DNA origami is een krachtige methode voor het fabriceren van nauwkeurige objecten op nanoschaal door het zelfsamenstellen van DNA-moleculen te programmeren. Hier beschrijven we een protocol voor het vouwen van een bio-responsieve robot uit DNA origami, de zuivering en negatieve kleuring voor transmissie-elektronenmicroscopische beeldvorming (TEM).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Vouwen en Karakterisatie van een Bio-responsieve Robot van DNA Origami
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het DNA nanorobot een holle zeshoekige nanometrische inrichting, ontworpen om in reactie op specifieke stimuli en presenteren lading binnen afgezonderd. Zowel stimuli en lading kan worden afgestemd op specifieke behoeften. Hier beschrijven we de DNA nanorobot fabricage protocol, met behulp van de DNA origami techniek. De procedure initieert door het mengen van korte enkelstrengs DNA-nietjes in een voorraad mengsel dat vervolgens naar een lange, cirkelvormige, enkelstrengs DNA scaffold wordt toegevoegd in aanwezigheid van een opvouwbare buffer. Een standaard thermo cycler geprogrammeerd om het mengen reactietemperatuur geleidelijk te verlagen om de krammen te scaffold gloeien, de drijvende kracht achter het vouwen van de nanorobot vergemakkelijken. Nadat het 60 uur vouwreactie is voltooid, wordt overmaat nietjes verwijderd met behulp van een centrifugaal filter, gevolgd door visualisatie via agarose-gelelektroforese (AGE). Tenslotte wordt een succesvolle vervaardiging van de nanorobot geverifieerd door transmissie- elektronenmicroscopie (TEM),het gebruik van uranyl-formiaat als negatief vlek.
Inleiding
De toepassingen voor nucleïnezuren nanotechnologie zijn verbazingwekkend. De volgzaamheid van de Watson-Crick baseparing en het gemak en de relatief lage kosten van grootschalige synthese van op maat gemaakte oligo 2 een explosie toepassingen 3 en onderzoek op het gebied van DNA nanotechnologie gegenereerd. Structurele DNA nanotechnologie, gebaseerd op de immobiele Seeman knooppunt 4,5 als hoeksteen maakt gebruik van DNA als een zelfassemblerende elementaire eenheid voor de constructie van willekeurige vormen 6-8.
De recente ontwikkeling van de steigers DNA Origami 9-techniek maakt de....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van Staples Pool Mixture
- Order gevriesdroogd DNA nanorobot nieten 96 putjes zoals vermeld in Tabel 1 (zie Materialen) en normaliseren tot 10 nmol. Voor een uitvoerige beschrijving van het ontwerp en de architectuur van het DNA nanorobot Zie Ben-Ishay et al. 14 en Douglas et al. 15).
- Reconstitueer iedere kram goed met DNase / RNase-free ultrazuiver tot een concentratie van 100 uM. Voor nietjes genormaliseerd tot 10 nmol, reconstitueren met 100 ul van ultrapuur water.
- Zwembad samen 20 pi van elke nietje met behulp van een multichannel pipet en een steriele 55 ml opl....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Representatieve resultaten worden getoond in figuur 2A. Alle lanen bevatten 1 ug totaal DNA, gemeten via de spectrofotometer (OD 260). Vergeleken met cirkelvormige enkelstrengs DNA scaffold (Baan 2), zijn nanorobots gehinderd in de gel als gevolg van hun hogere molecuulgewicht gevolg nietjes hybridisatie met het DNA scaffold (Lane 3. Rode pijl). Het laagmoleculaire band in Lane 3 vertegenwoordigt overtollige nietjes die niet binden aan de steiger DNA (groene pijl). Na zuivering via centrifuga.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We beschreven de vervaardiging, zuivering en visualisatie van de DNA nanorobot. Na vervaardiging van de hexagonale chassis van de inrichting, is de functie van de nanorobot geprogrammeerd met de eenvoudige introductie van specifieke vracht en waarneming strengen de robot die gemakkelijk hun aangewezen positie ondervinden van de waterstofbinding complementariteit met beschikbare enkelstrengs docking plaatsen 14 , 15,22.
De fabricage beschreven protocol gebruikt een langzame anneali.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen S. Douglas bedanken voor zeer waardevolle discussies en advies, en alle leden van de Bachelet lab voor nuttige discussies en werk. Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de faculteit Life Sciences en het Instituut voor Nanotechnologie & Advanced Materials aan de Bar-Ilan Universiteit.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DNase/RNase vrij gedistilleerd water | Gibco | 10977 | |
| M13mp18 ssDNA sjabloon | NEB | N4040S | |
| 10x TAE | Gibco | 15558-042 | |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
| Amicon Ultra 0,5 ml centrifugale filter 100K MWCO | Amicon | UFC510024 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| TBE buffer | Promega | V4251 | |
| Ethidiumbromide 10 mg/ml oplossing | Sigma Aldrich | E1510 | |
| 1 kb DNA marker | NEB | N3232S | |
| Loading Dye | NEB | B7021S | |
| uranylformiaat | polysciences | 24762 | |
| koolstofgecoate TEM rasters | Science services | EFCF400-Cu-50 | |
| Thermal Cycler c1000 Touch | Bio-Rad | ||
| Glow Discharge K100X | Emitech | ||
| UV tafel Gel Doc EZ Imager | Bio-Rad | ||
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | ||
| TEM FEI-G12 | Tecnai |
Referenties
- Watson, J. D., Crick, F. H. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
- Kosuri, S., Church, G. M. Large-Scale de novo. DNA synthesis: technologies and applications. Nature Meth. 11 (5), 499-507 (2014).
- P....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
