Een snelle en specifieke Microplate Assay voor de bepaling van de intra-en extracellulaire ascorbaat in gekweekte cellen

Samenvatting

Ascorbaat speelt talloze belangrijke rol in cellulair metabolisme, waarvan vele alleen aan het licht in de afgelopen jaren. Hier beschrijven we een middelgrote doorvoer, specifiek en goedkoop microplate assay voor de bepaling van de intra-en extracellulaire ascorbaat in celcultuur.

Samenvatting

Vitamine C (ascorbaat) speelt talloze belangrijke rol in cellulair metabolisme, waarvan vele alleen aan het licht in de afgelopen jaren. Bijvoorbeeld, in de hersenen, ascorbaat handelt in een neuroprotectieve en neuromodulatory manier die ascorbaat fietsen tussen neuronen en astrocyten vicinaal betreft - een relatie die lijkt cruciaal voor de hersenen ascorbaat homeostase te zijn. Daarnaast opkomende er sterke aanwijzingen dat ascorbaat heeft een sterk uitgebreide rol in het reguleren van de cellulaire en systemische ijzer metabolisme dan is klassiek erkend. De toenemende erkenning van de integrale rol van ascorbaat in normale en gedereguleerde cellulaire en organismale fysiologie vereist een reeks middelgrote doorvoer en zeer gevoelige analytische technieken die kunnen worden uitgevoerd zonder de noodzaak van zeer dure specialistische apparatuur. Hier geven we expliciete instructies een middelgrote doorvoer, specifieke en relatief goedkoop microplate assay voor de bepaling van boe intra-en extracellulaire ascorbaat in celcultuur.

Inleiding

De ontdekking van de chemische aard van ascorbinezuur (vitamine C) en de identificatie als het lang gezochte "anti-scheurbuik factor", door Albert Szent-Györgyi en anderen in papers 1928-1934 ¹ werden mijlpalen in de geschiedenis biochemie. Inderdaad, deze ontdekkingen hebben bijgedragen aan Szent-Györgyi de toekenning van de Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde in 1937. De steeds groeiende reeks van rollen voor ascorbaat in dierlijke en plantaardige fysiologie, evenals de menselijke gezondheid, blijven de onderwerpen van actieve wetenschappelijke zijn onderzoek en controverse.

L-ascorbaat is een overvloedige fysiologisch reductiemiddel en enzym cofactor in zoogdierlijke systemen en draagt ​​talrijke welbepaalde enzymatische reacties die collageen hydroxylering, carnitine en norepinefrine biosynthese, tyrosine metabolisme en peptide hormoon amidering ^2. Intrigerend, montage evidence stelt ascorbaat speelt een rol bij het ​​stimuleren van andere ijzer-afhankelijke dioxygenases, zoals prolyl-en asparaginyl hydroxylases betrokken bij de hydroxylering en de gerichtheid van de hypoxia-induceerbare factor (HIFs) 1α en 2α ^3. Een recent rapport blijkt dat ascorbaat speelt een rol in de T-cel rijping, door invloed chromatine demethylation via haar activiteiten in het stimuleren van de nucleaire hydroxylases, Jumonji C (JmjC) domein eiwitten; waarvan de laatste lijken te ascorbaat voor de volledige activiteit ⁴ nodig. Inderdaad lijkt de stimulatie van dergelijke enzymen door ascorbaat plaatsvinden via een vergelijkbaar mechanisme om de stimulatie door ascorbaat van de HIF en collageen hydroxylases. Onder andere klassieke effecten, ascorbaat aanzienlijk bij tot cellulaire antioxidatie als een in water oplosbare keten vrijkomen radicalen ⁵ en de recycling van plasmamembraan α-tocoferol (vitamine E) via de vermindering van de α-tocopheroxyl groep ^6, which is belangrijk bij de bescherming tegen membraan lipide peroxidatie ^7. Belangrijk, hoewel de meeste zoogdieren kunnen de novo hepatische synthese van ascorbaat uit D-glucose, hogere primaten, cavia's en sommige knuppels afhankelijk voedingsbronnen van vitamine ^8. Dit is vanwege inactivering van de Gulo gen, de orthologen van die onaangetast zoogdieren coderen voor het enzym, γ-gulono-lacton oxidase ^9-13. Dit enzym is vereist voor de laatste reactie in ascorbaat biosynthese uit glucose ^13.

Na-transporter gemedieerde absorptie vanuit het darmlumen in mensen wordt ascorbaat hele lichaam verspreid door de bloedsomloop. De vitamine is doorgaans te vinden in zijn gereduceerde vorm bij millimolaire concentraties intracellulair (met de opmerkelijke uitzondering van erytrocyten waarin de concentraties zijn meestal vergelijkbaar met de gangbare plasma concentratie), en bij micromolaire concentrations (bijv. 50-200 uM) in de meeste extracellulaire vloeistoffen ^14,15.

Onder fysiologische omstandigheden, ascorbaat ondergaat typisch een omkeerbare een elektron oxidatie tot het ascorbinezuur vrije radicalen (AFR, ook bekend als monodehydroascorbate of semidehydroascorbate). Terwijl de AFR is een relatief stabiel radicaal ^16, bij het ​​ontbreken van een snelle een-elektron enzymatische reductie terug naar ascorbaat, kunnen twee AFRS dismutate verder een ascorbaat en een dehydroascorbaat (DHA) ^9,13,17. In het inwendige van de cel, de twee-elektron oxidatieproduct ascorbaat, DHA, kunnen snel naar ascorbaat verminderd glutathion en NAD (P) H-afhankelijke enzymatische en niet-enzymatische reacties ^13.

Hoewel het klassiek wordt aanvaard dat ascorbaat enige belangrijke rol in het metabolisme van ijzer is om de voeding absorptie van non-heem ijzer ¹⁸ stimuleren, hebben wij en anderen leverde bewijs strongly suggereert dat ascorbaat speelt een aanzienlijk grotere rol in het metabolisme van dit metaal. Ten eerste lijkt ascorbaat die vrijkomt door ascorbaat-vol-cellen een belangrijke rol spelen bij het ​​moduleren van de opname van niet-transferrine gebonden ijzer door cellen ^19,20, en zeer recente gegevens blijkt dat ascorbaat moduleert ook de opname van transferrine gebonden ijzer door cellen ^21, deze overeenkomt met een grote fysiologische ijzeropname-route ^22.

Ascorbaat is essentieel voor normale centraal zenuwstelsel functie zoogdieren ^23,24. Samen met de bijnierschors, hypofyse, thymus, netvlies en gele lichaam, de hersenen bevat hoge concentraties ascorbaat ten opzichte van andere lichaamsweefsels ^23,25-27. Bovendien wordt de blootstelling van zowel astrocyten ^28,29 en neuron-achtige cellen ³⁰ tot glutamaat waarover de afgifte van ascorbaat leiden in de extracellulaire ruimte, waarbij de ascorbate wordt gedacht om te helpen neuronen beschermt tegen glutamaat-geïnduceerde neuronale dysfunctie ^31. Hoewel het exacte mechanisme van glutamaat-geïnduceerde ascorbaat vrijlating uit de astrocyten onbekend is, hebben we onlangs bewijs geleverd waaruit blijkt de betrokkenheid van de cel zwelling veroorzaakt door glutamaat opname door de astrocyten glutamaat en aspartaat transporter (GLAST; ook bekend prikkelende aminozuurtransporter isovorm 1 [EAAT1 ] bij de mens) en daaropvolgende activatie van volume-gevoelige osmolyt en anionkanalen (VSOACs) dat doorlaatbaar is voor kleine organische anionen zoals ascorbaat ³² zijn. De moleculaire identiteit van de plasmamembraan leidingen die deze VSOAC formatie nog worden geïdentificeerd ^33,34.

Hoewel veel assays ontwikkeld voor het bepalen van ascorbaat in biologische monsters, die spectrofotometrische, fluorometrische en chromatografische bepalingen ^35,36 zijn er grote variatie in specificiteit, gevoeligheid, interference door chemische contaminanten, effectieve lineaire bereik en de stabiliteit van het eindpunt analyt. Bovendien, andere belangrijke factoren beïnvloeden de assay snelheid, gebruiksgemak en toegang tot betrekkelijk gespecialiseerde apparatuur zoals hoge-prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) apparaat.

Hier presenteren we een eenvoudige en zeer specifieke colorimetrische microplate assay voor de bepaling van intracellulaire ascorbaat in gekweekte cellen, evenals een afzonderlijke assay voor de bepaling van ascorbaat-uitstroming uit gekweekte cellen. De laatste test is bedoeld om het probleem van de onderschatting van ascorbaat vrijlating uit de cellen te omzeilen door snelle heropname van vrijgegeven ascorbaat door natrium-afhankelijke ascorbaat transporters (SVCTs). Hoewel beide van deze methoden zijn verschenen in een aantal van onze eerdere publicaties ^{19,20,32,37,38,} dit manuscript biedt een expliciete set van instructies en richtsnoeren voor de daadwerkelijke uitvoering.

Protocol

1. Bepaal Intracellular Ascorbate in gekweekte cellen

1. Celcultuur en oogsten
   1. Grow schorsing (bv. menselijke erythroleukemie, K562) of aanhangende cellen (bijv. primaire astrocyten) met behulp van standaard cultuur procedures ^19-21,32,38. Opmerking: om ervoor te zorgen cellen bevatten ascorbaat, laden gekweekte cellen met ascorbaat hetzij als ascorbaat of DHA ^33,39.
2. Maak een-ascorbaat met cellulaire extract
   1. Incubeer een passend aantal fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)-gewassen schorsing of hechtende cellen met 450 pi van ijskoude Cell Permeabilisatie Buffer [CPB; 0,1% (gew / vol) saponine in PBS; 4 ° C]. Opmerking: Bepaal het aantal cellen nodig is om een ​​absorptiewaarde binnen het lineaire bereik van de assay te verkrijgen (zie hieronder) empirisch door de eindgebruiker. Opmerking: weefsel extracten kunnen ook worden gebruikt (zie Overleg voor meer details).
   2. Agitate cellen op ijs gedurende 10 minuten grondig celafbraak waarborgen.
   3. Een geklaarde-ascorbaat bevattende intracellulaire extract verwijderen celresten door centrifugeren van het ruwe lysaat bij 16.000 x g gedurende 5 min in een gekoelde microcentrifuge (4 ° C).
   4. Verwijder voorzichtig 4 x 100 pi aliquots van elk monster en aan een horizontale reeks van putjes in een 96-well plaat met vlakke bodem die ofwel 25 ul / putje PBS ("AO") alleen of 25 ul / putje van 45,5 U bevat / ml voorraad oplossing van L-ascorbaat-oxidase (AO) in PBS ("+ AO"). Opmerking: dit moet parallel met de opstelling van de normen (zie hieronder).
3. Ascorbaat standaard-curve constructie (moet opnieuw worden gebouwd voor elke test)
   1. Bereid een voorraadoplossing van 10 mM ascorbinezuur in ijskoude PBS. Let op: Controleer de concentratie van ascorbaat spectrofotometrisch met behulp van een kwarts cuvet met een 1cm weglengte bij 265 nm (extinctiecoëfficiënt = 14,5 mM ^-1 cm ^{-1) 40.}
   2. Stelt een reeks standaarden ascorbaat tussen 0 en 20 uM voorzichtig.
   3. Parallel met stap 1.2.4, verwijder 4 x 100 ul aliquots van elke standaard en aan een horizontale reeks van putjes in een 96-well plaat met vlakke bodem die 25 ul / putje bevat PBS ("AO") of 45.5 U / ml stockoplossing van AO in PBS ("+ AO"). Opmerking: 100 pl van de bovengenoemde ascorbaat normen 0-2 nmol ascorbaat bevatten. Let op, het doel van de AO is om te controleren voor de bijdrage van niet-ascorbaat reductanten tot vermindering ferricyanide.
4. Bepaal intracellulaire ascorbaat - Stap 1: selectief verwijderen ascorbaat en kwantitatief oxideren ascorbaat met ferricyanide
   1. Orbitaal meng de 96-well plaat bij 550 tpm bij kamertemperatuur gedurende 5 min in het donker door het bedekken van de plaat in folie. Opmerking: Tzijn stap moeten alle ascorbaat oxideren in de "+ AO" putten DHA. De "AO" bronnen moeten worden beïnvloed.
   2. Voeg 50 ul van 3,5 mM kaliumferricyanide in PBS (hierna "ferricyanide") aan alle putjes. De uiteindelijke [ferricyanide] = 1 mM. Opmerking: Gebruik een multipipettor.
   3. Orbitaal meng de plaat bij 550 tpm bij kamertemperatuur gedurende nogmaals 5 minuten in het donker. Opmerking: Deze stap moet leiden tot een vermindering van ferricyanide tot ferrocyanide door ascorbaat in een stoichiometrische verhouding van 2 moleculen ferricyanide verlaagd per 1 molecuul ascorbaat geoxideerd.
   4. Voeg onmiddellijk 25 ul van een vers geconstrueerde oplossing met 50% (v / v) azijnzuur en 30% (w / v) trichloorazijnzuur (TCA). Opmerking: Gebruik een multipipettor.
5. Bepaal intracellulaire ascorbaat - Stap 2: het kwantificeren hoeveelheid ferrocyanide gevormd ³⁷
   1. Voeg 100 ul van ferrocyanide vastberadenheid oplossing ³⁷ tot each goed. Opmerking: Een werkende oplossing moet onmiddellijk voor het gebruik te worden gemaakt: 2 ml 3 M Na-acetaat (pH 6,0); 0,5 ml ijsazijn (~ 17,4 M azijnzuur); 2 ml 0,2 M citroenzuur; 2 ml 3,3 mM _FeCl3 in 0,1 M azijnzuur; 1 ml 30 mM ferene-S. Het eindvolume van de werkoplossing moet 7,5 ml.
   2. Orbitaal meng de plaat in het donker bij 550 rpm gedurende 30 min bij kamertemperatuur geroerd.
   3. Lees de absorptiewaarden van de putjes bij 593 nm (het absorptiemaximum van de Fe (II) (ferene-S) ₃ complex).
   4. Bereken de hoeveelheid intracellulaire ascorbaat als nmol ascorbaat per miljoen cellen door eerst het aftrekken van de A _{593 nm} waarden voor de '+ AO' putten uit de overeenkomstige '- AO' wells voor elk monster en het interpoleren van de ascorbaat standaardkromme (zie stap 1.3 ). Bij de bouw van de standaard curve, plotten dit "verschil waarde" voor elk standaard tegen de hoogte van ascorbaten per putje.

2. Bepaling van ascorbaat-efflux van gekweekte cellen

1. Celcultuur en oogsten
   1. Grow schorsing of aanhangende cellen zoals hierboven (zie stap 1.1). Opmerking: het uitvoeren van de onderstaande test in een 24-well plat formaat met schorsing en hechtende cellen voor de beste resultaten.
   2. Resuspendeer cellen suspensie of overlay hechtende cellen met 400 ul voorverwarmde HEPES-gebufferde zoutoplossing, met of zonder calcium en magnesium bevattende 5 mM D-glucose (HBS / D, pH 7,3, 37 ° C) in putjes van een 24-wells plaat. Voeg dezelfde hoeveelheid HBS / D gespecificeerde celvrije putjes op elke plaat met 24 putjes worden onderzocht. Opmerking: deze zal dienen als celvrij controles voor de basislijn reactie (zie hieronder).

3. Bepaal de hoeveelheid Ascorbate Uitgebracht

1. De volgende voorraad oplossingen moeten van tevoren worden bereid: 120U / ml AO in HBS / D (vers bereid); 2,4 mm Ferene-S in HBS / D; 120 uM _FeCl3 en 600 uM Na-citraat in HBS / D (onmiddellijk bereiden van meer geconcentreerde voorraad oplossingen).
2. Om de ferrireduction reactie (eindvolume per putje moet 600 pi zijn) te starten, voeg de volgende hoeveelheden leveren aan elk putten reeds met 400 ul van HBS / D:
   1. Voeg 50 ul van AO (120 E / ml) of HBS / D om putten in drievoud gekoppeld. De uiteindelijke AO concentratie dient 10 E / ml zijn. Opmerking: Label gepaarde putten als "- AO" en "+ AO".
   2. Meng de platen met zachte orbitale mengen gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
   3. Voeg 50 ul van 2,4 mM ferene-S aan alle putjes. De uiteindelijke ferene-S concentratie moet 200 uM. Meng de platen zoals hierboven voor 5 min bij 37 ° C.
   4. Voeg 50 ul van vers bereide 120 uM ijzercitraat. De uiteindelijke ijzer en citraatconcentraties moet 10 uM ijzer en 50 uM citraat zijn. Meng goed.
3. In drie drievoud controle putten, zuig het bovenliggende medium en voeg 600 ul HBS / D met 0,1% saponine. Opmerking: Deze zullen als "100% cel-lysis" regelaars voor een lactaat dehydrogenase (LDH) afgifte assay worden parallel uitgevoerd (zie hieronder).
4. Incubeer gedurende 60 min in het donker bij 37 ° C.
5. Aan het einde van de ascorbaat-efflux assay snel zuigen 500 pl van elk putje toevoegen adequaat geëtiketteerd putten in een 24-wells plaat. Opmerking: voor suspensiecellen aanvankelijk de cellen verwijderd door centrifugeren bij 4 ° C.
6. Voeg 300 ul aliquots van het supernatant van een 96-well plaat en lees bij 593 nm.

4. Bepaling van extracellulaire ascorbaat

1. Lees de absorptiewaarden van de putjes op 593 nm.
2. Bereken de hoeveelheid extracellulaire ascorbaat als nmol ascorbaat per mg eiwit (of per miljoen cellen) zoals beschreven voor de bepaling van intracellulaire ascorbaatin stap 1.5.4. Let op: de eindgebruiker dient te optimaliseren zodat ascorbaat vrijlating niet wordt beperkt door intracellulaire ascorbaat.

5. Bepaling van LDH release

1. Met de resterende 200 ul van extracellulaire oplossing van elk monster voeren een LDH afgifte test ^32,41 om de mate van cellulaire lysis. Opmerking: berekenen als% van totale afgeefbare LDH. Bepaal losmaakbare LDH uit de monsters die werden behandeld met 0,1% saponine.

Resultaten

Bepaling van intracellulaire Ascorbate in gekweekte suspensiecellen

In het eerste assay (figuur 1), wordt bepaald intracellulaire ascorbaat, na ascorbaat-specifieke (bijvoorbeeld AO-gevoelige) reductie van ferricyanide tot ferrocyanide, met de zeer gevoelige bepaling van ferrocyanide een eerder gepubliceerde werkwijze ^37. De detectie van ascorbaat is gebaseerd op de colorimetrische chelatie van ferro-ijzer dat wordt gegenereerd door de ascorbaat-afhankelijke...

Discussie

In dit artikel presenteren we twee snelle, specifieke en relatief gevoelige colorimetrische microplate assays voor het bepalen van ascorbaat afgeleid van de intra-en extracellulaire compartimenten in gekweekte cellen. De testen kunnen worden aangevuld met toegang tot standaard laboratorium apparatuur en reagentia. Het slechts matig duur reagens die voor de test is AO, die essentieel omdat het zorgt voor een hoge mate van specificiteit analyt naar L-ascorbaat. De testen zijn goed geschikt o...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Nunc 96-well flat-bottom plates	Thermo	269620	Elke platte 96-well met platte bodem kan worden gebruikt
Refrigerated benchtop microcentrifuge	Eppendorf	5415D	Een niet-gekoelde microcentrifuge die in temperatuur is uitgebalanceerd in een koude kamer kan ook worden gebruikt
Refrigerated bench-top centrifuge	Eppendorf	5810R	Zwaaiende emmer
Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer	Bio-Rad		Elke microplate-spectrofotometer die in staat is om op 593 nm te lezen, kan worden gebruikt en wordt aanbevolen. Als een filter-gebaseerde plate reader wordt gebruikt, kies dan de dichtstbijzijnde mogelijke golflengte en gebruik de standaardcurve-methode.
Ependorf MixMate (microplate orbital mixer)	Eppendorf		Dit is een zeer veelzijdige en betrouwbare microplatemixer en werkt erg goed voor deze assays
General-purpose buffers
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4
MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3
MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)
HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)
Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)
General chemicals
L-ascorbic acid of sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich		Bereiding met de hoogste zuiverheid moeten worden verkregen
Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer	Sigma-Aldrich	30790	Waterige oplossingen leveren theoretisch 2 mol DHA-monomeer per mol DHA-dimer
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762	Stockoplossingen bereid in DMSO of ethanol
Ascorbate oxidase (AO)	Sigma-Aldrich	A0157	Stockoplossingen (120 U/ml) kunnen worden bereid in PBS of MBS en vervolgens in aliquoten worden ingevroren
Potassium ferricyanide (FIC)	Sigma-Aldrich	455989	Trihydraat
Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt)	Sigma-Aldrich	92940
Sodium L-glutamate	Sigma-Aldrich
L-glutamine	Sigma-Aldrich
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Bereid een 0,1% stockoplossing
Stockoplossingen voor intracellulaire ascorbaatbepaling assay
3 M sodium acetate (pH 6,0)
Glacial acetic acid
0,2 M citroenzuur
3,3 mM FeCl3 in 0,1 M azijnzuur
30 mM ferene-S
50% (v/v) azijnzuur + 30% (w/v) trichloroazijnzuur (TCA)
Stockoplossingen voor ascorbaat-efflux assay
AO (120 U/ml)
2,4 mM ferene-S
0,12 mM FeCl3 in 0,6 mM sodium-citrat