Methodenartikel

Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen

DOI:

10.3791/51306

⸱

3 november 2014

 ,  , 
1Integrated Department of Immunology and Integrated Center for Genes, Environment, and Health, National Jewish Health and University of Colorado School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol beschrijven we methoden om efficiënt muis macrofaag cellijnen te transfecteren met siRNA's met behulp van het Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systeem, de macrofagen te stimuleren met lipopolysaccharide, en de effecten op de productie van inflammatoire cytokinen te monitoren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macrofagen zijn belangrijke fagocytische aangeboren immuuncellen. Wanneer macrofagen een ziekteverwekker tegenkomen, produceren ze antimicrobiële eiwitten en verbindingen om de ziekteverwekker te doden, produceren ze verschillende cytokinen en chemokinen om andere immuuncellen aan te trekken en te stimuleren, en presenteren ze antigenen om de adaptieve immuunrespons te stimuleren. Daarom is het belangrijk om macrofagen efficiënt te kunnen manipuleren met technieken zoals RNA-interferentie (RNAi) om deze belangrijke aangeboren immuuncel te onderzoeken. Macrofagen kunnen echter technisch uitdagend zijn om te transfecteren en kunnen een inefficiënte RNAi-geïnduceerde gen-knockdown vertonen. In dit protocol beschrijven we methoden om twee muismacrofagen-cellijnen (RAW264.7 en J774A.1) efficiënt te transfecteren met siRNA met behulp van het Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System en beschrijven we procedures om het effect van siRNA op gen-knockdown te maximaliseren. Bovendien zijn de beschreven methoden aangepast om in 96-well formaat te werken, waardoor middelgrote en hoogdoorvoerstudies mogelijk zijn. Om de bruikbaarheid van deze aanpak te demonstreren, beschrijven we experimenten die RNAi gebruiken om genen te remmen die lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerde cytokineproductie reguleren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol beschrijven we efficiënte methoden om genen in muizen macrofaag cellijnen met siRNA remmen en de effecten van de behandelingen die de aangeboren immuunrespons. Deze procedures worden uitgevoerd in 96-well formaat, waardoor RNAi schermen in middel- of high-throughput wijze.

In reactie op infectie, mens zet onmiddellijk aangeboren immuunrespons en een trager, maar specifieker adaptieve immuunrespons. Deze snelle aangeboren immuunrespons impliceert de werving en activering van fagocyterende aangeboren immuuncellen waaronder macrofagen 1. Klassiek geactiveerde macrofagen betrokken zijn bij acute ontstekingsreacties en produceren antimicrobiële eiwitten en verbindingen, cytokinen en chemokinen, en presenteren antigenen 2,3. Alternatief geactiveerde macrofagen een rol spelen bij het ​​reguleren van de immuniteit, het handhaven tolerantie, weefselherstel en wondgenezing 4-8. Vanwege hun gemak functies, Macrofagen een rol in talrijke ziekten zoals atherosclerose, artritis, kanker en 9 spelen. Zo is de studie van macrofagen is een belangrijk onderzoeksgebied enige tijd in diverse ziektecategorieën.

Ondanks hun belang in de aangeboren immuunrespons, kan macrofagen uitdagend cellen om mee te werken. In het bijzonder is het moeilijk om doelmatige transfectie met lipide reagentia in macrofagen te verkrijgen zonder geassocieerde toxiciteit 10,11. Zelfs wanneer siRNA efficiënt afgeleverd macrofagen, de robuustheid van RNAi-geïnduceerde gen vaak knockdown kan tamelijk gematigd zijn en kunnen variëren van gen tot gen.

Om deze technische uitdagingen te overwinnen, hebben wij transfectie en knock-down technieken 12-16 geoptimaliseerd in twee muis macrofaag cellijnen, RAW264.7 17 en J774A.1 18. Deze aanpak maakt gebruik van de Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systeem voor transfectie; dit systeemeen combinatie van speciale reagentia en elektroporatie cellen in 96-well formaat 19 transfecteren. Na transfectie, beschrijven we methoden om cel herstel en de levensvatbaarheid te maximaliseren en de daaropvolgende siRNA-geïnduceerde gen knockdown maximaliseren. Ter illustratie van de bruikbaarheid van deze benadering beschrijven we een protocol voor siRNA levering aan deze macrofaag cellijnen, stimuleren deze cellen met lipopolysaccharide (LPS), en bewaken de aangeboren immuunrespons op het productieniveau van verscheidene pro-inflammatoire cytokines. Wij bieden sample data in welke doelgroep we de Toll-like receptor (TLR) familie, waarvan de leden voelen LPS en andere pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs), om aangeboren immuniteit te regelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Onderhoud van macrofaagcellijnen

  1. Groeien RAW264.7 en J774A.1 cellijnen in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C in aanwezigheid van 5% CO2. Om steriliteit te behouden, voeg 1% penicilline / streptomycine (pen / strep) aan de media (hoewel dit niet strikt noodzakelijk).
  2. Kritische stap: Zorg ervoor dat de macrofagen groeien in een gezonde staat voor een efficiënte transfectie en siRNA-geïnduceerde gen-knockdown. Gebruik cellen tussen passages 3 en 10 na de verse ontdooien, omdat deze macrofagen lijnen vertonen de beste transfectie-efficiëntie en onderhouden robuuste post-transfectie overleven in deze fase; geen gebruik maken van een hogere passage aantal (> 20), zoals transfectie-efficiëntie en gen knockdown beide verminderen sterk.
  3. Voor optimale siRNA transfectie cellaag bij 20% confluentie groeien en één of twee dagen tot de cellen niet meer dan 80% confluentie bereiken. Overgrown cellen zullen niet transfecteren efficiently.

2. Het programmeren van de 96-well Shuttle Systeem voor Transfection

  1. Start de 96-well shuttle-software op de computer is aangesloten op de shuttle. Selecteer nieuwe parameter file vanaf linksboven bestand menu.
  2. Markeer de putjes die worden getransfecteerd op de getoonde 96-well plaat schema. Een groen vakje geeft aan welke bronnen zijn geselecteerd.
  3. Selecteer het programma dat overeenkomt met de macrofaag cellijn gebruikt (DS-136 voor RAW264.7 of DS-130 voor J774A.1) en selecteer toepassing, onder de diagramed 96-well plaat gelegen. Merk op dat na het selecteren van een programma, de putten op het schema plaat wordt gekleurd donkerblauw. Lege cirkels geven putten die niet zijn toegewezen aan een programma en zal niet geschokt.

3. Voorbereiden van de reagentia voor transfectie

  1. Bereid de werkende Nucleofector ™ oplossing door het mengen van SF-cellijn 96-well Nucleofector ™ -oplossingmet de volledige inhoud van de bijgevoegde supplement buis. Laat de gemengde reagentia equilibreren bij kamertemperatuur vóór gebruik. Slaan overtollige volledige Nucleofector ™ oplossing bij 4 ºC gedurende maximaal 3 maanden voor toekomstig gebruik.
  2. Voorverwarmen het DMEM, RPMI-1640, 0,25% trypsine / EDTA, en fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C alvorens met de macrofagen voor transfectie.
  3. Bereid de siRNA voor transfectie door ontdooien op ijs. Om het aantal vries dooi van de siRNA minimaliseren bevriezen nieuwe siRNA in aliquots de eerste keer gebruikt.
  4. In eerste experimenten gebruikt siRNA bij een relatief hoge dosis van 2 uM (verdund 1:10 van 20 uM voorraden). Vervolgens titreren siRNA's die robuuste gen knockdown neer op lagere doses veroorzaken, hoewel doorgaans hogere doseringen nodig zijn voor een efficiënte gen knock-down in macrofagen in vergelijking met andere soorten cellen.
    OPMERKING: siRNA's zijn verkrijgbaar uit vele bronnen; vrij robuust gen knock-down kan worden verkregengebruik siGenome SMARTPOOLs die pools vier siRNAs targeting elk gen. Als negatieve controle, gebruik een van de verschillende niet-targeting siRNA zwembaden of siRNA's.
  5. De transfectie-efficiëntie te controleren, of het transfecteren pmaxGFP controle plasmide (verschaft in de Amaxa kits) of fluorescentie-gemerkt siRNA parallel aan de experimentele siRNA. Verwacht 30-50% transfectie van het GFP plasmide (bepaald met microscopie of flowcytometrie de dag na transfectie) en> 99% transfectie van fluorescent-gelabelde siRNA (geanalyseerd door flow cytometrie onmiddellijk na transfectie en herstel).

4. Voorbereiding van de macrofagen voor Transfection

  1. Los aanhangend macrofagen uit de celkweek gerechten door behandeling met trypsine. Zuig het medium en was de cellen tweemaal met 10 ml PBS. Na verwijdering van het PBS, incubeer de cellen met voorverwarmd 0,25% trypsine / EDTA (1 ml / 10 cm schaal) gedurende 1-2 min tot cellen beginnen te los. Tik voorzichtig de plaat en beweeg de oplostie tijdens de incubatie trypsine maximaliseren.
  2. Na de incubatie, voeg 9 ml DMEM + FBS media, meng voorzichtig op en neer, en verzamel de cellen door pipetteren in een steriele buis.
  3. Tel het aantal geïsoleerde macrofagen met behulp van een hemocytometer. Verwachten ongeveer 10 miljoen macrofagen per 10 cm plaat. Bereken het aantal macrofagen nodig; elke put op de 96-well shuttle vereist 200.000 cellen. Vergeet niet om de waarde van de cellen van een paar extra putten 'toe te staan ​​voor pipetteren verliezen.
  4. Pipetteer het berekende aantal cellen in een centrifugebuis. Centrifugeer de cellen gedurende 10 min bij 150 xg bij kamertemperatuur. Wees niet te snel centrifugeren als deze macrofagen gezondheid en transfectie-efficiëntie zal afnemen.

5. Nucleofection van macrofagen met siRNA

  1. Met behulp van een steriele 96-well ronde bodemplaat (dat vergemakkelijkt het mengen terwijl het minimaliseren van reagens verlies), voeg 2 pi van elke siRNA aan elk putje te zijn transfweerspiegelde.
    Opmerking: Afhankelijk van het aantal siRNAs, kan dit worden bereikt tijdens de macrofaag centrifugatiestap.
  2. Zuig het medium van de cellen gecentrifugeerd. Voorzichtig resuspendeer de cellen in Nucleofector ™ oplossing SF (bevattende het supplement oplossing), met 20 gl per 200.000 cellen gepelleteerd. Eenmaal geresuspendeerd, gebruiken de cellen onmiddellijk voor optimale transfectie.
  3. Transfer geresuspendeerd cellen in een steriele trog; met een multichannel pipet 20 ul van de geresuspendeerde cellen mengsel in elk putje van de 96-well plaat met de siRNA. Meng voorzichtig door en neer te pipetteren.
  4. Overdracht 20 ul van de cel / siRNA mengsel in de 96-well Nucleocuvette ™ plaat Kritische stap:. Vermijd genereren bubbels tijdens de overdracht stap als deze fouten tijdens Nucleofection kan induceren.
  5. Na het plaatsen van alle experimentele monsters in de transfectie, bovenkap de 96-well plaat met de ontvangen deksel en very tik zachtjes op een hard oppervlak om eventuele luchtbellen uit de monsters te verwijderen.
  6. Plaats 96-well plaat met deksel in de 96-well Nucleofector shuttle en selecteer 'uploaden en start' in de rechterbenedenhoek van het scherm programma. Voorafgaand aan Nucleofection, volgt het programma prompt om de resultaten op te slaan.
    Opmerking: Bij het Nucleofection proces putjes succes getransfecteerd worden afgebeeld op de 96-well schema op het scherm een ​​groene cirkel met een plusteken. Een rode cirkel met mintekens een fout aangeeft, waarschijnlijk door luchtbellen of verkeerd pipetteren de juiste hoeveelheid reagentia.

6. Herstel en Plating van macrofagen

  1. Onmiddellijk na Nucleofection, met een multichannel pipet wordt 80 ul voorverwarmde (37 ° C) RMP1-1640 medium aan elk putje. Voeg de media aan de zijkant van elk putje, waarbij de media langzaam mengen met de getransfecteerde cellen, die zeer gevoelig in dit stadium. Laat de media niet toe te snel, want dit zalsterk verminderen levensvatbaarheid.
  2. Plaats de 96-well platen met getransfecteerde monsters en RPMI-1640 in een 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 2 min; Dit is essentieel om de cellen voorafgaand aan manipulatie verdere herstellen.
  3. Verwijder de 96-well plaat uit de incubator en zorgvuldig overbrengen van het mengsel uit elk putje in een 96-well weefselkweek plaat met een multichannel pipet.
  4. Met een multichannel pipet, voeg 100 ul voorverwarmde (37 ° C) DMEM + FBS medium in elk putje.
  5. Incubeer de 96-well weefselkweek plaat met monsters in een 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 24-36 uur (optimaliseren precieze timing individuele siRNA, hoewel dit tijdsbereik algemeen goed werkt).

7. Stimulatie van macrofagen met LPS

  1. Na de 24-36 uur na Nucleofection incubatie, bereiden LPS (of andere PAMPs) in vers medium. Bereid voldoende vers medium van alle putjes (200 ul media / putje van de 96-well plaat plus een beetje extra voor pipetteren). LPS verdunnen tot een eindconcentratie van 20 ng / ml in DMEM + FBS.
  2. Zorgvuldig aspireren media van de 96-well plaat en voeg de vers medium met de LPS aan de cellen.
  3. Monitor de respons op LPS of andere PAMPs op verschillende tijdstippen na stimulatie. 6 uur is voldoende om een ​​robuuste inflammatoire cytokine respons op cytokinen zoals IL-6 en TNFa genereren.

8. Controle op de Induced aangeboren immuunrespons, Gene Knockdown en levensvatbaarheid in macrofagen

  1. Bewaken LPS geïnduceerde cytokineproductie, pipet het supernatant van de cellen in een 96-wells plaat. Cytokineproductie kan dan gemeten door ELISA.
  2. Nadat de supernatant wordt verwijderd, monitoren cellevensvatbaarheid met fluoresceïne diacetaat (indien gesplitst door cellulaire esterasen in levende cellen, deze verbinding wordt fluorescerend). Identificeer siRNA's die genen te richten dat de levensvatbaarheid van cellen te controleren met behulp van de tzijn aanpak. Opmerking: de transfectie proces zelf moet weinig effect hebben op de levensvatbaarheid indien goed uitgevoerd.
    1. Voeg fluoresceïne diacetaat (5 mg / ml voorraad in aceton) aan elke well (1: 100 eindverdunning in PBS).
    2. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende één tot vijf minuten en vervolgens controleren fluorescentie in de cellen met behulp van een plaatlezer (460 nm excitatie, 515 nm emissie).
    3. Optioneel: Om de fluorescentie in de putten uniform, lyseren van de cellen met buffers zoals RIPA; Dit verschaft een uniform fluorescent signaal in de put, zoals sommige plaatlezers zijn geconfigureerd om slechts een klein deel van de put te controleren; als de cellen niet gelijkmatig zijn bedekt, zou de fluoresceïnediacetaat een onjuiste lezing te geven.
  3. Als alternatief voor controle cellevensvatbaarheid, monitor-siRNA geïnduceerd gen knockdown door qPCR met RNA afkomstig van de hechtende cellen.
    1. Nadat het supernatant van de cellen verwijderd (stap 8.1), add RLT buffer (die wordt gebruikt voor lysis en conservering van RNA) direct aan de hechtende cellen te lyseren.
    2. Isoleer RNA met een RNA-preparaat kit zoals de RNeasy mini-kit en gebruik qPCR met genspecifieke primers bewaken gen knockdown opzichte van siRNA behandeling controleren. Gebruik primers Βactin of GAPDH voor normalisatie.
  4. Als een ander alternatief voor andere aspecten van de aangeboren immuunrespons controleren, bewaken de fagocytische capaciteit van macrofagen door toevoeging van FITC-gelabelde E. coli deeltjes direct op de hechtende cellen met een kit. Naar aanleiding van de fabrikant protocol, dat slechts een paar uur duurt, bewaken fagocyterende opname met behulp van een plaat lezer of microscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de efficiëntie van transfectie deze aanpak demonstreren we gevolgd opname van FITC-gemerkt siRNA met een flow cytometer (figuur 1).

Ter illustratie van het nut van onze aanpak voor het bewaken van de aangeboren immuunrespons, transfecteerden wij siRNAs targeting bekend aangeboren immuun regulerende genen in de RAW264.7 macrofaag cellijn, de cellen gestimuleerd met LPS, en vervolgens gecontroleerd productie van pro-inflammatoire cytokines IL 6 en TNFa. Verschillende TLR...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Talrijke studies gepubliceerd waarin individuele genen zijn het doelwit van siRNA in murine macrofagen. Terwijl lipide gemedieerde transfectie is gebruikt om siRNA leveren macrofaagcellijnen individueel, deze methoden lijden mogelijke effecten op de levensduur beperkt gen knockdown en variabiliteit van gen tot gen. Robuustere assays die kunnen worden gebruikt om genen in middel- of high-throughput fashion gericht ontwikkelen, optimaliseerden we technieken met de Amaxa Nucleofector 96 putjes pendelsysteem, die meer samen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen. Dit artikel werd gesponsord door Lonza, Inc.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dank aan Brad Lackford voor de hulp bij het optimaliseren van enkele van de technieken die in dit manuscript worden beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Amaxa nucleofector 96-well shuttle systemLonzaAAM-1001S
Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kitLonzaV4SC-2096
RAW264.7 mouse macrophage cell lineATCCTIB-71
J774A.1 mouse macrophage cell lineATCCTIB-67
siGenome smartpool siRNADharmaconvaries depending on gene
Non-targeting control siRNA poolDharmaconD-001206-13-20
Block-iT fluorescent oligo for electroporationInvitrogen13750062
Ultrapure E. coli O111:B4 LPSList Biological Laboratories421
DMEM, high glucoseInvitrogen11995-065
RPMI-1640Invitrogen11875-093
Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep)FisherSV30010
0.25% Trypsin-EDTAInvitrogen25200072
96-well tissue culture platesFisher07-200-89  
96-well round bottom sterile plates (not coated)Fisher07-200-745
Mouse IL-6 Duoset ELISA kitR&D BiosystemsDY406
Mouse TNFα Duoset ELISA kitR&D BiosystemsDY410
Fluorescein diacetateSigma-AldrichF7378
RLT bufferQiagen79216
RNeasy mini kitQiagen74134
Vybrant Phagocytosis Assay KitInvitrogenV-6694

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. The innate immune response to infection. , ASM Press. (2004).
  2. Adams, D. O., Hamilton, T. A. The cell biology of macrophage activation. Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).
  3. Fujiwara, N., Kobayashi, K. Macrophages in inflammation. Current drug targets. Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).
  4. Gordon, S., Martinez, F. O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 32, 593-604 (2010).
  5. Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).
  6. Fairweather, D., Cihakova, D. Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity. Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).
  7. Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).
  8. Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23, 344-346 (2005).
  9. Burke, B., Lewis, C. E. The macrophage. , 2nd edn, Oxford University Press. (2002).
  10. Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules. PloS one. 4, (2009).
  11. Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).
  12. Alper, S., et al. Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach. ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).
  13. De Arras, L., et al. An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network. J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).
  14. Yang, I. V., et al. Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide. Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).
  15. Yang, I. V., et al. Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands. Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).
  16. Yang, I. V., et al. Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice. Genetics. 183, 1535-1544 (2009).
  17. Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
  18. Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines. The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).
  19. Zumbansen, M., et al. First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells. Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).
  20. Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
  21. Aliprantis, A. O., et al. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science. 285, 736-739 (1999).
  22. Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 413, 732(2001).
  23. Conforti, R., et al. Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands. Cancer Res. 70, 490-500 (2010).
  24. Fernandez-Botran, R., Větvička, V. Methods in Cellular Immunology. 8, CRC Press. 8(2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Amaxa NucleofectorsiRNA transfectieLPS stimulatiecytokineproductieflowcytometrieELISA assaygene knockdown

Gerelateerde artikelen