Methodenartikel

AFM-gebaseerde kaart brengen van de elastische eigenschappen van celwanden: op weefsel-, cellulair en Subcellulaire Resoluties

DOI:

10.3791/51317

⸱

24 juli 2014

1Laboratoire Matière et Systèmes Complexes, UFR de Physique, Université Paris Diderot, 2Institut Jean-Pierre Bourgin, UMR1318 INRA-AgroParisTech, INRA Centre de Versailles-Grignon

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een methode om mechanische eigenschappen van plantenweefsels in kaart te brengen met behulp van een atoomkrachtmicroscoop (AFM). We richten ons op hoe mechanische veranderingen die plaatsvinden in celwanden tijdens plantontwikkeling op brede-veld mesoschaal kunnen worden geregistreerd, waardoor deze veranderingen kunnen worden gecorreleerd met groei en morfogenese.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een recent ontwikkelde methode om de mechanische eigenschappen van de oppervlakken van plantenweefsels meten met behulp van atomic force microscopie (AFM) micro / nano-indrukkingen, een JPK AFM. Specifiek, in dit protocol meten we de schijnbare elasticiteitsmodulus van celwanden op subcellulaire resoluties in regio tot 100 urn x 100 urn in floral meristemen, hypocotylen en wortels. Dit vereist een zorgvuldige voorbereiding van het monster, de juiste keuze van micro-indringlichamen en inspringen diepten. Ter compensatie celwand eigenschappen alleen worden metingen uitgevoerd in sterk geconcentreerde oplossingen van mannitol teneinde de cellen plasmolyze en aldus verwijder de bijdrage van cel turgor.

In tegenstelling tot andere bestaande technieken door verschillende indringlichamen en inspringing diepte, deze werkwijze maakt gelijktijdige meerschalige metingen Echter, een aantal beperkingen blijven: de methode kan alleen gebruikt worden op relatief kleine monsters (ongeveer 100 urn in diameter) en slechts externe weefsels; de methode is gevoelig weefsel topografie; het meet slechts bepaalde aspecten van complexe mechanische eigenschappen van het weefsel. De techniek wordt snel ontwikkeld en het is waarschijnlijk dat de meeste van deze beperkingen in de nabije toekomst zal worden opgelost.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De groei van planten wordt bereikt door gecoördineerde expansie van de starre celwanden dat elke cel van het organisme omringen. Accumuleren bewijsmateriaal wijst erop dat het door de wijziging van de celwand chemie die planten lokaal te bedienen deze uitbreiding. De uitbreiding wordt verondersteld primair gedreven door druk op de celwanden, veroorzaakt door hoge turgor van de cel; deze stam reactie op turgor wordt beheerst door de mechanische eigenschappen van de celwanden 1. Er is weinig bekend van deze mechanische eigenschappen en hoe ze veranderen tijdens de ontwikkeling. Verder weinig bekend over hoe deze mechanische eigenschappen worden gecontroleerd en of feedbacks bijdragen tot celwand chemie veranderen op een wijze die blijkbaar gecoördineerd tussen een tissue. Als we het verband tussen chemische en mechanische veranderingen in de celwanden van planten tijdens de ontwikkeling, en uiteindelijk hoe deze microscopische interacties regeren een plant te begrijpen'S macroscopische groei, een werkwijze die de mechanische eigenschappen van de celwand in ontwikkelende organen in de cellen of weefsels schaal kan controleren vereist.

Werkwijze atomaire kracht microscopie (AFM) beschreven, die gebaseerd is op micrometer of nanometer weefsel compressie of inkepingen, werd berekend dat de mechanische eigenschappen van de celwand in ontwikkelende organen gelijktijdig op subcellulaire resoluties en over de gehele regio weefsel meten. Andere methoden hebben een resolutie die is te laag of te hoog: de extensometer is alleen in staat om de gemiddelde mechanische eigenschappen van een hele weefsel meten op de millimeter schaal 2-4, een schaal die is bijvoorbeeld te groot om vroege gebeurtenissen in meten organogenese; de microindenter kunnen verrichten van metingen bij subcellulaire resolutie op de nanometer schaal, maar het is beperkt tot het meten van geïsoleerde cellen en geen groepen van cellen of organen 5-7. Bij de AFM, de eisend weefsel, cellulair en subcellulaire resoluties kan worden bereikt 8-10. Onlangs hebben verschillende protocollen zijn speciaal ontwikkeld voor de monteurs planten weefsel dat ook kan worden gebruikt 11, 12 gemeten.

We zullen hier voor te stellen hoe de elasticiteit van het weefsel te evalueren door meting van de schijnbare Young's modulus 13.

De Young modulus wordt vaak gebruikt om de stijfheid van een materiaal beschrijft. Tijdens kleine vervorming de vereiste kracht vervormen materiaal is evenredig met de oppervlakte van inkeping. De Young modulus is deze coëfficiënt. Bij een continu homogeen materiaal dezelfde coëfficiënt ongeacht de verdieping soort (grootte en vorm) worden gemeten, maar verandert met de snelheid van de meting. Voor de complexe structuur van planten weefsel, hebben we tot nu toe dat de kracht evenredig is met de vervorming waardoor de bepaling van de waargenomeneen coëfficiënt van evenredigheid dat we de naam "schijnbare jonge modulus". In contrast met continue media in de planten, deze schijnbare modulus jonge gevoelig is voor de grootte van de indrukking. Het komt niet overeen met de jonge moduli van een zuivere celwand. Het beschrijft het beste de elasticiteit van de steigers van de cel-wand van het weefsel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereid glazen dia's voor montage Sample

  1. Bereid inbedding agarose media: 0,7% laag smeltpunt agarose in 10% mannitol (in water).
  2. Met behulp van een sterke metalen instrument (bijv. boorpunt, kalk), etsen uit een 0,5 x 0,5 cm in het centrum van een microscopie glasplaatje. Of in plaats daarvan, lijm een ​​klein stukje glas lamellen (ongeveer 20 x 200 micrometer) om het glaasje met behulp Araldite lijm. Opmerking: Deze ruwer het oppervlak, om de hechting van de agarose vergemakkelijken zodat de agarose mediasticks of verbeteringen aan de dia. Deze schuif kan worden hergebruikt.
  3. Plaats een druppel van ongeveer 20 pl inbedding agarose media op het geëtste gebied van het glaasje. Dit geeft een dunne film van agarose.
  4. Bewaar de glasplaatje in een vochtige doos en wacht tot de agarose media te stollen.

2. Ontledend en montage Meristem Samples

  1. Microdissect meristemen voor confocale verbeeldingng: een voor een verwijderen van de bloemen knoppen van de steel door ze naar beneden te trekken met ultra fijne pincet. Het is belangrijk om alle bloemknoppen verwijderen tot de knoppen die niet kelkbladen vertonen (de P1 primordia 14).
  2. Met behulp van een scheermesje of de punt van de pincet, snijd het meristeem weg van de steel. De snede parallel met het gebied van het meristeem oppervlak wordt gemeten met de AFM. De verkregen apex moet tussen 300 micrometer en 600 micrometer hoog te passen onder de AFM tip.
  3. Duw de apex in de film van agarose media voorbereid op stap 1.1.4. Kies een positie op het glaasje / agarose en duw zodat de meristeem is zowel rechtstreeks in contact met het glaasje en steekt uit de agarose. Het is cruciaal om het meristeem in de agarose te positioneren binnen de paar seconden die zijn gesneden uit de stam te volgen. Opmerking: Dit is om te voorkomen dat het meristeem uitdroogt. In dit stadium zal de meristeem staan ​​in een crack omdat de agarose gebroken bij de toepassing van druk.
  4. Bereid verschillende meristemen deze manier batch imaging, mits ze dezelfde hoogte en zijn gepositioneerd op minder dan 500 urn van elkaar op de dia. Houd de bereide meristemen in de vochtige doos terwijl het ontleden extra monsters.
    OPMERKING: Het beperkt de variatie uit de kalibratie. Idealiter 2 monsters van elke aandoening kan worden voorbereid en willekeurig gemeten. Tot dusver is er geen effect waargenomen van batch imaging op de meting (stress-geïnduceerde respons). Dit kan door de verdunning van stress signaalmoleculen in de agar en / of de bevestigingsoplossing. Ook de stress respons is hetzelfde ongeacht de hoeveelheid monster bereid.
  5. Voordat we naar de volgende stap, zorg ervoor dat de grens tussen het meristeem en de bloemknoppen droog is. Zo niet, verwijder voorzichtig het overtollige water met behulp van filtreerpapier. Dit zou voorkomen in het volgende stadium dat de gesmoltenagarose overstromingen de steekproef als gevolg van capillaire krachten.
  6. Met een 20 ul pipet, voeg genoeg gesmolten montage agarose in de scheur gemaakt in stap 1.2.3 in te vullen. en elke meristeem omringen. De agarose moet het niveau van het litteken van de verwijderde bloemknop (primordium) te bereiken. Hiertoe kan het nodig zijn om agarose voegen aan elk uiteinde van de scheur.
  7. Wanneer de agarose wordt toegevoegd, zal het snel overstromen in de scheur; met de pipet, zuigen een deel van de gesmolten agarose bevestiging dat de meristeem is het hoogste punt van de dia. Dit lost het meristeem, zodat het niet kan bewegen tijdens de beeldvorming.

3. Montage Root of Hypocotyl Samples

  1. Voor wortels en hypocotylen geen dissectie nodig. In de dunne film van agarose op de voorbereide glasplaatje, maak een groef ofwel direct op een ets in het glas of over een glazen lamel. Plaats de root of hypocotyl in deze gleuf zorgen dat het in contact met deglas langs zijn gehele lengte.
  2. Voordat we naar de volgende stap, zorg ervoor dat het monster droog is aan het oppervlak. Zo niet, verwijder voorzichtig het overtollige water met behulp van filtreerpapier.
  3. Gesmolten Voeg montage agarose rond het monster, zoals in stap 1.2.6.

4. AFM Voorbereiding en Gevoeligheid Kalibratie (voor een JPK Nanowizard AFM)

  1. Monteer een cantilever op de AFM. De cantilever moet met ronde indeuker worden gemonteerd. De straal zal de x, y, z resolutie en de insprong diepte waarop nauwkeurige metingen kunnen worden gearchiveerd bepalen.
    1. Om meso-nanoschaal metingen bij het oppervlak van de epidermis is, gebruik dan een 50 nm straal ronde indenter; naar mesoschaal metingen, gebruik dan een 0,5 pm straal ronde indenter; tot microschaal metingen (over 2-3 cellen), gebruik dan een 2,5 micrometer straal rond indenter.
  2. Plaats de laser op het uiteinde van de cantilever. Lijn de laser naar het middenvan de captor met behulp van de spiegel.
  3. Plaats een schoon glas onder de AFM.
    OPMERKING: de volgende is ingesteld op het signaal van de laser positie op de AFM receptor vormen tot een vervorming van de cantilever en door het evalueren van de veerconstante van de cantilever te vertalen in een kracht.
  4. Aanpak met een doel kracht "setpoint" van 1 V.
  5. Selecteer "force spectroscopy". Doe een inkeping door het instellen van de maximale "relatieve setpoint" tot 2 V, het "uit te breiden snelheid" tot 40 micrometer / sec, en de "z lengte" tot 5 micrometer.
  6. In het menu "kalibratie manager", selecteer het lineaire gedeelte van de forward curve om de gevoeligheid met behulp van de "select fit range" knop past. De "relatieve setpoint" moet worden getransformeerd van "volt" naar "meter".
  7. In het menu "kalibratie manager", selecteer "veerconstante" het evalueren van de elasticity van de cantilever met thermische fluctuaties. Druk op "run" op de spectrale dichtheid plot van de cantilever te verkrijgen. Vind de resonantie piek met de laagste frequentie. Monteer met behulp van de "select fit range"-knop.
    Opmerking 1: Voor meer informatie over de thermische fluctuaties tuning, lees Cook et al. 15.
    OPMERKING 2: Het verdient de voorkeur een directe methode om de elasticiteit van de cantilever evalueren middels een verwijzing cantilever (of materiaal met bekende stijfheid). Degene die hier gebruikt werd gedoneerd door Atef Asnacios 16.
  8. Voeg 200 ul van 10% mannitol oplossing onder de cantilever tip. Lijn de laser naar het midden van de ontvoerder met behulp van de spiegel.
  9. Opnieuw te kalibreren de gevoeligheid: in het menu "kalibratie manager", klik op de "onbekende" knop; Herhaal de stappen 2.3 tot en met 2.5.

. 5 Data Acquisition: Schijnbare Young's modulus Cartografie

  1. Plaats de gemonteerde monsters onder de AFM en voeg een 500 pl druppelgrootte van 10% mannitol oplossing op het monster. De mannitol oplossing plasmolyzes de cellen binnen enkele minuten.
  2. Aanpak met een doel kracht ("set point") van 20 nN ("set point" mag niet meer dan 3 V niet)
  3. Streepje met een "relatieve set point" van 200 nn, een "uit te breiden snelheid" van 40 micrometer / sec, en "z lengte" van 5 micrometer.
  4. Pas de "relatieve setpoint" om een ​​inkeping van 100 nm te verkrijgen voor de 200 nm cantilever of 0,5 micrometer voor de 1 um / 5 micrometer gemonteerd cantilever gemonteerd.
  5. In "force mapping"-modus, selecteer een regio om te scannen: voor meristemen, 70 micrometer x 70 micrometer met een resolutie ("pixels") van 64 x 64; voor hypocotylen en wortels, 100 urn x 100 urn met een resolutie van 64 x 64.
  6. Druk op SCAN om de experimenten te starten. Sla de uitgang.

. 6 Data Analysis: Schijnbare Young's modulus Berekeningen

  1. Open het bestand in de data analyse software.
  2. Selecteer "batchverwerking" naar dezelfde analyse voor alle bochten van een kaart.
  3. Selecteer "corrigeren de hoogte voor de buiging van de cantilever" dus om de diepte inspringen halen.
  4. Selecteer "modulus aanpassingsfunctie Young's" die aannemen dat de kracht evenredig met de oppervlakte van inkeping. Stel de "tip shape" te parabolische aan te nemen dat de insprong vorm is een parabolische.
  5. Geef aan de straal van de tip.
  6. Selecteer bij voorkeur de "terugslag" curve voor de analyse omdat het minder gevoelig is dan de topografie "verlengen" curve. Indien er aanzienlijke kleven van de sonde tijdens de "opgerold" de "verlenging" curve, dat ongevoelig voor plakken.
  7. Reeksde Poisson-ratio tot 0,5. Druk op analyseren en sla de uitgang.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In Figuur 1 presenteren we typische Young moduli kaarten van bloemen meristemen (figuren 1A en 1B), jong en oud hypocotylen (figuren 1C-F), en wortelmeristeem (figuur 1G en 1H). In alle experimenten de indenter is halfrond, maar zijn straal verschilt zodat verschillende ruimtelijke resoluties kan worden bereikt Figuren 1C en 1D tonen typische resultaten voor meso-nanoschaal indringlicha...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In planten, het veranderen van de mechanische eigenschappen een belangrijke rol spelen in het sturen van de groei en morfogenese. Tot op heden is er grote vooruitgang geboekt in het ontrafelen van de genetische en chemische netwerken die de groei van planten onder controle is geweest, maar onze kennis van hoe deze netwerken dragen bij aan en worden beïnvloed door veranderingen in de mechanische eigenschappen is rudimentair. Deze methode moet ons in staat stellen om deze leemte op te vullen, en dus is het van groot belan...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij geven speciale dank aan Yves Couder voor vele nuttige discussies. Wij danken Atef Asnacios voor de kalibratie van de uitkragingen en discussie. Wij danken Lisa Willis, Elliot Meyerowitz, en Oliver Hamant voor kritisch lezen. Dit werk werd deels gefinancierd door Human Frontier Science Program subsidie ​​RGP0062/2005-C; de Agence Nationale de la Recherche projecten'' Growpec,'' en'' Mechastem''.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AFMJPKNanoWizardAlle 3-generaties zijn in staat om hetzelfde werk te doen met dezelfde preferment.
AFM stageJPKCellHesionVereist voor monsters met een lage topografie (minder dan 11 µm tussen het laagste en het hoogste punt in het gebied van krachtscanning).
AFM-opticsJPKTop View OpticsZeer belangrijk om de positie van het monster te bepalen. Kan worden vervangen door langeafstandsverrekijkers of een microscoop.
StereomicroscoopLeicaM125Elk type stereomicroscoop zou het kunnen doen.
150 nm gemonteerde cantileverNanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, ZwitserlandR150-NCL-10Te gebruiken om alleen de celwand op het oppervlak van de opperhuid te meten.
1 µm gemonteerde cantileverNanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, ZwitserlandSD-Sphere-NCH-S-10Te gebruiken voor het meten van de mechanica van de celwand loodrecht op het oppervlak van de opperhuid.
Tiploze cantileverNanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, ZwitserlandTL-NCH-20Gebruik een 5 µm gemonteerde cantilever om de lokale mechanica van het weefsel te meten (2-3 cellen breed). We hebben een 5 µm borosilicaatkraal aan een tiploze cantilever bevestigd.
5 µm silicium microsferenCorpuscularC-SIO-5
AralditeBartik S.A. 77170 Coubet, FrankrijkAraldite voor het bevestigen van de kraal aan de tiploze cantilever.
Agar-agar met lage smelttemperatuurFisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410BP160-10034-45 °C geleerde temperatuur
D-MannitolSigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USAM4125-500G
2 Roestvrijstalen No. 5 PincettenIdeal-Tek 6828 Balerna, Zwitserland 951199

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cosgrove, D. J. Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls. Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).
  2. Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin. Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263(2009).
  3. Durachko, D. anielM., C, D. J. Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin. J. Vis. Exp.. , 25(2009).
  4. Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants. Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).
  5. Parre, E., Geitmann, A. Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense. Planta. 220, 582-592 (2005).
  6. Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental biology. 334, 437-446 (2009).
  7. Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).
  8. Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).
  9. Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).
  10. Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth. Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).
  11. Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).
  12. Agudelo, C. G., et al. TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).
  13. Miedes, E., et al. Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls. Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).
  14. Byrne, M. E., et al. Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis. Nature. 408, 967-971 (2000).
  15. Cook, S. M., et al. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).
  16. Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).
  17. Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited. Frontiers in plant science. 3, 121(2012).
  18. Mittler, R., et al. ROS signaling: the new wave. Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).
  19. Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. PLoS. 8, e57813(2013).
  20. Asnacios, A., Hamant, O. The mechanics behind cell polarity. Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).
  21. Meister, A., et al. FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond. Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).
  22. Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells. Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).
  23. Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth. PloS one. 6, e18549(2011).
  24. Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

atoomkrachtmicroscopieYoung moduluscelwandmechanicaanalyse van plantenweefselsubcellulaire resolutiemultischaalmetingenmannitoloplossingmonstervoorbereidingkrachtmappingdata analyse

Gerelateerde artikelen