. Zodra gel vast add loopbuffer om de elektroforese-inrichting en zet inrichting in een ijsbad.
2. Belasting 1 ug totaal DNA van de nanorobots voorzuivering (stap 3.2), en na zuivering (stap 4.7), naast een steigerDNA-monster en een 1 kb DNA-merker, op de gel. Een voorbeeld wordt gegeven in figuur 2. Werkelijke hoeveelheden monsters afhankelijk van de concentratie verkregen na zuivering. Elk monsters geladen met laadbuffer in een 1: 6 eindvolume ratio.
3. Stel stroombron tot 80 V en draaien gel voor 3 uur. Voer de gel in een bad gevuld met ijs en water. Nanorobots zal ontvouwen en verschijnen als een uitstrijkje als de agarosegel wordt tijdens elektroforese. Tijdens elektroforese voeg extra ijs om het apparaat te houden van verwarming.
4. Bekijk gel op een UV tafel (Figuur 2).

6. Negative Stain van Nanorobot met Uranyl-formaat

1. Bereiding van 2% uranyl-formiaat stockoplossing (naar Castro et ^{al. 23):}
   1. Weeg 100 mg van uranyl-formaat poeder in een 15 ml buis.
   2. Kook DNase / RNase gratis ultrapuur water gedurende 3 minuten om de-oxygenaat-.
   3. Voeg 5 ml gedeoxygeneerd heet water (~ 60 ° C)in de 15 ml buis met het uranyl-formiaat poeder (uit de vorige stap). Goed sluit het deksel, wikkel in aluminiumfolie en vortex grondig gedurende 10 min (Fasten buis naar een vortex). Oplossing moet troebel met een gele kleur verschijnen.
   4. Filter oplossing door een 0,2 um spuit fi lter. Oplossing moet helder worden.
   5. Aliquot 200 ul van de oplossing in microcentrifugebuizen.
   6. Centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 5 minuten in een tafelmodel centrifuge pool monsters op de bodem van de buis.
2. Laden van het monster op raster en negatieve kleuring:
   1. Ontdooi een 200 pi hoeveelheid van 2% uranyl-formiaat oplossing (bereid in paragraaf 6.1). Voeg 10 ul van 0,5 M NaOH-oplossing en grondig vortex gedurende 3 min. Centrifuge bij maximale snelheid gedurende 5 minuten met behulp van een tafelblad centrifuge.
   2. Ondertussen, glow-ontlading raster met kamer lucht bij 0,2 mbar en 25 mA voor 30 sec.
   3. Voeg 15 ul van 2 nM nanorobot monster na zuivering (sectiop 4,7) op de bovenzijde van het rooster (gehouden met een pincet) en laat absorberen 1 min. Gebruik fi filter papier om het overtollige vocht weglopen door het plaatsen van het rooster boven op het filterpapier. Raak het oppervlak rooster niet aan.
   4. Voeg 10 ul van de 2% uranyl-formaat (van stap 6.2.1) op de bovenzijde van het rooster (gehouden met een pincet).
   5. Gebruik Snel fi filter papier om het overtollige vocht weglopen door het plaatsen van het rooster boven op het filterpapier. Raak het oppervlak rooster niet aan.
   6. Herhaal de stappen 6.2.4 en 6.2.5.
   7. Voeg 10 ul van de 2% uranyl-formaat (van stap 6.2.1) op de bovenzijde van het rooster (gehouden met een pincet). Laat kleurstofoplossing inwerken 30 sec.
   8. Gebruik fi filter papier om het overtollige vocht weglopen door het plaatsen van het rooster boven op het filterpapier. Raak het oppervlak rooster niet aan.
   9. Laat het rooster drogen gedurende ten minste 30 min, open op een filterpapier, vóór het injecteren in de TEM.

Resultaten

Representatieve resultaten worden getoond in figuur 2A. Alle lanen bevatten 1 ug totaal DNA, gemeten via de spectrofotometer (OD _260). Vergeleken met cirkelvormige enkelstrengs DNA scaffold (Baan 2), zijn nanorobots gehinderd in de gel als gevolg van hun hogere molecuulgewicht gevolg nietjes hybridisatie met het DNA scaffold (Lane 3. Rode pijl). Het laagmoleculaire band in Lane 3 vertegenwoordigt overtollige nietjes die niet binden aan de steiger DNA (groene pijl). Na zuivering via centrifuga...

Discussie

We beschreven de vervaardiging, zuivering en visualisatie van de DNA nanorobot. Na vervaardiging van de hexagonale chassis van de inrichting, is de functie van de nanorobot geprogrammeerd met de eenvoudige introductie van specifieke vracht en waarneming strengen de robot die gemakkelijk hun aangewezen positie ondervinden van de waterstofbinding complementariteit met beschikbare enkelstrengs docking plaatsen ^{14 , 15,22.}

De fabricage beschreven protocol gebruikt een langzame anneali...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DNase/RNase vrij gedistilleerd water	Gibco	10977
M13mp18 ssDNA sjabloon	NEB	N4040S
10x TAE	Gibco	15558-042
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G
Amicon Ultra 0,5 ml centrifugale filter 100K MWCO	Amicon	UFC510024
Agarose	Promega	V3125
TBE buffer	Promega	V4251
Ethidiumbromide 10 mg/ml oplossing	Sigma Aldrich	E1510
1 kb DNA marker	NEB	N3232S
Loading Dye	NEB	B7021S
uranylformiaat	polysciences	24762
koolstofgecoate TEM rasters	Science services	EFCF400-Cu-50
Thermal Cycler c1000 Touch	Bio-Rad
Glow Discharge K100X	Emitech
UV tafel Gel Doc EZ Imager	Bio-Rad
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific
TEM FEI-G12	Tecnai