Analyse van RNA processing Reacties Met behulp van Cell Free Systems: 3 'End Splitsing van pre-mRNA Substrates In vitro

Summary

RNA polymerase II synthetiseert een precursor RNA dat buiten de 3 'uiteinde van het rijpe mRNA. Het uiteinde van het rijpe RNA cotranscriptionally gegenereerd op een plaats bepaald door RNA-sequenties, via de endonuclease activiteit van de splitsing complex. Hier hebben we detail de methode om splitsingreacties studeren in vitro.

Abstract

Het 3'-uiteinde van zoogdieren mRNA wordt niet gevormd door plotselinge beëindiging van transcriptie door RNA polymerase II (RNPII). In plaats daarvan, RNPII synthetiseert precursor mRNA tot na rijpe RNA, en een actief proces endonuclease activiteit vereist op een bepaalde plek. Splitsing van de voorloper RNA normaal gesproken 10-30 nt stroomafwaarts van de consensus polyA website (AAUAAA) na de CA dinucleotiden. Eiwitten uit de splitsing complex, een multifactoriële eiwitcomplex van ongeveer 800 kDa, doen dit nuclease activiteit. Specifieke RNA-sequenties stroomopwaarts en stroomafwaarts van de polyA site te beheren de werving van de splitsing complex. Onmiddellijk na splitsing, worden pre-mRNA gepolyadenyleerd door de polyA polymerase (PAP) stabiele RNA berichten produceren rijpen.

Verwerking van het 3'-uiteinde van een RNA transcript kan worden bestudeerd met behulp van mobiele kernextracten specifieke radioactief gemerkt RNA substraten. Kortom, een lange ^{32 <}/ Sup>-P gelabelde geknipte precursor RNA wordt geïncubeerd met nucleaire extracten in vitro en splitsing wordt beoordeeld door gelelektroforese en autoradiografie. Wanneer de juiste splitsing optreedt, een kortere 5 'gesplitst product wordt gedetecteerd en gekwantificeerd. Hier beschrijven we de klievingsbepaling details met, als voorbeeld, het 3 'uiteinde verwerking van HIV-1 mRNA.

Introduction

De biosynthese van meest volwassen eukaryote bericht RNA (mRNA) vereist een aantal post-transcriptionele modificaties zoals aftopping, splicing en polyadenylatie. Deze modificaties worden doorgaans gekoppeld correcte verwerking ¹ waarborgen en sterk de stabiliteit van het mRNA.

Het 3 'uiteinde vorming van zoogdieren pre-mRNA wordt gegenereerd door endonucleolytische splitsing van de ontluikende RNA gevolgd door toevoeging van adenylaat residuen aan de 5' gesplitst product door poly (A) polymerase (PAP) ^2-4. Bij zoogdieren wordt splitsing uitgevoerd door een multicomponent eiwitcomplex, ongeveer 800 kDa, die assembleert specifieke pre-RNA-sequenties. Het poly (A) signaal sequentie, een sterk geconserveerd canonieke hexa sequentie AAUAAA richt de splitsingsplaats op ongeveer 10-30 nt stroomafwaarts. Deze site is speciaal ontworpen door de splitsing en polyadenylatie specificiteit factor (CPSF) en de 73 kD subunit van erkendeCSPF bevat de endonuclease activiteit. De splitsing stimulatie factor (CstF) bindt een gedegenereerde GU-of U-rijke elementen sequentie stroomafwaarts van het poly (A) plaats. Bovendien is noodzakelijk voor splitsing is het zoogdier splitsing factor I (CFIm) en de zoogdier splitsing factor II (CFII). CFIm bindt de specifieke UGUA (N) sites in stroomopwaartse sequentie-elementen (gebruik) die zijn gedefinieerd voor een aantal genen en lijken betrokken te zijn bij belangrijke fysiologische processen ^5-8.

In vitro worden RNA processing reacties die gewoonlijk geanalyseerd door het gebruik van radioactief gemerkte RNA substraten ^9-12. Deze kunnen worden gesynthetiseerd door run-off transcriptie van de bacteriofaag T7 promoter of SP6. Bij het bestuderen van een polyadenylatieplaats die niet eerder gekarakteriseerd, is het noodzakelijk om genomisch DNA in plaats van cDNA gebruikt om het RNA-substraat genereren belangrijk stroomafwaartse sequenties niet in cDNA kunnen zijn. Ontwerp substraten ten minste 150 nt upstrea omvattenm en 50 nt stroomafwaarts van de splitsingsplaats / einde van het rijpe mRNA. Het splitsingsproduct migreert sneller dan het substraat; Echter, omdat andere fragmenten worden gegenereerd door niet-specifieke nuclease beroep specificiteit van de reactie moet worden gecontroleerd door de afhankelijkheid van de juiste verwerking signaalsequenties. Daarom RNA substraten met een puntmutatie in de sequentie AAUAAA (bijv. AAGAAA) dienen als negatieve controle voor de splitsingreactie.

Omdat een kleine hoeveelheid radioactief gemerkt RNA wordt gebruikt voor de splitsingreacties kan RNases aanwezig in hoge overvloed in de meeste nucleaire extracten problematisch zijn, en beperken de keuze van het uitgangsmateriaal voor de bereiding extract. HeLa-cellen hebben de neiging om lage niveaus van endogeen RNases bevatten en dus goed presteren in deze testen.

De endonucleolytische splitsing van het RNA substraten in vivo en in vitro wordt onmiddellijk gevolgd door de poly (A) toevoeging, doTussen de gesplitste tussenliggende niet in detecteerbare hoeveelheden. Daarom, om ofwel een specifiek RNA-sequentie of eiwitten betrokken bij een splitsingreactie bestuderen experimenten worden uitgevoerd onder omstandigheden die polyadenylatie voorkomen. Er is geen afhankelijkheid van splitsing op polyadenylatie, of vice versa, zodat men polyadenylering kan stoppen zonder nadelige gevolgen voor het splitsingsreactie. Aldus wordt ATP vervangen door een ketenbeëindigende analoog met de 3-hydroxylgroep mist zodat slechts een enkel nucleotide op de poly (A) site kan worden opgenomen en onder gesplitst RNA kunnen worden gedetecteerd.

Gezien de complexiteit en hoge bijzonderheid van dit type test beschrijven we een gedetailleerde video protocol endonucleolytische splitsing bestuderen door de splitsing / poly (A) machines mRNA precursoren in vitro. We beschrijven hoe voor te bereiden bevoegde kernextracten, het genereren van radioactief gemerkt RNA substraten, voeren de splitsingsreactie, en het resultaat analyseren en interpreterening producten. Figuur 1 toont een voorbeeld van substraat RNA codeert voor het 3'-uiteinde van HIV-1 pre-mRNA worden gebruikt voor een klievingsbepaling. Het 3'-uiteinde van de HIV RNA-genoom bestaat uit veel belangrijke regulerende sequenties zoals poly (A) site een G+ U rijk gebied en de USE element dat vereist voor een efficiënte rijping van het virale mRNA-transcripten ¹³ zijn . In dit voorbeeld zouden we verwachten dat de ingang RNA substraat 338 nt en na splitsing 237 nt zijn. Als polyadenylatie mocht optreden, zou een uitstrijkje van produkten waargenomen tussen 237 en 437 nt.

Protocol

1. Aanpassing van hechtende cellen in suspensie

(Deze stap is optioneel. Celsuspensie algemeen beter kernextracten echter cellen gekweekt in platen kunnen ook worden gebruikt.)

1. Pas hechtende cellen voor groei in suspensiekweek met gemodificeerde MEM Joklik, aangevuld met 5-10% kalfsserum pasgeboren of foetale runderserum en 1% L-glutamine: penicilline-streptomycine. Doorvoeren cellen in spinner kolven met een filterdeksel bij 37 ° C met 8% _CO2.
2. Bij de aanpassing van cellen, te beginnen met in een 500 ml spinfles 100 ml. Houd minimaal 0,3 x 10 ⁶ cellen / ml en vervang het medium om de 1-2 dagen tot de juiste groei is bereikt (meestal 2-6 weken). . Eenmaal aangepast, moet HeLa cellen in suspensie ongeveer elke 24 uur verdubbelen OPMERKING: Tijdens de aanpassing fase, zal het enige tijd duren voor de cellen terug te keren naar hun normale verdubbeling tarief.
3. Handhaaf de cellen bij een holsiteit van 0,5-0,8 x 10 ⁶ cellen / ml in het gewenste uiteindelijke volume (gewoonlijk 1-10 L)
4. Cellen worden typisch geoogst halverwege log fase (ongeveer 0,5-0,65 x 10 ⁶ cellen / ml en> 90% levend). Gebruik de juiste maat spinfles de gewenste hoeveelheid kweekmedium.

2. Kernextracten

1. Buffer en Bereiding van het reagens
   OPMERKING: Extractions worden uitgevoerd naar aanleiding van een gewijzigde Dignam et al. (1983) ¹⁴ kernextract procedure..
   1. Bereid 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing, buffer A, buffer C en buffer D (tabel 1) de dag alvorens extracties en bewaar bij 4 ° C.
      OPMERKING: Hogere opbrengsten worden gewoonlijk verkregen met vers bereide buffer; echter de buffer stabiel gedurende enkele weken. Het is belangrijk dat alle buffers, apparaten en apparatuur voorgekoeld en koud voor het geheel van de extracties gehouden.Gebruik een koude ruimte voor zo veel stappen mogelijk en / of houden alles op ijs. Voeg DTT en PMSF onmiddellijk voor gebruik.
2. Het verzamelen en Wassen Cellen
   1. Giet cellen in vier 250 ml conische flessen en rotatie bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C in een centrifuge met een slingerende of vaste hoek rotor. Giet bovenstaande vloeistoffen en voeg nog eens 250 ml celkweekmedium aan elke fles. Herhaal draait totdat alle cellen werden gepelleteerd.
   2. Resuspendeer gecombineerd finale pellets in een totaal van 250 ml ijskoude PBS en zwembad in een 250 ml conische fles. Draai de cellen bij 400 g gedurende 10 min bij 4 ° C in een swinging bucket centrifuge.
   3. Giet het supernatant en resuspendeer de cel pellet in ijskoud PBS, zodat het totale volume niet meer dan 50 ml. Draai de pellet via pipetteren en overbrengen in een 50 ml conische centrifugebuis.
   4. Draai de cellen opnieuw bij 500 xg gedurende 6 min bij 4 ° C in een swinging bucket centrifuge. Giet supernatant en de raming en noteer de cel pellet volume (CPV) zo nauwkeurig mogelijk. Gebruik water in een aparte passende buis, ter vergelijking, wanneer de pellet is onder het volume markeringen op de buis.
3. Cell Lysis
   1. Voeg DTT buffer A. Resuspendeer de pellet in buffer A met 5 volumina van de geschatte CPV. Pipet te breken van de pellet en incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
   2. Draai de cellen bij 931 g gedurende 10 min bij 4 ° C in een swinging bucket centrifuge.
   3. Zuig het supernatant in plaats van decanteren zorgvuldig. Het volume pellet moet ongeveer twee maal in grootte zijn toegenomen door zwelling van de cellen.
   4. Voeg 1 CPV buffer A aan de cellen. Breken voorzichtig de pellet en verwijderen van een kleine hoeveelheid (ongeveer 50 pl) een microfugebuis op ijs. Breng de geresuspendeerde cellen in een juiste maat Dounce homogeniseerder (meestal 15 ml grootte) gekoeld op ijs.
   5. Lyseren van de cellen met 12-15 langzame maar gestage slagen van een type B (tight) stamper. Verwijderen van een kleine hoeveelheid van het lysaat en onderzoek onder een microscoop voor volledige lysis (intacte kleine donkere kernen vergelijking gezwollen cellen) door trypan blauw kleuring. Intacte cellen zullen duidelijk zijn). Doorgaan homogenation tot 90% lysis wordt bereikt en stoppen hier, dan douncing kan een negatieve invloed kwaliteit van kernextracten.
   6. Transfer lysaat in UltraClear ultracentrifugebuizen en noteer het totale volume. Evenwicht door weging van de buizen en draaien op 1069 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
      OPMERKING: De ultracentrifuge wordt gebruikt in deze stap ondanks de lage centrifugeersnelheid omdat dezelfde buis worden gecentrifugeerd bij hogere snelheid in de volgende stap. Deze rotatie zal een vrij strakke pellet aan de onderkant van de buis met troebeler supernatant hierboven dat kan worden verzameld en gebruikt voor cytosolische extracten S100 verkregen. Als er een zichtbare lipide laag op de buis kan worden verwijderd.
   7. Verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en breng het in anoth.. eh buis Vermijd het verstoren van de nucleaire pellet LET OP: Het is belangrijk om het uiteindelijke volume van de bovenstaande vloeistof weten om gepakt nucleaire volume (PNV) te bepalen.
4. Voorbereiding van de Nuclear Extract
   1. Nadat het supernatant zorgvuldig verwijderd, respin het ruwe nucleaire extract pellet bij 25.453 xg gedurende 15 min bij 4 ° C in dezelfde buis.
   2. Verwijder het resterende supernatant (het moet een kleine hoeveelheid heldere vloeistof) en voeg deze toe aan de vorige collectie supernatant. Meet het uiteindelijke volume van de supernatant. Bereken het PNV door het aftrekken van dit volume van het totale volume van het oorspronkelijke lysaat eerder opgemerkt. Alternatief, wanneer de pellet is groot genoeg, het volume kan worden geschat door vergelijking met gelijke hoeveelheid water in dezelfde buis.
   3. Voeg 1 PNV volume buffer C (ongeveer 1 ml / ml cellen). Verjagen voorzichtig de pellet met een pipet tip en overbrengen naar een geschikt sized Dounce homogenisator. Bij gebruik van dezelfde homogenisator als voorheen, Voorspoelen de homogenisator met steriel gedemineraliseerd water.
   4. Resuspendeer de pellet met ~ 5-10 slagen via een Dounce homogeniseerder met een strak stamper.
   5. Breng het gehomogeniseerde nucleaire lysaat in een gekoelde buis en meng door inversie gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Als het volume groot genoeg is, ageren met een magnetische roer bord en draai bar.
   6. Breng het lysaat in een nieuwe UltraClear centrifugebuis en draaien met 25.453 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. De pellet moet compact zijn. Ongeveer 5 minuten voor de spin is voltooid, hydrateren de dialyse cassettes of buis die een geschikte molecuulgewicht afgesneden (MWCO) hebben (bv. 7000 kDa).
   7. Verwijder de bovenstaande vloeistof (kernextract) uit de buis in een gekoeld conische buis met behulp van een transferpipet vervolgens verder met dialyse.
5. Dialyse
   1. Injecteren van de extracten in gehydrateerde dialyse cassettes als per fabrikantTussen instructies en dialyseer nucleaire extracten in 500 ml buffer D ₅₀ gedurende 1 uur bij 4 ° C onder roeren.
   2. Vervang de buffer met 500 ml verse ijskoude buffer D ₅₀ en dialyseren tegen 4 uur bij 4 ° C. Deze 4 uur stap kan in plaats daarvan worden verdeeld in twee 2 uur verandert.
   3. Verwijder de uittreksels uit de dialyse cassette en transfer naar gekoelde buizen. Draai de extracten gedurende 5 min bij 1500 xg bij 4 ° C.
   4. Aliquot van de extracten in gekoelde, Eppendorf buizen en snap bevriezen in vloeibare stikstof (50-100 ul per portie). Bewaar bij -80 ° C voor toekomstig gebruik.

3. RNA Probe Synthese

1. Sjabloon Voorbereiding
   OPMERKING: Sjablonen voor transcriptie kan PCR fragmenten of plasmiden die een T7-of SP6-promoter stroomopwaarts en direct naast de gewenste probe sequentie bevatten. Plasmide templates stroomrichting van de matrijssequentie int worden gelineariseerderest. We merkten hogere opbrengst van PCR sjablonen.
   1. De T7/SP6 promotor kan tijdens de PCR-reactie worden opgenomen. Ontwerp van de sense primer met de T7/SP6 promotor stroomopwaarts van de doelsequentie.
   2. Versterken de gewenste volgorde 2-3 reacties per template via PCR per instructie van de fabrikant met behulp van een high-fidelity polymerase.
   3. Combineer gelijkwaardige reacties en zuiveren door gel extractie.
   4. Sequentie de PCR produkten nauwkeurig template verifiëren. (Optioneel)
2. RNA transcriptie met ³² P Labeling
   1. Voer in vitro transcriptie van 1 ug van sjabloon met een commercieel verkrijgbare kit die compatibel zijn met de promotor (SP6 of T7) met de volgende wijzigingen is. Met 1 pl vers 3000 Ci / mmol ^[α-32P] UTP, 0,5 ui 10 mM koude UTP, 0,1 gl 10 mM GTP en 0,9 ui 10 mM M7G (5 ') ppp (5') G RNA cap in een totaal eindvolume van 20 pi.
      OPMERKING: De G-kap verbetert de stabiliteit van de RNA-transcripten in kernextracten (cap: GTP) 10:01 verhouding. De koude UTP wordt toegevoegd om te voorkomen dat de ^32P-UTP niet het beperkende reagens.
   2. Samenstel van een RNA ladder grootte zoals hierboven aangegeven zonder G dop. Commerciële sjablonen zijn beschikbaar voor het genereren van de RNA grootte marker.
   3. Incubeer de transcriptie reacties bij 37 ° C gedurende 1 uur (voor SP6 gebruik 40 ° C). Eenmaal voltooid, voert DNase digestie van het sjabloon voor 15 min bij 37 ° C.
   4. Na digestie, voeg 1 pl 0,5 M EDTA en 5 ui laadbuffer II aan het RNA substraten. Voeg 20 ul ladingsbuffer II naar de marker.
   5. Verwarm het RNA marker en probes bij 95 ° C gedurende 3 minuten plaats dan op ijs.
3. Polyacrylamidegel Gieten / Probe Electroforese
   1. Bereid 1 liter 6% polyacrylamide-gel (PAGE) mix en 400 ml 10% PAGE. Tot 6%, meng 150 ml van 40% 19:01 acrylamide: bis-aacrylamide met 100 ml 10X Tris / boraat / EDTA (TBE) en 460 g ureum. Brengen tot 800 ml met steriel gedeïoniseerd water en roer op een kookplaat, terwijl de toepassing een laag vuur (ongeveer 50-80 ° C). Vullen tot 1 liter met gedemineraliseerd water.
      OPMERKING: De reactie is endotherm. Verwarming bevordert de oplosbaarheid van het ureum. Verwijder uit hitte zodra het ureum opgelost en vervolgens wordt de oplossing tot 1 L met gedeïoniseerd water. Alternatief roer bij kamertemperatuur gedurende de nacht; teveel warmte polymerisatie initiëren.
   2. Bescherm de PAGE mix van licht met aluminiumfolie en bewaar bij kamertemperatuur. De PAGE mixen kan van tevoren worden voorbereid en zijn stabiel gedurende enkele maanden.
   3. Bereid 400 ml 10% PAGE mix combineert 100 ml 40% 19:01 acrylamide: bis-acrylamide, 40 ml 10x TBE en 184 g ureum. Na de ureum oplost, brengen tot 400 ml met gedemineraliseerd water.
      Als alternatief, bereiden een 20% 19:01 acrylamide oplossing en een 0% acrylamide oplossing wialleen th buffer en ureum; Deze kunnen vervolgens worden gemengd in welke verhouding een percentage in tussen 0 en 20% te geven; ureum is altijd langzaam op te lossen.
   4. Bereid 10-50 ml 10% ammoniumpersulfaat (APS) opgelost in steriel gedeïoniseerd water afhankelijk van het aantal gels te gieten.
   5. Was 20 cm x 22 cm glazen gel platen met 70% ethanol (EtOH). Droog met grote pluizende doekjes.
   6. Was de vaste plaat met 1 ml 5 N natriumhydroxide (NaOH) en vervolgens opnieuw te wassen met 70% EtOH. De vacht van de getande plaat met gel afstoten siliconisering oplossing door het schoonvegen van de plaat met een verzadigde kleine Kimwipe.
   7. Monteer de platen door het plaatsen van de reguliere plaat op een lege pipet tip doos of een stuk piepschuim om het verheffen van de tafel met de gereinigde zijde naar boven. Leg 0,4 mm spacers op de rand van elke lange zijde.
   8. Plaats het ingekeepte plaat over de afstandhouders, zodat de beklede zijde aan de binnenkant van de gel. Gebruik een scheermes of een ander dun instrument te verschuivende afstandhouders een flush aanpassing aan de onderkant en zijkanten van de gel platen vervolgens veilig bindmiddel clips aan elke zijde van de gel platen over de afstandhouders.
   9. Bereid 30 ml 8% PAGE mix per gel door 15 ml 10% en 6% mengt elk in een 50 ml buisje. Voeg snel 300 pl 10% APS gevolgd door 30 ui N, N, N ', N'-tetra-methylethylenediamine (TEMED) aan de 8% gel mix.
      OPMERKING: Passende gel percentages voor de afzonderlijke sonde maten dient door de experimentator te worden gekozen.
   10. Cap en omkeren 2x en giet de oplossing in het getande gebied van de gel platen. Zorg ervoor dat u iets te verheffen de platen met de hand en onderhouden van een zelfs giet totdat de pagina mix begint te druppelen van de bodem.
   11. Laat de borden terug naar niveau en stop meteen de grote 8-goed rechthoek kam voor 0,4 mm x 20 cm gel. Kleine belletjes in de buurt van de bodem heeft geen invloed op de lopende, maar er mogen geen luchtbellen in de putten.
       OPMERKING: </ Strong> Plaats papieren handdoeken op de tafel onder de onderkant en bovenkant van de gel om eventuele lekkages te vangen tijdens het storten.
   12. Laat het mengsel PAGE polymeriseren ten minste 30 minuten.
   13. Breng de gepolymeriseerde gel aan de koude kamer en monteer de elektroforese apparaat. Voeg koude TBE buffer om de vullijnen op de bovenste en onderste kamers.
   14. Verwijder de kam en gebruik een scheermes om eventueel vuil te verwijderen. Stel de gel in de inrichting en het gebruik van een bindmiddel clip om de plaat vast te houden aan de afdichting. Voeg koud TBE aan de bovenste kamer totdat het uitmondt in de platen.
   15. Was de putjes met een 30 ml syringe/21 G 1-1/2 "naald gevuld met koud TBE net voorafgaand aan het laden van de gelabelde RNA substraten. Een aluminium plaat op de achterkant van het glas om te helpen bij gelijkmatige warmteverdeling tijdens het lopen.
   16. Lading 3 ui van de merker en de gehele 25 ui transcriptiereactie van elk RNA-substraat in afzonderlijke putjes. Laat een goed tussen vergelijkbare grootte transcripten te pRevent kruisbesmetting. Broomfenolblauw en xyleencyanol kleurstoffen in de laadbuffer kan worden geraamd grootte migratie op de gel.
   17. Laat de gel bij een constant vermogen op de omvang van de RNA probes (bijv. 25 watt gedurende 2 uur gedurende probes van 600 nt).
4. Gelabelde RNA extractie en zuivering
   1. Na elektroforese zorgvuldig uitlekken de bovenste kamer van de gel apparaat. Het merendeel van de radioactiviteit in de gel en de onderste kamer; echter, kan de bovenste buffer sommige radioactief materiaal bevatten.
   2. Gebruik een lade om de gel te vervoeren als het verplaatsen naar een ander radioactief materiaal werkgebied. Verwijder de afstandhouders voorzichtig door aan het uitstekende stuk zijwaarts van de gel.
   3. Voorzichtig scheiden de platen. De gel moet vasthouden aan de plaat die niet werd gesiliconiseerd. Leg een stuk plasticfolie over de gel en glasplaat.
   4. Plaats een glogos autorad marker sticker op de plastic te wikkelen over een zijneen van de gel die vrij is van enige monsters.
   5. In een donkere kamer, plaats een stuk van autoradiografiefilm over de gehele plaat en bloot minstens 1 min. Ontwikkel de film.
   6. Plaats de ontwikkelde film op een lichte ondergrond. Plaats dan de plastic kant van de gel gezicht naar beneden op de film en lijn de autorad marker uit de gel om de blootgestelde marker op de film. Eenmaal uitgelijnd, gebruikt een zwarte markering op de locatie van de gewenste banden op het glas te markeren.
      OPMERKING: U uitlijnen gels / film op de volgende manier uit te snijden RNA bands. In de donkere kamer, Leg ze gel op een tafel, plaatst de film bovenop en plaats een cassette (of boek, enz.) op de top van het stuk van de film. Flick op de lichtschakelaar in de kamer kort en schakel indien uitgeschakeld. Dit zal "preflash" film genereren van een overzicht van alle putjes op de film door de druk / bescherming tegen licht dat de cassette boven verschaft. Dit maakt het gemakkelijk om de film op de gel uitlijnen en snijdenuit de band zonder het gebruik van fluorescente markers.
   7. Verwijder voorzichtig de plastic verpakking en gebruik een verse scalpel of scheermesje voor elke RNA-substraat en accijnzen de bands uit de gel en plaats in afzonderlijke 1,7 ml microfugebuisjes. Gebruik een nutator voor zachte beroeringen tijdens elutie.
   8. Voeg 500 ul van RNA elutiebuffer (0,5 M ammoniumacetaat, 10 mM _MgCl2, 1 mM EDTA, 0,2% SDS) aan elke buis. Kort centrifugeren om de gel fragment onderdompelen. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 3-16 uur afhankelijk probe grootte.
   9. Breng de volledige 500 ui geëlueerde materiaal in een nieuwe buis. Vermijd overdracht van eventuele gelstukken ze interfereren met de zuivering. Voeg 1 ui glycogeen (20 mg / ml) samen met 500 ui koude, zure fenol-chloroform (voor RNA).
   10. Kort vortex, moet de oplossing troebel is. Spin bij kamertemperatuur op topsnelheid (~ 16.000 xg) voor 5-6 minuten.
   11. Zorgvuldig transfer de bovenste (waterige) laag om nieuwe buizen te verzamelen zo veel mogelijk te vermijden, terwijl alle vuil uit de interfase. Voeg een gelijk hoeveelheid chloroform de overgedragen waterlaag. Herhaal stap 3.4.10 en breng de bovenste (waterige) laag naar een nieuwe buis. Voeg 1 ml ijskoude 95-100% EtOH om het verzamelde materiaal. Incubeer bij -80 ° C gedurende 10 minuten. OPMERKING: Het RNA kan overnacht worden bewaard indien gewenst.
   12. Pellet de RNA gedurende 30 min bij 16.000 xg bij 4 ° C. Giet voorzichtig de bovenstaande vloeistof in een radioactief afval container en voeg 1 ml ijskoude 70% moleculair-biologische kwaliteit EtOH aan elke pellet.
   13. Pellet de RNA bij 16.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C, giet bovendrijvende, draai opnieuw gedurende 1 minuut en verwijder eventueel resterende EtOH via pipet en laat bij kamertemperatuur met de doppen open om voor de verdamping van de resterende EtOH.
   14. Resuspendeer de pellets in 20-30 pi RNase vrij water. Gelabelde RNA kan worden bewaard bij -80 ° C.
       OPMERKING: Een radioactieve enquête meter moet worden gebruikt gedurende de gehele extractie procedure om te controleren of de gelabelde RNA niet is verloren tijdens elke stap.
5. Kwantificering van gelabelde RNA voor een pre-mRNA 3 'mRNA splitsingreactie
   1. Benaderen de molariteit van de splitsing substraten met behulp van de volgende procedure.
      1. Neem, bijvoorbeeld, 1 ui 3000 Ci / mmol ^[α-32P] UTP en 10 mCi / ml. (Op het etiket peildatum, de chemische concentratie van deze voorraad oplossing zal 3,3 uM UTP zijn. Vóór die datum is het hoger en een halfwaardetijd (~ 13 dagen) na de datum waarop het is ~ 1,6 mm, enz.) De gelabelde UTP bijdrage aan de uiteindelijke reactie concentratie meestal verwaarloosbaar een uiteindelijke koude UTP-concentratie boven de UTP _Km gebruikt. De T7 RNAP _Km voor UTP is 114 mm ^15.
      2. Verdun de 1 ul in 39 ul water. Voeg dan 1 pl verdunde [α- ^{32 P] UTP een geschikt volume van scintillatievloeistof in een scintillatieflesje. (NB: scintillatievloeistof is niet echt nodig voor dit specifieke activiteit van 32 P als Cerenkov telling betrouwbaar cpm waarden te geven controleren scintillatieteller handleiding voor het juiste kanaal voor Cerenkov telling kiezen en tellen volume 1 ml gedurende 1 min.).}
   2. Verdun 1 pi van elke gelabelde RNA-substraat in afzonderlijke flesjes met een gelijke hoeveelheid scintillatievloeistof in de vorige stap. Zorg ervoor dat u een flesje met alleen scintillatievloeistof naar de achtergrond te berekenen hebben. Kwantificeren radioactiviteit in een scintillatieteller.
   3. Vermenigvuldig de tellingen per minuut (cpm) voor de ^[α-32P] UTP monster 40 factor in de initiële verdunning en aftrekken van de achtergrond verkregen door scintillatievloeistof alleen. Vermenigvuldig de tellingen voor elke RNA probe door de hoeveelheid RNase-vrij water (20-30 pl) gebruikt resuspendeer de RNEen probes. Dit geeft de totale cpm van het gezuiverde RNA.
      Voorbeeld:. Max cpm = (cpm ^[α-32P] UTP - achtergrond) x 40 gelabelde RNA monster 1 = 20,000 cpm x 20 = 400.000 cpm (of 20 ul gebruikt voor resuspensie)
   4. Indien een ander dan 1 pl ^[α-32P] UTP hoeveelheid werd gebruikt om de transcripten maken, dan factor dit volume in de definitieve cpm van ^[α-32P] UTP door de cpm van de ^[α-32P] vermenigvuldigen UTP monster door de gebruikte hoeveelheid.
      Voorbeeld: 2 ui ^[α-32P] UTP wordt gebruikt om de transcripten maken. De berekende cpm 1 pl ^[α-32P] UTP 500.000 cpm. Vermenigvuldig 500.000 * 2 = 1.000.000 cpm
   5. Deel de berekende gelabelde RNA cpm van de berekende cpm van ^[α-32P] UTP alleen. Dit zal ruwweg schatten van het percentage gelabelde UTP opgenomen.
      Voorbeeld: 400000/1000000 = 0,40 of 40%opgenomen
   6. Aangezien een enzym geen onderscheid tussen isotopen, wordt hetzelfde percentage van gemerkte en ongemerkte UTP ingebouwd in het RNA tijdens de transcriptie. Bereken de hoeveelheid koud UTP in mol die wordt toegevoegd aan de transcriptiereactie (0,5 pl van een 10 mM oplossing = 5,0 x 10 ^-9 mol UTP).
   7. Vermenigvuldig de mollen UTP in de reactie van het percentage opgenomen (bekend uit de hete UTP hierboven tellen), verdeelt vervolgens dat het aantal uridines in de RNA-sequentie.
      Voorbeeld: 5,0 x 10 ^-9 mol UTP x 0,40 = 2 x 10 ^-9 mol UTP
      2 x 10 ^-9 mol UTP / 73 E per transcript = 2,7 x 10 ^-11 mol RNA
   8. Zet mol RNA molariteit door het volume van het gewonnen RNA resuspensie oplossing verdelen.
      Voorbeeld: 2.7 x 10 ^-11 mol RNA / 20 gl = 1370 nM RNA. Voor T7 RNAP transcripties gemaakt van ongeveer 1 ug lineaireseerde plasmide en geresuspendeerd in 20 pl water, waarden van 200 tot 1400 nM zijn typisch.
      OPMERKING: De molaire concentratie van RNA wordt gebruikt om te waarborgen dat de uiteindelijke pre-mRNA substraatconcentratie in de in vitro splitsing reactiemengsel minder dan 5 nM per splitsingreactie. Splitsing efficiëntie kan afnemen als de RNA-concentratie verhoogd significant boven 5 nM.

4. 3 'mRNA splitsingreactie

1. Splitsingsreactie Bereiding van het reagens
   1. Bereid alle reagentia die nodig zijn voor de splitsingreactie. Maak 10% polyvinyl alcohol (PVA) door kokend water en voeg langzaam de juiste hoeveelheid PVA-poeder. 10% PVA zal stroperig zijn en heeft tijd nodig om op te lossen. Bewaren bij kamertemperatuur of -20 ° C.
   2. Bereid 1 M creatine fosfaat (CP) en bewaar bij -80 ° C. Het is belangrijk om 1 M CP die minder dan 4 maanden oud gebruikt.
   3. Bereid 1 M DTT en winkelbij -20 ° C. Maak een frisse 0,2 M DTT verdunning van de 1 M DTT enkel voorafgaand aan het doen van de splitsingsreactie.
   4. Bereid ETS (splitsing stop oplossing): 10 mM Tris pH 7,8, 10 mM EDTA, 0,5% SDS. Bewaren bij kamertemperatuur.
2. Splitsing Reactie
   1. Verwarm het gelabelde RNA 80 ° C gedurende 2 minuten plaats dan op ijs.
   2. Voorzichtig vortex en dan draaien de 10% PVA op topsnelheid voor 2-3 min om luchtbellen te verwijderen.
   3. Master mix 1: Voor een enkele reactie, combineren 3,125 gl 10% PVA, 0.625 gl 1 M CP, 0,25 pl 0,5 M tRNA, 0,125 pi 100 mM dATP, 0,13 ul 40 U / ul RNase-remmer, 0,25 pl 0,1 M EDTA pH 8 , 0.1 pi 0,2 M DTT, en 0.645 pi RNase vrij water. Verdeel 5,25 pi master mix 1 per buis op ijs.
   4. Master Mix 2: Gebruik 6.25 gl / reactie van nucleaire extracten bij hogere concentraties dan 2 mg / ml. Kernextracten kan worden verdund met Buffer D ₅₀ als neeDED.
   5. Combineer de 6,25 ul van nucleair extract met de eerder afgegeven 5,25 gl master mix 1. Voeg 1 pl gelabelde RNA-substraat dat is verdund tot 50 nM. Alternatief kan het RNA worden opgenomen in de master mix 1 mits wordt toegevoegd na de RNase inhibitor, DTT en tRNA OPMERKING:. Met <5 nM van het gelabelde RNA-substraat.
   6. Zachtjes Vortex en snelle draai elk monster om luchtbellen te verwijderen. Incubeer bij 30 ° C gedurende maximaal 2 uur, maar een tijdsverloop moet voor een optimaal resultaat worden uitgevoerd. Langere incubaties misschien achtergrond degradatie verhogen.
3. Proteinase K Digestion en zuivering
   1. Verwijder de monsters van het vuur en voeg 182,5 ul van ETS-stop oplossing voor elke reactie. Voeg 5 ui 20 mg / ml proteinase K en incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
   2. Extraheer het RNA door 1 volume (200 pl) zuur fenol-chloroform, 1/10 ^ste volume (20 pl) van 3 M natriumacetaat en 1 pi 20 mg / ml glycogeen. Ga verder met extracties zoals beschreven in secties 3.4.9-3.4.14.
   3. Zodra de RNA-extractie is voltooid, moet u alle resterende EtOH te verwijderen. Resuspendeer de pellet in 8 pl laadbuffer (90% formamide, 10 mM EDTA, met broomfenolblauw (BFB) (en of xyleencyanol blauw)). De monsters kunnen bij -80 ° C worden opgeslagen of doorgaan met gelelektroforese.
4. Splitsingsreactie Electroforese
   1. Bereid een 6% acrylamide gel zoals eerder in secties 3.3.1-3.3.17 met enkele wijzigingen vermeld. Gebruik 20 cm x 42 cm sequencing gel platen met 2 bindmiddel clips aan elke lange zijde. Gebruik een 32-well kam en bereiden 40 ml van de gel mix.
   2. Plaats de gel met 3 ui merker en 5 ul van elk monster. Optimaliseer de elektroforese instellingen volgens pre-splitsing en gekloofd Product maten.
   3. Wanneer elektroforese is voltooid, volgt u secties 3.4.1-3.4.3 </ Strong> om de gel te demonteren. In plaats van kunststof folie, snijd een stukje filtreerpapier om de grootte van de gelplaat voorzichtig plaatsen op een kant van de blootgestelde gel.
   4. Druk op de filter papier stevig op de gel, dan flip over de plaat, zodat het filter papier op de bodem en het glas is op de top. Druk stevig op het glas op de tafel om ervoor te zorgen dat de gel is aangrijpend het filterpapier gelijkmatig.
   5. Langzaam schil de filtreerpapier, waarbij de gel verbonden moet hebben, een van de korte uiteinden totdat alle filtreerpapier met gel bevestigd wordt uit de glasplaat.
   6. Bedek de blootgestelde gel kant met plastic wrap. Tape de plastic verpakking om het filter papier.
   7. Plaats de gel op een gel droger met de filter kant naar de zuigzijde. Droog gedurende 15 minuten of totdat de gel volledig droog is.
      OPMERKING: als een gel droger niet beschikbaar is, kan röntgenfilm worden gebruikt om het RNA-banden zichtbaar. Blootstelling moet op een ligh worden uitgevoerdt-strakke cassette met intensivering scherm bij -80 ° C. Belichtingstijd wordt empirisch bepaald. Let op: lage procent acrylamidegelen kan barsten na bevriezing.
   8. De gel kan nu gebruikt worden om belichten of wordt gebruikt met een fosfo-imager. Belichtingstijd afhankelijk van de sterkte van het gelabelde RNA. Aanvankelijk een 24 uur blootstelling kan worden gebruikt. Bij gebruik film, ondergaan bij -80 ° C met een verscherpte scherm en laat opwarmen tot kamertemperatuur vóór ontwikkeling.
   9. Meet de verhouding tussen gesplitste en niet-gesplitste RNA in elk monster splitsing efficiëntie kwantificeren.

Results

Representatieve resultaten van een assay splitsing van de RNA-poly (A) gebieden van HIV-1 (Figuur 2). We kunnen geknipte RNA-substraat, wat de langzaamste migrerende bij de bovenkant van de gel te observeren. De specifieke gesplitste product de meest intense korter fragment band die sneller in de gel bij de verwachte grootte loopt, en is met name afwezig in de klievingsbepaling van de mutpoly (A) controle dat een punt mutatie in het polyA sequentie (mutPolyA) RNA bevat substraat. Afbraakproducten van de...

Discussion

De in vitro pre-mRNA 3 'splitsingsreactie, in HeLa cel kernextracten of met splijting factoren gefractioneerd van deze extracten uitgevoerd, is de identificatie van de kern splitsing factoren en hun belangrijkste complexen ^16-21 ingeschakeld. Veel meer proteïnen verbonden aan deze factoren zijn nu geïdentificeerd ^22, en de in vitro reactie kan verder licht werpen op hoe deze eiwitten teneinde de reactietijd. Misschien omdat de reactie in vivo lijkt cotranscriptional <...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Celstir flask	Wheaton	356884	Verschillende maten beschikbaar
4 position slow speed stirrer	VWR	12621-076
Swinging bucket centrifuge	Beckman Coulter		Allegra x-15R met SX4500 Rotor
Ultracentrifuge	Beckman Coulter		Optima L-100 XP Ultra met SW41 Rotor
Table top centrifuge 5417R	Eppendorf		Gekoeld
Thermomixer incubator	Eppendorf
250 ml conische buizen	Corning	430776
50 ml conische buizen	BD Falcon	352098
Ultraclear centrifuge buizen	Beckman Coulter	344059
JOKLIK gemodificeerd MEM	Lonza	04-719Q
Fetaal bovien serum	Atlas	F-0500-A	Warme geïnactiveerd
L-glut:pen:strep	Gemini Bio-Products	400-110
1 M Tris-HCl pH 8.0	Mediatech	46-031-CM
Magnesiumchloride	Fisher	BP214-500
Kaliumchloride	MP Biomedicals	194844
HEPES	Fisher	BP310-500
DTT	Alexis Biomedicals	280-001-G-010
Glycerol	Fisher	BP229-4
5 M natriumchloride oplossing	Mediatech	46-032-CV
EDTA 0.5 M oplossing	Sigma-Aldrich	E7889-100ml
EDTA	Fisher	BP120-500
PMSF	Thermo Scientific	36978
Ammoniumsulfaat	Fisher	A702-500
Complete EDTA-vrije protease inhibitor cocktail tabletten	Roche	04 693 132 001
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit	Thermo Scientific	66372	MWCO 7.000 0,5 ml-3 ml
15 ml Dounce weefsel grinder set	Sigma-Aldrich	D9938-1SET	Verschillende maten beschikbaar
Expand high fidelity PCR kit	Roche	11 732 650 001
10 mM dNTP Mix	Invitrogen	Y02256	10 mM elk nucleotide
MaxiScript SP6/T7 kit	Ambion	AM1322
m7G(5')ppp(5') G RNA cap	New England Biolabs	S1404S
Century Marker Template Plus	Ambion	AM7782
Easytides UTP [α-32P] 250 μCi	Perkin Elmer	BLU507H250UC
Gel loading buffer II	Ambion	8546G
DEPC behandeld water	Ambion	AM9906
10x TAE	Fisher	BP13354
10x TBE	Ameresco Life Sciences	0658-4L
10x PBS	Fisher	BP399-20
Urea	Fisher	BP169-212
Ammoniumpersulfaat	Bio-Rad	161-0700
TEMED	Fisher	BP150-20
Ammoniumacetaat	Fisher	A637-500
40% 19:1 acrylamide:bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0144
Glycogen	Roche	10 901 393 001
100% absoluut ethanol 200 proof	Acros	61509-0040
Zuur fenol:chloroform	Ambion	9720	Voor RNA
Scintillatie vloeistof	Fisher	SX18-4
Rnase inhibitor	Promega	N261B
Polyvinyl alcohol- PVA	Sigma-Aldrich	P8136-250G
Creatinefosfaat	Calbiochem	2380
100 mM dATP	Fisher	BP2560-4
SDS	Acros	23042-5000
Proteinase K	Fisher	BP1700-100
Instelbare sequencing unit	Sigma-Aldrich	Z351881-1EA
Binder clips	Office Depot	838-056
20 cm x 42 cm glazen platen	Sigma-Aldrich	Z352543	1 SET
20 cm x 22 cm glazen platen	Sigma-Aldrich	Z35252-7	1 SET
20 cm x 42 cm aluminium koelplaten	Sigma-Aldrich	Z352667	1 EA
0.4 mm x 22 cm ruimtemakers	Sigma-Aldrich	Z35230-6	1 SET
0.4 mm x 42 cm ruimtemakers	Sigma-Aldrich	Z352314-1	1 SET
8-wels kam	Sigma-Aldrich	Z35195-4	1 EA
16-wels kam	Sigma-Aldrich	Z351962	1 EA
32-wels kam	Sigma-Aldrich	Z351970	1 EA
Gel repel coating	C.B.S. Scientific	SGR-0401	of SGR-0101 voor individuele fles
Gel loading tips	Rainin	GT-10-4	0,1-10 μl
Sequencing PowerPac HV	Bio-Rad	PowerPac HV	5.000 V/500 mA/400 W
Gel Dryer Model 583	Bio-Rad	Model 583
Hydrotech vacuümpomp voor gel dryer	Bio-Rad
Glogos II Glow-in-the-dark markers	Agilent	420201
Film 8 x 10	Midsci	BX810
Film 14 x 17	Phenix	F-BX1417
Autoradiografie cassette	Fisher	FBCA