Het beoordelen van functionele prestaties in de Mdx Muis Model

Summary

De primaire uitkomstmaat in klinische trials voor neuromusculaire aandoeningen is over het algemeen verbeterd spierfunctie. Daarom beoordeling van het effect van mogelijke therapeutische verbindingen op spierprestaties klinisch vooraf in muismodellen van groot belang. We beschrijven hier een aantal functionele tests om dit aan te pakken.

Abstract

Duchenne spierdystrofie (DMD) is een ernstige en progressieve spieratrofie aandoening waarvoor geen behandeling beschikbaar is. Toch verscheidene potentiële farmaceutische verbindingen en gentherapiebenaderingen zijn gevorderd in klinische proeven. Met verbetering van de spierfunctie het belangrijkste eindpunt in deze onderzoeken, is veel nadruk gelegd op het opzetten van betrouwbare, reproduceerbare, en makkelijk om functionele testen uit te voeren om klinisch pre spierfunctie, kracht, conditie en coördinatie bij de beoordeling geplaatst mdx muismodel voor DMD. Zowel invasieve en niet-invasieve testen beschikbaar. Tests die nog niet over de ziekte verergeren kan worden gebruikt om te bepalen de natuurlijke geschiedenis van de ziekte en de effecten van therapeutische interventies (bv. Voorpoot grijpkracht test, twee verschillende hangende testen met behulp van een draad of een rooster en rotarod hardlopen). Als alternatief kan gedwongen loopband lopen worden gebruikt om progressie van de ziekte te verbeteren en / of te beoordelenbeschermende effecten van therapeutische interventies op ziekte pathologie. We beschrijven hier hoe deze meest gebruikte functionele tests op betrouwbare en reproduceerbare wijze. Met behulp van deze protocollen op basis van standaard operationele procedures maakt de vergelijking van gegevens tussen verschillende laboratoria.

Introduction

Duchenne spierdystrofie (DMD) is de meest voorkomende neuromusculaire aandoening die 1:5000 pasgeboren jongens. Deze ernstige en progressieve spieratrofie ziekte wordt veroorzaakt door mutaties in het DMD gen dat het open leesraam verstoren en voorkomen de synthese van functionele dystrofine proteïne. Spiervezels ontbreekt dystrofine zijn kwetsbaar voor geïnduceerde schade te oefenen. Na uitputting van regeneratieve capaciteit van de spier, en door chronische ontsteking van beschadigde spieren, worden vezels vervangen door bindweefsel en vet, vervolgens leidt tot een verlies van functie. In het algemeen, DMD patiënten verliezen ambulantie van de onderste ledematen in het begin van het tweede decennium. Later, ook de spieren van de armen en schoudergordel zijn getroffen en patiënten vaak thoracolumbar scoliose door asymmetrische verzwakking van de spieren ondersteunen het ruggenmerg. Geassisteerde ventilatie is over het algemeen nodig is in de late tienerjaren of begin twintig. Ademhalings-en hartfalen looddood in de derde of vierde decennium ^1.

Hoewel het veroorzakende gen is ontdekt meer dan 25 jaar geleden ^2, is er geen behandeling beschikbaar voor DMD. Echter, een betere gezondheidszorg en het gebruik van corticosteroïden hebben de levensverwachting toegenomen in de westerse wereld ^3. Met het gebruik van dierlijke modellen zoals de mdx muis, belangrijke stappen in de ontdekking van potentiële therapeutische strategieën zijn gemaakt. De mdx muis is de meest gebruikte DMD muismodel. Het heeft een puntmutatie in exon 23 van het muizen Dmd gen en dus ontbreekt dystrofine ^4. In de afgelopen paar jaren hebben vele voorgestelde strategieën ontwikkeld tot klinische studies ^5-9. In deze studies, verbetering van de spierfunctie is het primaire eindpunt, wat het belang van het testen van het voordeel van de verbindingen op de spierfunctie bij muizen tijdens de preklinische fase van het testen.

Net als DMDpatiënten, ook het dystrofine negatieve spiervezels van mdx muizen zijn kwetsbaar voor veroorzaakte schade te oefenen en hun spierfunctie is verminderd ten opzichte van C57BL/10ScSnJ wild-type muizen. Deze bijzondere waardevermindering kan worden beoordeeld met een verscheidenheid aan functionele tests. Sommige van deze tests zijn niet-invasieve en niet interfereren met spier-pathologie (bv. voorpoot grijpkracht, opknoping testen en rotarod hardlopen). Daarom kunnen ze worden gebruikt om het natuurlijke beloop van de ziekte of het effect van een verbindingen van ziekteprogressie. Om een grondige beeld van de invloed van verbindingen op de spierfunctie in mdx muizen, een functionele test regime dat niet interfereert met ziekteprogressie bestaande uit al deze tests kunnen worden gebruikt ^10.

Als alternatief kan gedwongen loopband lopen worden gebruikt om opzettelijk verergeren progressie van de ziekte en test de beschermende capaciteiten van verbindingen ^11. De loopband kan ookals resultaat mate waarin looptijd tot uitputting gemeten ^12, of als een middel om vermoeidheid mdx muizen, zodat ze minder goed presteren in een volgende functionele beproeving die groter verschil in prestaties tussen behandelingsgroepen ^13. Bij het ​​kiezen van functionele tests, moeten hun effect op de progressie van de ziekte in gedachten worden gehouden vooral bij het ​​testen dystrophic muizen als de mdx muis ^14.

Wij hier in detail beschrijven hoe aan de meest gebruikte functionele testen op een betrouwbare en reproduceerbare wijze op basis van beschikbare standaard operationele procedures van de TREAT-NMD netwerk uit te voeren. Klik hier om naar TREAT-NMD .

Protocol

De hier beschreven experimenten werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee (DEC) van het Leids Universitair Medisch Centrum (LUMC). Muizen werden gefokt door het dier faciliteit van het LUMC en bewaard in individueel geventileerde kooien met 12 uur licht donker cycli. Ze hadden ad libitum toegang tot water en standaard chow.

Bij het uitvoeren van een van de functionele tests hieronder beschreven experimentele condities moeten streng gecontroleerd worden om de variatie te verminderen. Bij voorkeur dient leeftijd en geslacht overeen muizen worden gebruikt als prestaties verschillen tussen leeftijd en geslachten. Muizen die tot hetzelfde nest worden gerandomiseerd in de experimentele groepen. De dieren moeten worden getest door dezelfde exploitant, die is blind voor de experimentele groepen. Tests moeten worden uitgevoerd op hetzelfde tijdstip van de dag en dag van de week, dezelfde kamer geuren, geluiden, etc. egaliseren ¹⁴ Grote variatie tussen individuele muizen en tijdstippen kan worden waargenomen voor allefunctionele tests, dus 6-8 muizen / experimentele groep worden gebruikt. Functionele test kan ook grotendeels verschillen tussen verschillende inteelt wild-type stammen. Daarom moeten experimentele en controle wild-type muizen altijd overeenkomstige achtergronden hebben (in geval van mdx muizen gebruiken het C57BL/10ScSnJ wild-type stam). Alle gegevens die hier worden beschreven zijn verkregen met het C57BL/10ScSnJ wild type stam, die wij aanduiden als wild type van hier op. De hier beschreven tests kunnen in lengterichting worden uit ten minste 1-19 maanden in mdx en wildtype muizen. Tests moeten niet worden herhaald meer dan eenmaal per week aan muizen voorkomen verliezen interesse en bereidheid om de taak uit te voeren.

1. Voorpoot Grip Strength Test

Gebruik de voorpoot grijpkracht test om de sterkte van de voorpoten te meten. De test is gebaseerd op de neiging van een muis instinctief grijpen een rooster bij suspensie door de staart ¹⁵ en van ADAPTEd van DMD_M2.2.001.pdf .

1. Apparatuur opzetten: Bevestig een grid naar een krachtopnemer, die de maximale kracht van de muis toegepast op de grid tijdens de pull meet. Zorg ervoor dat de instelling over Peak spanning modus (T-PK) voor het trekken. De eenheden van kracht kan worden aangepast in zowel gram-kracht, g-kracht, kilo-van kracht, kilogram-kracht, of Newton.
   Opmerking: Wij geven de voorkeur om te werken met grammen als eenheid van waarden. Meerdere meters zijn in de handel verkrijgbaar, maar alleen axiale transducers geven betrouwbare uitkomsten als type hefboom krachtopnemers negatief worden beïnvloed door de fysische wetten van het hefboomeffect. Ofwel een nonflexible raster of driehoek kan met staven die 1-2 mm in diameter.
2. Vóór de test beoordeelt het lichaamsgewicht van de muis, om normalisatie voor het lichaamsgewicht mogelijk.
3. Gebruik gram als eenheid van waarden. Reset de meter aan het begin van elk recording.
4. Verwijder de muis uit zijn kooi door grijpen de staart en het horizontaal verplaatsen naar het rooster.
5. Controleer of de muis grijpt het rooster stevig met beide voorpoten.
6. Trek de muis weg van het net zodat de greep wordt gebroken, de grootste kracht uitgeoefend op de grid op de transducer display, die handmatig of automatisch opgenomen kunnen worden weergegeven.
7. Alleen rekening rukken in de rekening waarop de muis toont weerstand tegen de experimentator. Maatregelen die op een voorpoot of de achterste ledematen werden gebruikt en waarbij de muis bleek tijdens de trek verwerpen.
8. Laat de muis trekt het net drie keer achter elkaar en dan terug in de kooi voor een rustperiode van ten minste een minuut. Opmerking: tussen serie trekt een rustperiode is noodzakelijk voor de muis om te herstellen en te voorkomen dat gewoontevorming.
9. Laat dan de muis uit te voeren vier series van trekt, elk gevolgd door een korte rustperiode. Op deze manier de mouse heeft een totaal van 15x (3 trekt x 5 keer = 15 maal trekken) getrokken.
10. Bepaal de maximale grijpkracht en normaliseren van het lichaamsgewicht door het gemiddelde van de drie hoogste waarden van de 15 waarden verzameld.
11. Optioneel: Bepaal vermoeidheid door berekening van het verlagen van het gemiddelde van de eerste twee en de laatste twee reeksen trekt 1 +2 +3 = A, 4 +5 +6 = B, 10 +11 +12 = C en 13 +14 + 15 = D. De formule: (C + D) / (A + B) geeft een waarde van 1 voor muizen die niet vermoeid. Dit kan worden uitgedrukt in procenten, zodat een muis zonder vermoeiing heeft een waarde van 0% en een muis die voorpoten volledig vermoeid heeft een waarde van 100%.

2. Opknoping Tests

Met hangende testen, balans, coördinatie en spieren voorwaarde kan worden beoordeeld. Deze tests zijn gebaseerd op de wetenschap dat muizen staan ​​te popelen om te blijven opknoping op een draad of rooster tot uitputting ^16. Er zijn twee verschillende hangende testen waarbij bij aanvang van de proef hetzijalleen de twee voorpoten of alle vier de ledematen worden gebruikt, met een draad of raster respectievelijk. De hangende test met de draad en het rooster zijn de langste schorsing tijd methode aangepast van DMD_M.2.1.004.pdf en DMD_M.2.1.005.pdf respectievelijk. Een vaste opknoping limiet wordt gebruikt van 600 sec. De meerderheid van de wild-type muizen kunnen hangen voor 600 sec, terwijl dystrophic muizen niet kunnen. Om tijd te besteden uitvoeren van deze test te verminderen, werd een maximale hangende tijd opgezet. Muizen die de draad of raster vallen voor die tijd krijgen maximaal twee pogingen. Dit wordt gedaan om te herverzekeren dat muizen zijn echt niet in staat om op te hangen en niet vallen als gevolg van onhandigheid.

1. Opknoping proef met twee onderdelen
   1. Apparatuur opgezet: Nauw zorgen voor een 2 mm dikke metalen doek hanger aan een plank met tape en de hanger ongeveer 37 behouden0; cm boven een laagje strooisel. Opmerking: Als alternatief zou een 55 cm breed, 2 mm dikke metalen draad die strak wordt bevestigd tussen 2 verticale stands worden gebruikt. De afstand van 37 cm is voldoende om muizen aan te moedigen om te blijven hangen, maar ook laag genoeg om muizen te voorkomen van blessures bij het vallen. De draad moet niet trillen of verdringen tijdens de test, omdat dit kan interfereren met de prestaties van de muis.
   2. Omgaan met de muis via de staart en breng het in de buurt van de draad.
   3. Laat de muis grijpen de draad met alleen de twee voorpoten en de achterpoten zakken zodanig dat de muis hangt alleen de twee voorpoten op de draad (figuur 2B).
   4. Direct de timer te starten wanneer de muis loslaat. Na de release, sterke muizen proberen de draad halen met alle vier ledematen en de staart, die is toegestaan ​​(figuur 2C).
   5. Wanneer een muis toont ongepast gedrag (zoals balanceren op of opzettelijk springen uit de draad als shbezit in figuren 2D en 2E), dit rechtstreeks tot de muis vervangen op de draad zonder stoppen van de timer.
   6. Wanneer een muis valt de draad, stop de timer en noteer de hangende tijd.
   7. Bij muizen zijn in staat om op te hangen voor 600 sec, neem ze uit de draad en breng ze terug naar de kooi. Muizen die vóór deze grens vallen, krijgen maximaal twee meer probeert.
   8. Noteer de maximale hangende tijd (dwz de langste van de proeven) en gebruik deze voor verdere analyse.
2. Opknoping proef met vier ledematen
   1. Apparatuur opgezet: Gebruik een van beide een hand plein of op de deksel van een grote kooi voor een rat of een konijn voor deze test gemaakt. Plaats het rooster 25 cm boven zacht beddengoed om muizen te voorkomen dat zelfbeschadiging op vallen, maar ook om muizen te ontmoedigen om opzettelijk te springen uit het rooster. Stevig vast het rooster, zodat de experimentator niet hoeft aan het net tijdens het experiment als deze bewegingen met de hand te houden zou iknterfere met de prestaties van de muis.
   2. Plaats de muis op het rooster zodat het grijpt met zijn vier poten.
   3. Keer het rooster, zodat de muis is opknoping en de timer direct starten.
   4. De test sessie eindigt voor muizen die in staat zijn om op te hangen voor een duur van 600 sec zijn. Geef muizen die uit het rooster vallen eerder een maximum van twee meer probeert.
   5. Gebruik de maximale hangende tijd (dwz. De langste van de proeven) voor verdere analyse.

3. Rotarod Running

Met de rotarod proef spierkracht, kan coördinatie, balans en conditie worden vastgesteld ^17.

1. Apparatuur opgezet: Voor deze test, muizen moeten draaien op een roterende buis. Controleer of de constante snelheid wordt ingesteld op 5 omwentelingen per minuut (rpm), en dat de snelheid toeneemt 5-45 rpm in de eerste 15 seconden bij het starten. Daarna moet het de snelheid behouden.
2. Plaats de muizen op de buis van de rotarodals het draait met een langzame constante snelheid van 5 rpm. Vijf muizen kunnen gelijktijdig worden getest.
3. Start de run zodra alle muizen zijn geplaatst. Binnen de eerste 15 seconden van de snelheid van de buis versnelt 5-45 min, waarna zij dat snelheid.
4. Bewaken van de run. De looptijd wordt continu geregistreerd door de software. Looptijd stopt automatisch wanneer een muis valt de buis als deze activeert de tijdbalk onder de buis geplaatst. Verplaatsen muizen die draaien rond geconfronteerd met de tegenovergestelde richting op de buis tijdens het hardlopen zonder te stoppen de buis te draaien.
5. Het einde van de testsessie voor muizen die kunnen draaien voor een duur van 500 sec zijn. Geef muizen maximaal twee pogingen zodat ze verbeteren van hun looptijd, wanneer zij eerder vallen.
6. Gebruik de maximale looptijd (de langste van de proeven) voor verdere analyse.

4. Tredmolenoefening

Deloopband kan op drie manieren gebruikt als een instrument in de pre klinisch onderzoek. Ten eerste kan gedwongen loopband lopen worden gebruikt om de ziekte pathologie verergeren zoals beschreven in dit protocol (zie ook: DMD_M2.1.001.pdf ). Ten tweede kan de maximale lopende vermogen van muizen en het effect van de behandelingen op deze worden beoordeeld (Zie voor de methode te laten muizen lopen tot uitputting DMD_M.2.1.003.pdf ). Ten slotte kan loopband lopen worden gebruikt voorafgaand aan een andere functionele test om de muis te putten, zodat het minder goed presteert in de tweede proef ^13. Dit gebeurt door het uitoefenen muizen tweemaal of driemaal per week zoals hieronder beschreven, onmiddellijk gevolgd door een van de functionele tests protocol 1-3 beschreven.

1. Apparatuur opgezet: Er zijn verschillende loopbanden commercieel verkrijgbaar waarop meerdere muizen kan run gelijktijdig en waarvoor hoogte, duur en snelheid kan worden aangepast. Sommige loopbanden zijn voorzien van een rooster lage intensiteit schokken toe te dienen aan muizen stimuleren draaien. Echter, mdx muizen zijn gevoelig voor stress en kan gemakkelijk in een vriendelijker manier worden gemotiveerd door een lichte druk met de hand in de looprichting. Daarom is het sterk aangemoedigd om NIET de schok net. Over het algemeen wordt de stimulering van de kant alleen nodig tijdens de eerste lopende sessie.
2. Plaats de muizen op de horizontale loopband.
3. Start de loopband bij een loopsnelheid van 12 m / min. Lagere snelheden (8 m / min) moet in oude muizen (> 15 maanden), waar hogere snelheden gemakkelijk leiden tot uitputting.
4. Gedurende de eerste sessie stimuleren muizen lopen door ze zachtjes als ze aan het einde van de band.
5. Wanneer de muizen lopen voor een duur van 30 minuten, plaats ze terug in hun kooi.
6. Herhaal dit twee keer per week voor oa 12 weken.
7. Laat rustpauzes wanneer nodig. Bijvoorbeeld, sommige mdx muizen te stoppen en moet worden toegestaan ​​om te rusten voor een paar minuten. Als dit gebeurt, zet de riem af, geven alle muizen een rustperiode van twee minuten, draai de riem op twee minuten bij 4 m / min. Hierna verhogen snelheid 12 m / min en laat de muizen om het protocol te beëindigen. Het is belangrijk dat alle muizen voltooien de gehele lopende protocol.
   
   Opmerking: In het geval mdx muizen nodig rusttijden, overweeg dan een warming-up voor de 30 min. oefening protocol. Dit opwarmen sessie bestaat uit: 2 min acclimatisatie periode bij een snelheid van 4 m / min, onmiddellijk gevolgd door een 8 minuten opwarmen bij 8 m / min.
   
   
   In onze handen 4-16 weken oude vrouwelijke mdx muizen zijn in staat om de 30 min oefening protocol te voltooien zonder te rusten. Anderen hebben gemeld dat in dezelfde leeftijd mannelijke mdx muizen 45% of de muizen hoeft rustperioden om de oefening te voltooien. De warming-up protocol verminderens de hoeveelheid stops ^12.

Results

De voorpoot grijpkracht van wild-type en mdx muizen verhoogt tussen de leeftijd van 4-12 weken en vermindert weer in oudere muizen. Stoornissen in kracht kan reeds op jonge mdx muizen. Representatieve gegevens van 9 weken oude vrouwelijke muizen worden getoond in Figuren 1A en 1 B. Hoewel vermoeidheid verschilt niet tussen de stammen nog op deze leeftijd, mdx muizen zijn zwakker dan wild-type muizen. We hebben nog geen gegevens hebben over vermoeidheid bij oud...

Discussion

De functionele tests hier gepresenteerde reproduceerbaar, gemakkelijk uit te voeren en van toepassing op wild-type en dystrophic muizen onafhankelijk van hun leeftijd. De tests geven nuttige instrumenten voor een pre klinisch spierfunctie, kracht, conditie en coördinatie te beoordelen. Bij het testen van de effecten van een verbinding over de natuurlijke geschiedenis van de ziekte, de niet-invasieve test hier beschreven (voorpoot grijpkracht, zowel opknoping tests en de rotarod test) kan mooi worden gecombineerd in een ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Muis gripsterkte meter	Chatillon DFE (doorverkocht door Columbus Instruments)	# 80529
Hangende draad 2 ledematen apparaat	Kledenhanger of op maat gemaakt apparaat
Hangende draad 4 ledematen apparaat	Deksel van rattenkooi of op maat gemaakt apparaat
Rotarod	Ugo Basil	# 47600
Laufband voor muizen Exer 3/6	Columbus Instruments	# 1055SRM