Nanopodia - Dun, Fragile Membraan Projecties met rollen in Celmigratie en Intercellulaire Interacties

Samenvatting

Nanopodia zijn dun maar kwetsbare membraan kanalen die reiken tot 100 urn van toonaangevende voor-of naloopas van een cel en voelen de cellulaire omgeving. Direct fixatie bij 37 ° C, zacht wassen, en het vermijden van organische oplosmiddelen zoals ethanol, methanol of aceton en hogere Triton X-100 concentraties nodig zijn om de cellulaire structuren te nemen.

Samenvatting

Hechtende cellen in kweek te houden een gepolariseerde staat om beweging en intercellulaire interacties ondersteunen. Nanopodia zijn dun, langwerpig, grotendeels F-actine-negatieve membraan projecties in endotheliale en kanker cellen die kunnen worden gevisualiseerd door middel van TM4SF1 (Transmembrane-4-L-zes-familie-1) immunofluorescentiekleuring. TM4SF1 clusters 100-300 micrometer diameter TMED (TM 4SF1 e nriched micro d omains) die 3 tot maar liefst 14 individuele TM4SF1 moleculen. TMED intermitterend gerangschikt langs nanopodia op een regelmatige afstand van 1 tot 3 TMED per μ m en stevig verankeren nanopodia matrix. Hierdoor nanopodia meer dan 100 μ m loopt van de toonaangevende voor-of naloopas van gepolariseerd endotheliale of tumorcellen en veroorzaakt membraan resten achterblijven op matr worden achtergelatenix wanneer de cel zich verwijdert. TMED en nanopodia over het hoofd gezien vanwege hun extreme kwetsbaarheid en gevoeligheid voor temperatuur. Routine wassen en fixatie verstoren de structuur. Nanopodia bewaard door directe fixatie in paraformaldehyde (PFA) bij 37 ° C, gevolgd door korte blootstelling aan 0,01% Triton X-100 voor kleuring. Nanopodia nieuwe perspectieven te openen in de celbiologie: ze beloven om ons begrip van hoe cellen voelen hun omgeving vorm te geven, op te sporen en te identificeren andere cellen op een afstand, initiëren intercellulaire interacties op nauw contact, en van de signalering mechanismen die betrokken zijn bij beweging, proliferatie en cel -cel communicatie. De werkwijzen die zijn ontwikkeld voor het bestuderen TM4SF1 afgeleide nanopodia nuttig voor studies van nanopodia dat andere celtypes door tussenkomst van klassieke tetraspanins, met name het alom tot expressie CD9, CD81, en CD151 vormen.

Inleiding

Tijdens polarisatie voor beweging, dierlijke cellen uit te breiden een verscheidenheid aan dynamische, membraan uitsteeksels uit hun oppervlakken, waaronder filopodia, lamellipodia, retractie vezels, en ruches ^1. Recent toegevoegd aan deze lijst waren nanopodia, een nieuw erkende type dunne (100-300 micrometer in doorsnede), langwerpig (tot 50-100 micrometer lang) membraan projectie die membraan kanalen voor de uitbreiding van de F-actine structuren zoals filopodia bieden en terugtrekken vezels, en die vlek positief met TM4SF1 (Transmembrane-4-L-zes-familie-1) in gekweekte endotheliale cellen en tumorcellen ^2,3.

TM4SF1 is een eiwit met tetraspanine-achtige topologie die oorspronkelijk bekend was als een tumorcel antigen ⁴ vóór de ontdekking dat het molecuul een endotheelcel biomarker die een essentiële rol in endotheliale celproliferatie en migratie ^2,3 speelt. Immunofluorescentiekleuring bleek dat TM4SF1 is gelokaliseerd aan perinucLear blaasjes en het plasmamembraan en wordt verrijkt met TM 4SF1 e nriched micro d omains (TMED). TMED anker nanopodia naar matrix en aanwezig in een regelmatige afstand van elkaar gestreepte patroon van 1-3 TMED / um lengte van nanopodia. Nanopodia typisch verlengen van toonaangevende voorzijde een cel en naloopas tijdens cel polarisatie voor beweging. Vanwege de stevige hechtende aard van TMED, nanopodia zijn niet in staat om terug te trekken in de cel als het beweegt weg; verlaten nanopodia residuen dus sporen uit het pad van de cellulaire beweging. Nanopodia bieden membraan kanalen voor F-actine en uitschuiven, en zijn sites van intercellulaire interacties en communicatie ^2,3. Deze kenmerken betekenen dat nanopodia een unieke gelegenheid om de onderliggende mechanismen van F-actine assemblage tijdens cellulaire polarisatie, cellulaire sensing van het milieu, de bepaling van het pad en de richting van de cel beweging, en intercellulaire interacties te bestuderen bieden eennd communicatie.

Wegens het zeer hydrofobe karakter van TMED en de dunne en fragiele membraneuze aard van nanopodia, speciale zorg moet worden genomen om TMED en nanopodia behouden. De vernietiging van nanopodia en verwijdering van TMED door gemeenschappelijke laboratoriumtechnieken is een mogelijke reden waarom slechts drieënzestig publicaties zijn verschenen op TM4SF1 sinds de eerste ontdekking in 1986 ¹ en voor het volledige gebrek aan kennis van TM4SF1 verrijking in 100-300 urn microdomeinen op het celoppervlak tot het verslag van TM4SF1 in endotheelcellen in 2009 ^2.

Conventionele methoden immunokleuring algemeen organische oplosmiddelen zoals ethanol, methanol of aceton om cellen te repareren en te gebruiken 0,1% of hoger Triton X-100 concentratie cellen permeabilize ^5. Studies beschreven uitgevoerd drie grote veranderingen in de conventionele werkwijze te openbaren TMED en nanopodia: (i) 37 ° C 4% PFA en zet cellen in een 3776, C incubator, (ii) zachtjes kamertemperatuur PBS wassen, en (iii) minder dan 0,03% Triton X-100 slechts kort cellen permeabilize vóór toevoeging van primair antilichaam, zoals Triton X-100 hoger dan 0,03% zullen halen TM4SF1.

Alle tetraspanins vormen microdomeinen op de celmembraan ⁶ en sommige colocalize met TMED in endotheliale cellen en tumorcellen ^2,3. Zoals tetraspanins zoals CD9, CD81 en CD151 alomtegenwoordig worden uitgedrukt, kan de kleuringsprotocol hier beschreven worden uitgebreid tot veel verschillende soorten cellen die TM4SF1 missen voor de studies van nanopodia functie.

Protocol

1. Cel Cultuur op Collageen Gecoat glas Disk

1. Plaats het glas schijven (12 mm in diameter) in een glazen pot (4 oz) en autoclaaf om de schijven te steriliseren.
2. Breng 25 ml 70% ethanol in een 50 ml Falcon buis en plaats deze in een celkweek kap. Deze oplossing kan worden hergebruikt meerdere keren totdat het niveau van de oplossing daalt tot 20 ml.
3. Plaats een scherpe tang met een extra fijne punt in de 70% ethanol gedurende 5 minuten alvorens het te gebruiken om de glazen plaat af te handelen.
4. Verwijder voorzichtig de tang uit de tube en sluit het deksel, dan plaats voorzichtig het ethanol behandeld tang op de top van de buis aan de lucht drogen gedurende 2 minuten. Sta niet toe dat de punt van de tang om iets aan te raken in de kap.
5. Gebruik de steriele tang om een ​​steriele glazen schijf halen uit de glazen pot en plaats het op een goed van de 24-well celkweek plaat. Herhaal dit tot het gewenste aantal putten is gevuld met schijven.
6. Zet 500 ul van Bovine collageen oplossing (50 ng / ml) in elk putje dat een glazen plaat bevat en plaats deze in een 37 ° C, 5% CO ₂ celkweek incubator gedurende ten minste 30 minuten. Er is geen kwaad in een langere incubatietijd.
7. Harvest HUVEC (humane navelstreng endotheelcellen) of PC3 (prostaat tumorcellen) die reeds in 150 mm celkweekplaat gekweekt werden door behandeling met trypsine en blokkeren de trypsine-activiteit met behulp van de volledige kweekmedium. Verzamel cellen in een 15 ml Falcon buis.
8. Tel het aantal cellen en zorg ervoor dat de leefbaarheid groter is dan 90%.
9. Pellet de cellen door centrifugeren bij 200 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
10. Gebruik het kweekmedium om de cellen te verdunnen tot 10 ⁵ cellen / ml. Plaats cellen op ijs.
11. Zuig het collageen in de celkweek kap en plaats voorzichtig 500 ui celsuspensie aan elk putje waarin glazen schijven werden vooraf bekleed met collageen. 5 x 10 ⁴ cellen / putje in de 24-well plaat zal conf geven 60%luency voor HUVEC en 30% confluentie voor PC3 cellen. Opmerking: voeg meer celsuspensie voor hogere celdichtheid.
12. Kweek van de cellen in een 37 ° C, 5% _CO2 incubator gedurende 1 uur, 2 uur, 4 uur, 6 uur, of 24 uur tot nanopodia activiteiten en celpassage volgen. Meestal zal cellen hechten aan de glazen plaat in de eerste 30 minuten, start polariseren en migreren in het eerste uur en uitvoeren intercellulaire interacties en celdeling in het volgende voorbeeld.

2. Cel Fixatie

1. Elk goed moet 500 pi 4% PFA (paraformaldehyde) om de cellen te repareren. Hetzij commercieel vervaardigd of vers 4% PFA worden gebruikt. Bereken de hoeveelheid PFA nodig op basis van het aantal putten bereid en plaats PFA in een 15 ml Falcon buis. LET OP: paraformaldehyde is een verdacht carcinogeen.
2. Zet de falcon buis in een piepschuim stand die reeds was op zijn plaats in een 37 ° C incubator. Laat de buis in de incubator gedurende 30 minuten naar de oorlogm up de PFA tot 37 ° C.
3. Plaats een verwarmingselement in de cultuur kap en zet hem aan.
4. Neem de 24-well celkweek plaat en de voorverwarmde PFA uit de incubator en plaats deze boven op de verwarming pad.
5. Gebruik een hand om het medium te zuigen uit een put, en direct na gebruik de andere hand om schuif 500 pi PFA in de put door de goed kant. Voor gemakkelijker aspiratie, kantel de cultuur plaat op ongeveer 45 °, leunend tegen het piepschuim stand zodat het stabiel op die hoek. Dit aspiratie en het toevoegen PFA oplossing van de put zonder de cellen in kweek te bevorderen. Dit is de meest cruciale stap om de oorspronkelijke celstructuur van celactiviteiten behouden.
6. Herhaal de procedure tot alle putjes met een glazen schijf PFA hebben ontvangen. Opmerking: alle stappen die moeten reeds bestaande oplossing uit de put te veranderen zal dezelfde aspiratie procedures toe te passen.
7. Plaats de plaat op 37 ° C gedurende 5 minuten.
8. Neem de plaat terug naar de cultuur kap en kantelen tegen piepschuim zoals beschreven in stap 2.5. Gebruik een hand om voorzichtig overdracht van de PFA van het goed in een verzameling buis; Gebruik anderzijds onmiddellijk daarna plaatsen ten minste 500 pi PBS kamertemperatuur in de put. Nadat alle putjes zijn gewassen, terug en nog een keer herhalen de PBS wassen in elke goed. Leeg de verzamelde PFA in een gevaarlijk afval container.
9. Bereid ICC blokkeerbuffer door toevoeging van 2% foetaal runderserum PBS. 0,04% natriumazide (verdunning van 20% voorraadoplossing) wordt toegevoegd als conserveermiddel. LET OP: sodium azide is een giftige stof. De buffer kan op 4 ° C worden opgeslagen gedurende langere tijd zonder bacteriële contaminatie.
10. Met de cultuur plaat nog gekanteld tegen een stand, nogmaals doorlopen elk putje opzuigen naar PBS te verwijderen en onmiddellijk daarna het toevoegen van 500 pi van ICC blokkerende buffer. Cellen zijn nu klaar voor immunofluorescentiekleuring. Indien nodig, degefixeerde cellen kunnen in een 4 ° C koelkast een week worden opgeslagen zonder significant verlies van TM4SF1 eiwit.

3. TM4SF1 immunofluorescentiekleuring van Nanopodia

1. In elk putje Vervang de ICC 500 ul blokkeerbuffer een nieuwe blokkerende buffer die 0,01% Triton X-100 en laat het op kamertemperatuur gedurende 1 uur. Gebruik meer dan 0,03% Triton X-100 zoals TM4SF1 zal verwijderen uit celmembranen. PBS gewassen cellen van stap 2.10 kan direct worden verplaatst naar de blokkerende buffer bevattende Triton als de kleuring is klaar om meteen worden gestart.
2. Verdun primaire anti-TM4SF1 (of anti-CD9) antilichaam tot 0,5 ug / ml in blokkeerbuffer ICC.
3. In elk putje, verwijder de ICC/0.01% Triton buffer en te vervangen door 300 ul van de anti-TM4SF1-antilichaam oplossing. Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur of een nacht laten staan ​​bij 4 ° C.
4. Was elk putje met niet minder dan 500 pi PBS. Herhaal 3x; elke keer geven op least 5 min incubatie tijd.
5. Bereid een secundair antilichaam en phalloidin oplossing ICC blokkerende buffer, met een 1000 maal verdunning van Alexa 488 gelabelde ezel anti-muis secundair antilichaam (2 ug / ml uiteindelijke concentratie) en 1000 x verdunning van phalloidin (50 ng / ml uiteindelijke concentratie).
6. Verwijder de PBS en voeg 300 ul van het secundaire antilichaam en phalloidin oplossing in elk putje en incubeer gedurende 2 uur en laat een nacht bij 4 ° C.
7. Herhaal de stappen PBS wassen met minstens een 5 min incubatie per wasbeurt. In de laatste wasbeurt, laat elk putje in PBS gedurende 1 uur.
8. Laat een druppel (~ 10 pi) van anti-fade afdekmiddel op een glasplaatje.
9. Buig de punt van een 19 G 1 ½ in naald 90 ° door zachtjes te drukken op een harde ondergrond. Gebruik een hand om gebogen naald vast te houden en voorzichtig omhoog een glazen schijf uit de put, en met de andere hand om de schijf te begrijpen met behulp van de scherpe tang.
10. Draai het glas schijf &# 160; naar beneden laten van de cel kant contact op met de montage media op het glaasje. Plaats voorzichtig de glazen plaat en laat het een nacht drogen op een donkere plaats bij kamertemperatuur.
11. Ga verder met het imago van de immunofluorescentie gekleurd nanopodia, of de dia's in een dia doos bewaren bij -20 ° C. De slides zichtbaar voor een paar maanden in de -20 ° C blijven

Resultaten

Voor Stap 1:

Indien cellen (zoals HUVEC en PC3 in deze studie) kunnen normaal groeien, zullen de cellen hechten aan de met collageen beklede plaat binnen 30 minuten nadat ze zijn gezaaid, polariseren en word mobiele spoedig daarna en nanopodia vóór hun pad verlengen verkeer. Figuren 1A en 1B respectievelijk toont een gepolariseerde en prolifererende HUVEC. Figuur 2A toont gepolariseerde PC3 cellen in een mobiele toestand.

Discussie

Nanopodia dun celmembraan kanalen die stevig aan matrix door TMED en kan meer dan 100 urn uitstrekken vanaf een mobiel gepolariseerde cel milieu voelen en intercellulaire interacties mediëren ^2,3. Nanopodia houden zo stevig dat residuen achterblijven als de cel verwijdert zich matrix (figuren 1 en 2). Nanopodia dus kunnen we bestuderen hoe cellen voelen hun omgeving en bepalen het pad van de cel bewegen, en hoe genexpressie of behandeling met geneesmiddelen veranderingen bewe...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Glass disks	Fisher Scientific	12-545-82	12 mm diameter
Glass jar	Fisher Scientific	02-912-310	Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz
Glass slide	Fisher Scientific	12-544-1	Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides
50 ml Falcon tube	BD Falcon	352070	50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.
15 ml Falcon tube with Styrofoam rack	Corning	430790	Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes
Sharp forceps	Fisher Scientific	13-812-42	Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps
24-well Cell culture plate	BD Bioscience	353047	24-well Cell Culture Plate
150 mm Cell culture plate	BD Bioscience	353025	150 mm cell culture plate
19 G 1 ½ Syringe needle	BD Bioscience	309635	19 G 1 ½
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	2701	Decon's Pure Ethanol 200 Proof
Collagen solution	BD Bioscience	354249	Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-053-CI	0.25% Trypsin-EDTA 1x
DMEM	Life Technologies	11965-092	DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate
10x PBS	Affymetrix	75889 5 LT	PBS, 10x Solution, pH 7.4
PFA (paraformaldehyde)	Affymetrix	19943 1 LT	4% in PBS
FBS	Sigma-Aldrich	F4135-500ML	Fetal Bovine Serum
EGM2-MV	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.
Mouse anti-human TM4SF1 antibody	Millipore	MAB3127	Epitope is located in extracellular domain
Mouse anti-human CD9 antibody	BD Bioscience	555370	Epitope is located in extracellular domain
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody	Life Technologies	A-21202	Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)
Phalloidin	Chemicon	90324	Rhodamine-conjugated Phalloidin
Anti-fade mounting media	Life Technologies	P-36931	ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI
70% Ethanol			17.5 ml van ethanol (200 proof) 7.5 ml van dubbel-gedeïoniseerd water
10x PBS (maak 200 ml)			20 ml van 10x PBS 180 ml van dubbel-gedeïoniseerd water
20% Triton X-100 (maak 20 ml)			4 ml Triton X-100 16 ml dubbel-gedeïoniseerd water
4% NaN3 (maak 25 ml)			1 g van NaN3 25 ml van dubbel-gedeïoniseerd water
50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (maak 5 ml)			Stockoplossing van 50 μg/ml (50 ml) 830 μl van Collagen I (3 mg) 50 ml PBS
ICC Blocking Buffer (50 ml)			49 ml PBS 2% FBS (voeg 1 ml toe) 0.04% NaN3 (voeg 100 μl van 4% NaN3 toe)
ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (maak 50 ml)			50 ml van ICC Blocking Buffer 25 μl van 20% Triton X-100
HUVEC	Lonza	C2517A	www.lonza.com
PC3	ATCC	CRL-1435	www.atcc.org
Cell culture hood	NuAIRE	Nu-425-600	NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet
37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator	CellStar	QWJ300DABA	Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator
Heating pad	K&H Manufacturing	1020	K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com)
Centrifuge	Sorvall	T6000B	Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line Hemocytometer