We geven een gedetailleerd protocol voor inductie van lange termijn potentiëring van de CA1 regio van de hippocampus en de daaropvolgende isolatie van nucleaire verrijkte fracties uit de tetanized gebied van het segment. Deze benadering kan worden gebruikt om activiteit te bepalen afhankelijk kerneiwit invoer cellulaire modellen van leren en geheugen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van CA1 Nuclear verrijkte fracties van hippocampus Slices om te studeren activiteit-afhankelijke nucleaire import van Synapto-nucleaire Messenger Eiwitten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bestuderen activiteit afhankelijke eiwitexpressie subcellulaire translocatie of fosforylering essentieel om de onderliggende cellulaire mechanismen van synaptische plasticiteit begrijpen. Lange termijn potentiëring (LTP) en lange termijn depressie (LTD) geïnduceerde acute hippocampale plakken worden algemeen aanvaard als cellulaire modellen van leren en geheugen. Er zijn tal van studies die live cell imaging of immunohistochemie benaderingen gebruiken om de activiteit afhankelijk eiwit dynamiek te visualiseren. Echter deze werkwijzen afhankelijk van de geschiktheid van antilichamen voor immunocytochemie of overexpressie van fluorescentie-gemerkte eiwitten in enkele neuronen. Immunoblotting van eiwitten is een alternatieve methode voor het verstrekken van onafhankelijke bevestiging van de bevindingen. De eerste bepalende factor voor de bereiding van subcellulaire fracties individueel tetanized hippocampale plakken is de lage hoeveelheid materiaal. Ten tweede, de behandeling procedure is cruciaal omdat zelfs zeer korte en kleine manipulaties living plakjes zou activering van bepaalde signaleringscascades induceren. Hier beschrijven we een optimale workflow om voldoende hoeveelheid nucleaire verrijkte fractie van voldoende zuiverheid te verkrijgen van de CA1 regio acute hippocampale plakjes van rattenhersenen. Als een representatief voorbeeld wordt aangetoond dat de ERK1 / 2 gefosforyleerde vorm van het synapto-kerneiwit messenger Jacob actief naar de kern na inductie van LTP en kan worden gedetecteerd in nucleaire verrijkte fractie uit CA1 neuronen.
Inleiding
Synaptic N-methyl-D-aspartaat-receptoren (NMDARs) spelen een cruciale rol in synaptische plasticiteit en celoverleving signaleren dat activatie van extrasynaptic NMDARs kan leiden neurodegeneratie en celsterfte. Deze veranderingen hangen af van streng gecontroleerde / gereglementeerde activiteit afhankelijke genexpressie en dus vereisen constante communicatie tussen geactiveerde synapsen of dendrieten en de kern 7. De MAP kinases ERK1 / 2 zijn effectoren van synaptische NMDARs signalering en zijn betrokken bij NMDAR-activatie-geïnduceerde genexpressie, dat signalering via extrasynaptic NMDAR geen of een remmend effect op de ERK1 / 2 activiteit 8,11.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1 Voorbereiding van de Acute hippocampus Slices van volwassen hersenen van de rat
- Verdoven van ratten met isofluraan. LET OP: Voer de procedure met behulp van een gesloten exicator, niet inhaleren isofluraan. Zorg ervoor dat het dier volledig verdoofd.
- Onthoofden de rat, isoleert de hersenen, en dompel in gecarboniseerd (95% O 2/5% CO2 gasmengsel) ijskoude Gey-oplossing (samenstelling in mM: 130 NaCl, 4,9 KCI, 1,5 CaCl2 · 2H 2 O 0,3 MgSO4 · 2H 2 O, 11 MgCl2 · 6H 2 O, 0.23 KH 2PO 4, 0,8 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O, 5 Glucose · H2O,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We hebben eerder aangetoond dat de synapto-kerneiwit messenger Jacob accumuleert in de kern na de inductie van LTP maar niet LTD 1. Bovendien translocatie van Jacob na synaptische stimulatie vereist activatie van MAPK ERK1 / 2 en fosforylering van Jacob op Ser180 (figuur 1). Gefosforyleerd Jacob naar de kern in een importin-afhankelijke wijze en de gefosforyleerde toestand kan worden bewaard gedurende langere tijd door associatie met de intermediaire filament αinternexin 15
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De stappen in het hierboven beschreven protocol een leidraad hoe voor te bereiden hippocampus acute gesneden uit jonge of volwassen ratten, opwekken en opnemen LTP, snel ontleden gestimuleerde gebied van slice, en voor te bereiden nucleaire verrijkte fractie voor activiteit afhankelijk eiwit dynamiek te bestuderen. Deze benadering is afgeleid van een combinatie van verschillende methoden onafhankelijk van elkaar gebruikt. We geoptimaliseerde workflow en bieden voldoende gedetailleerd voor de beginner om het opzetten van.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door de DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP-subsidie (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Centrum voor Gedragsneurowetenschappen (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK en SB), MM is een ontvanger van European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) en Marie-Curie IEF.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Apparatuur | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Stereomicroscoop | Leica S4E, Duitsland | ||
| Vibrotome | Leica VT1000S, Duitsland | ||
| Geïsoleerde pulsstimulator | A-M Systems, USA | Model 2100 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | ||
| SDS-PAGE systeem | Biorad | ||
| Koeler | Julabo | ||
| Heldere veldmicroscoop | Nikon Eclipse TS100 | ||
| Cellencultuur incubator | Thermo Electron Corporation | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Duitsland | ||
| Blottingkamer en elektrische voeding | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA | ||
| Gedompelde opnamekamer | op maat gemaakt | ||
| U-vormige en gedompelde incubator | op maat gemaakt | ||
| Kleine chirurgische schaar | |||
| Scalpel | |||
| Dunne spatel | |||
| Kunststof Pasteur pipet | |||
| Kunststof kweekschaaltje | |||
| Bunsen beker | |||
| Spuit | |||
| Reagentia | |||
| NaCl | Roth | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a., ACS, ISO |
| KCl | Roth | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a., ACS, ISO |
| CaCl2·2H2O | Merck | 1.02382.0500 | pro analysis |
| MgSO4·2H2O | Merck | 5886.05 | pro analysis |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for molecular biology |
| KH2PO4 | Merck | 12034.025 | for molecular biology |
| Na2HPO4·2H2O | Merck | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | Roth | Art.-Nr.6887.1 | for molecular biology |
| HEPES | Roth | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.1000 | pro analysis |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | ||
| Phosphostop | Roche | ||
| Bicuculline | Tocris Bioscience | ||
| Isoflurane | Baxter | ||
| Antilichamen | |||
| Primaire antilichamen | Bedrijf | Catalogusnummer | Soort |
| pJac-s180 | Biogenes | konijn (verdund 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | muis (verdund 1:1.000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | konijn (verdund 1:1.000) |
| Beta-actine | Sigma | A-5441 | muis (verdund 1:5.000) |
| Secundaire antilichamen | Bedrijf | Catalogusnummer | Soort |
| IgG HRP geconjugeerd | DAKO | geit anti-muis (1:5.000) | |
| IgG HRP geconjugeerd | NEB | geit anti-konijn (1:5.000) |
Referenties
- Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276(2011).
- Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
