Sequentiële In vivo Imaging van Osteogeen Stam / progenitorcellen Tijdens Fracture Repair

Samenvatting

Kwantitatieve meting van botvoorlopercellen functie de genezing van breuken vereist hoge resolutie seriële imaging technologie. Hier zijn protocollen voorzien met intravitale microscopie en osteo-lijn volgen sequentieel beeld en kwantificeren van de migratie, proliferatie en differentiatie van endogene osteogene stam / voorlopercellen in het proces van het herstellen botbreuken.

Samenvatting

Bone draait zich voortdurend en is sterk regeneratieve na letsel. Osteogenic stam / voorlopercellen zijn lang hypothese te bestaan, maar in vivo demonstratie van dergelijke cellen is pas onlangs gerealiseerd. Hier, in vivo beeldvorming technieken om de rol van endogene osteogene stam / progenitorcellen (OSPCs) en hun nageslacht in botherstel onderzoeken zijn aanwezig. Met osteo-cell lineage tracing modellen en intravitale geïnduceerde beeldvorming van haarscheurtjes in calvariale bot kan OSPCs direct worden waargenomen tijdens de eerste paar dagen na verwonding, waarbij kritische gebeurtenissen in de vroege reparatieproces optreden. Letsel sites kunnen achtereenvolgens worden afgebeeld onthullend dat OSPCs verhuizen naar de schade, in aantal toenemen en differentiëren tot botvormende osteoblasten. Deze methoden bieden een middel van het onderzoeken van de rol van stamcel-intrinsieke en extrinsieke moleculaire regulatoren voor de regeneratie van bot en reparatie.

Inleiding

Degeneratieve botziekten en leeftijdsgebonden botverlies leidt tot een hoog risico op osteoporotische fracturen is uitgegroeid tot een belangrijke uitdaging in de volksgezondheid ^1. Botbehoud wordt gecontroleerd door botvormende osteoblasten en-botresorberende osteoclasten. Gebreken van botvormende cellen zijn de voornaamste oorzaak van leeftijdsgebonden botverlies en degeneratieve botziekten ^2,3. Hoewel uitgebreid onderzoek heeft zich gericht op de verbetering van de fractuur genezing, de ontdekking van betrouwbare drugs degeneratieve botziekten te genezen en om de zwakte van osteoporotische fracturen te keren blijft een belangrijke kwestie. Zo, het bestuderen van de bron van botvormende cellen en hun controlemechanismen in botherstel en reparatie voorziet in een nieuwe inzicht om het skelet regeneratie te verbeteren en reverse botverlies ziekten.

Het bestaan ​​van multipotente mesenchymale cellen in beenmerg voorgesteld gebaseerd op de identificatie van Monogene populaties kunnen verschillendeIATE in osteogene, adipogene en chondrogenische geslachten ex vivo ^4. Onlangs, meerdere studies hebben gerapporteerd dat het skelet / mesenchymale stamcellen (SSC's / MSC's) zijn een natuurlijke bron van osteoblasten en zijn cruciaal voor bot-omzet, verbouwing en fractuurherstel ^5,6 . Bovendien, onze-lineage tracing studie bleek dat volwassen osteoblasten hebben een onverwacht korte halfwaardetijd (~ 60 dagen) en worden voortdurend aangevuld door hun stam / voorlopercellen in zowel normale homeostatische en fractuurherstel voorwaarden ^6. Echter, de in vivo identiteit van stamcellen en hoe dergelijke cellen reageren op letsel breken en leveren botvormende cellen zijn onduidelijk. Daarom is het belangrijk een methode kan de migratie, proliferatie en differentiatie van endogene SSC / MSC analyseren onder fysiologische omstandigheden ontwikkelen.

Breukherstel is een multi-cellulaire en dynamisch proces geregeld door een reeks complexecytokinen en groeifactoren ^7. De meest populaire aanpak voor fractuur onderzoeksprogramma is om een diermodel met pijpbeenfracturen gebruiken en botten te analyseren door het bot snijden en immunofluorescentie technieken ^8-10. Deze reparatie kan gevolgd worden door meerdere beeldvormende technieken waaronder micro-CT ^11, nabij infrarood fluorescentie ¹² en chemiluminescentie beeldvorming ^13. Echter, elke techniek heeft bepaalde beperkingen en er geen effectieve manier om SSC / MSC functie op cellulair niveau in vivo volgen geweest. Onlangs heeft confocale / twee-foton intravitale microscopie ontwikkeld en gebruikt om getransplanteerde kankercellen en hematopoietische stamcellen te detecteren in het kader van hun beenmerg micro zelfs bij eencellige resolutie levende dieren ^14. Door de combinatie van deze technologie met een reeks van lineage tracing modellen, waren we in staat om te bepalen dat osteogenic stam / voorlopercellen genetisch kunnen worden gemarkeerd door tijdelijke aczendvermogen van de myxovirus weerstand -1 (Mx1) promotor en-Mx1 geïnduceerde voorlopers kunnen de meeste rijpe osteoblasten te handhaven in de tijd maar niet deelnemen aan de vorming van chondrocyten in de volwassen muis ^6. Daarnaast hebben we aangetoond dat Mx1-gelabelde OSPCs leveren de meerderheid van de nieuwe osteoblasten de genezing van breuken ^6.

Hier, met osteo-lijn volgen modellen intravitale microscopie wordt een protocol voorzien om de in vivo kinetiek van Mx1 ⁺ osteogene stam / progenitorcellen in breukherstel definiëren. Dit protocol biedt sequentiële beeldvorming om de verplaatsing van osteogene stam / progenitorcellen in breukplaatsen en de kwantitatieve meting van osteoprogenitor expansie in het begin reparatieproces volgen. Deze benadering kan nuttig zijn in meerdere contexten zoals de evaluatie van de therapeutische kandidaten om botherstel verbeteren.

Protocol

1. Muizen en Voorconditionering

Opmerking: Alle muizen werden gehandhaafd in-pathogeen-vrije omstandigheden en alle protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan het Massachusetts General Hospital. Alle operatie moet onder steriele toestand worden uitgevoerd met behulp van een autoclaaf steriele apparatuur. Mx1-Cre ^15, Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP), en Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Rosa-tomaat), waren gekocht van Jackson Laboratories. Osteocalcin-GFP muizen werden verschaft door Dr Henry Kronenberg. Voor de kwantitatieve analyse van OSPC migratie en proliferatie in vivo, werden Mx1-Cre ⁺ Rosa-YFP ⁺ (effen-reporter) muizen gebruikt. Voor meer gedetailleerde positie van hun differentiatie in Osteocalcin ⁺ rijpe osteoblasten, gebruikten we trigenic Mx1-Cre ⁺ Rosa-Tomaat ⁺ Ocn-GFP ⁺muizen.

1. Om Mx1 ⁺ cellen label in vivo bereiden polyinosinic-polycytidylic acid (PIPC, 2,5 mg / ml) in steriele PBS-oplossing en injecteer 200 ul 20 g Mx1-Cre ⁺ reporter muis intraperitoneaal eenmaal per dag gedurende 10 dagen.
2. Aan ingezeten Mx1 ⁺ hematopoietische cellen te elimineren, bestralen muizen met een enkele dosis van 9,5 Gy. Na 24 uur van bestraling, transplantatie wild type beenmergcellen (1x10 ⁶ cellen / muis) intraveneus ^16. Let op: Omdat Mx1-induceerbare cellen omvatten hematopoietische cellen en hematopoietische afgeleide osteoclasten, de eliminatie van Mx1 ⁺ hematopoietische cellen verbetert de beeldkwaliteit en de kwantificering van Mx1 ⁺ osteogene cellen.
3. Na beenmergtransplantatie, controleren dieren vier tot zes weken om een ​​succesvolle repopulatie van donor beenmerg cellen bereiken.

2. MoGebruik Voorbereiding

1. Verdoven muizen door intraperitoneale injectie van 50 pl van ketamine / xylazine (100 mg / kg xylazine 12 mg / kg lichaamsgewicht) met een IACUC goedgekeurde procedure. Opmerking: De duur van het effect kan worden verlengd met een extra dosis van ketamine / xylazine.
2. Bepaal of de muis volledig verdoofd door het gebrek aan respons op teen en / of de staart snufjes. (Optioneel) Wanneer de muis wordt verdoofd, veilig een isofluraan gas masker over de neus met tape. Pas het niveau van isofluraan om ervoor te zorgen het dier volledig verdoofd.
3. Clip het hoofdhaar met een elektrische trimmer of een klein schaartje. Verwijder het haar fragmenten en steriliseer de blootgestelde huid met 70% alcohol. Solliciteer traan gel om het hoornvlies uitdroging te voorkomen.

3. Microfracture Injury

1. Na het veiligstellen van het dier volledig verdoofd, maken een omgekeerde L-vormige incisie om de hoofdhuid te openen. Kortom, maak een eerste dwarse incisie (minder dan 1 cm) starting van het ene oor naar het andere oor. Draai ~ 60 ° en blijven incisie in de richting van de neus tot ~ 2-3 mm van de neus. Opmerking: Deze incisie minimaliseert de vorming van littekenweefsel boven het gebied af te beelden.
2. Scheid de huid flappen door te trekken naar de zijkanten met een tang. Zowel voorhoofdsbeenderen en de kruising van sagittale en coronale hechtingen moeten duidelijk worden blootgesteld.
3. Reinig het open oppervlak door te spoelen met steriele PBS en zachte afvegen met een steriel gaasje of wattenstaafjes totdat alle resterende haren worden geëlimineerd.
4. Om microfractures op de calvarium genereren, houd de muisknop hoofd met een hand en een 30 G naald met een andere hand. Maak een micro-punctie (~ 0,2 mm diameter wond met <1 mm diep) op de linker frontale bot nabij de kruising van de sagittale en coronale hechtingen door de tip van een 30 G naald met zachte druk en draaibeweging. Waarschuwing: Het is cruciaal om de naald te voorkomen door te dringen in de hersenen, waardoor bleedi geminimaliseerdng en weefselschade.
5. Schakel over naar een grotere naald (20 of 25 G) en verbreding van de punctie gat door het verdraaien van de naald (~ 0,5 mm diameter).
6. Herhaal stap 3.3-3.5 naar tweede punctie genereren op het contralaterale frontale bot.
7. Veeg uit de gewonde plekken door continue vallen van PBS totdat het bloeden stopt.
   Opmerking: Bloeden op breuk sites zal interfereren met de juiste beeldvorming en veroorzaken littekenvorming.
8. Breng een druppel van steriele fysiologische zoutoplossing of 2% Methocel op de schedel om uitdrogen te voorkomen. Opmerking: Zorg ervoor dat de schedel oppervlak te drogen, die helderheid van het beeld te verminderen. Het is belangrijk dat een voldoende hoeveelheid gel of zoutoplossing om het te bedekken.

4. Intravitale Imaging

1. (Optioneel) voor de beeldvorming, sommige muizen worden geïnjecteerd met een vasculaire kleurstof de bloedvaten te visualiseren. Injecteren retro-orbitaal met 20 ul van ongerichte Qtracker 705 (2 uM oplossing in 50 mM boraatbuffer) verdund in 80 ml PBS. Gebruik een insulinespuit aan reagens afval te minimaliseren. Als het signaal niet voldoende helder, misschien extra bedragen nodig zijn.
2. Zet de scanner. Opmerking: Een polygoon-gebaseerde laser scanner maakt het mogelijk gelijktijdig meerdere kanalen beeldaanwinst bij video-tarief (30 frames per seconde). Video tarief scannen is erg belangrijk voor levende dieren beeldvorming.
3. Zet de multi-foton laser (Femto-tweede titaan: saffier laser). Kies als golflengte 880 nm en pas de power voor de tweede harmonische generatie imaging (440 nm) van het bot. Voor GFP en tdTomato excitatie, zet de 491 nm en 561 nm solid-state lasers.
4. Zet de PMT (fotomultiplicatorbuis) detectoren voor elk signaal (een 435 ± 20 nm band-pass filter voor de tweede harmonische generatie, een 528 ± 19 nm band-pass filter voor GFP, en 590 ± 20 voor tdTomato.) (Optioneel) Gebruik een 638 nm helium-neon laser en een PMT met een 695 ± 27,5 nm band-pass filter om 705 signaal te detecteren Qtracker.
5. Place het dier op een XYZ-as gemotoriseerd microscoop podium. Houd de muis in de meest comfortabele positie met een elektrische verwarming pad te helpen handhaven van de lichaamstemperatuur (dit vermindert het risico van verlies van dieren). Gebruik tape om de muis te houden om beweging te minimaliseren tijdens de beeldvorming en het afgebeelde gebied houden zo horizontaal mogelijk.
6. Breng een druppel van warme 2% methylcellulose gel of fysiologische zoutoplossing op de schedel om uitdrogen te voorkomen. Zet een deksel glas op de beeldvorming gebied. Gebruik een lage vergroting lens (30x water-immersie objectief met 0,9 NA) aan de calvaria scannen.
7. De XYZ-as controller, vindt het oppervlak van schedeldak door het detecteren van de SHG signaal van botten en identificeren een cruciale zichtlocatie, zoals het snijpunt tussen de sagittale en coronale hechtingen hechtingen. Verwerven van een afbeelding en noteer de XYZ coördinaten.
8. Blijven zoeken naar de locatie van de schade door het observeren van SHG en fluorescentie signalen.
9. Bij letsel sites of de regio of belang worden gevonden, krijgen een beeld van de beste focal plane met SHG en fluorescentie signalen van de cellen van belang. Opslaan XYZ coördinaten en de afstand tot de kruising van de sagittale en coronale hechtingen hun precieze locatie vast voor de volgende ronde van beeldvorming.
10. Om 3D-cellulaire en botstructuren van breuk letsel verzamelt, registreert beelden door Z-stacks (2-5 micrometer interval) met ~ 100 micrometer diepte van endostale bot oppervlak. Na de voltooiing van beeldvorming van een zijde van schade herhaal beeldvormingsproces voor volgend letsel sites.

5. Bericht Operatie Procedures

1. Na beeldvorming, afspoelen beeldvorming site met steriele zoutoplossing om de methylcellulose gel uit de schedel te verwijderen. Met behulp van een steriel wattenstaafje, een kleine hoeveelheid van triple antibiotische zalf op het oppervlak. Bedek de huid flappen en opnieuw sluiten van de hoofdhuid door chirurgisch hechten. Dit kan gedaan worden met een hypoallergene hechten draad (absorbeerbare polyglactine sutuur) en 5-0 grootte Hechtnaald. Let op: Goede hechten techniek minimaliseert littekenvorming.
2. Behandel alle dieren met een IP injectie van 0.05-0.1 mg / kg buprenorfine om de 12 uur gedurende 48 uur na de operatie. Houd dieren in een warme herstel kamer totdat ze opnieuw over voldoende bewustzijn. Na 3 tot 5 dagen, de heropening van de hechtdraad en herhaal intravitale beeldvorming stappen om de cellulaire veranderingen tijdens de genezing van breuken te volgen.

Resultaten

De gestabiliseerde pijpbeenfracturen model is populair in fractuur onderzoeksprogramma. Echter, lang bot of grote breuk modellen leiden tot meerdere weefselschade en daarom hebben een beperking in kwantitatieve meting van het bot celfunctie. We ontwikkelden een minimaal invasieve schade (minder dan 1 mm met weinig of geen invasie in de dura mater) op calvariale voorhoofdsbeenderen met naald boren (Figuren 1A-1C). We kozen voor een bovenaanzicht van de calvarial voorhoofdsbeenderen voor in vivo...

Discussie

De regulering van skeletachtige stamcellen kan van groot belang zijn voor het definiëren van betere methoden bot regeneratie. Kwantitatieve en sequentiële beeldvorming op cellulair niveau is technisch uitdagend geweest. Hoewel de muis pijpbeenfracturen model is op grote schaal gebruikt en geschikt voor biomechanische studies ^17, hebben de deep tissue locatie, ongelijke breuk grootte, zacht weefsel schade, en de toepassing van stabiliserende fixators sequentiële intravitale beeldvorming beperkt. Hier wordt een...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
C57BL/6J (H-2b)	Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)	000664
Ketamine Hydrochloride Injectie	Bionichepharma	67457-001-10	Flesgrootte: 10 ml (50 mg/ml)
Xylazine steriele oplossing	Lloyd Inc.	NADA# 139-236
Buprenorfine Hl	BEDFORD LAB	NDC 55390-100-10	Fles: 0,3 mg/ml, Doses: 0,05-0,1 mg/kg
DPBS, 1X	CORNING cellgro	21-031-CV
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol)	Kendall WEBCOL	5110
Fijne chirurgische schaar	F.S.T	14568-09
Extra fijne pincet	F.S.T	11150-10
VICRYL*Plus Sutuur	Ethicon	VCP490G
Qtracker 705 niet-doelgerichte quantum dot	Invitrogen	Q21061
Methocel 2%	OmmiVision
pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid)	Sigma	P0913-50MG	100 μl (2,5 mg/ml in PBS) voor 10 g muis
Mai Tai Instelbare Ultrafast Lasers	Spectra Physics
Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser	Cobolt AB
Radius-635 HeNe laser	Coherent