Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Bereiding van DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels

14.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51323

⸱

27 augustus 2014

 , 
1New Jersey Neuroscience Institute, JFK Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 3Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Rutgers University

In dit artikel

Samenvatting

Ons laboratorium heeft DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels, een dynamisch hydrogel systeem ontwikkeld om de effecten van modulerende weefsels stijfheid op celfunctie beter te begrijpen. Hier bieden we schema's, beschrijvingen en protocollen om deze hydrogels bereiden.

Samenvatting

Mechanobiology is een opkomende wetenschappelijk gebied dat de kritische rol van fysieke signalen in regisseren cel morfologie en functie-adressen. Bijvoorbeeld, het effect weefsel elasticiteit celfunctie is een belangrijk gebied van Mechanobiology onderzoek omdat weefsel stijfheid moduleert met de ziekte, ontwikkeling, en schade. Static weefsel nabootsen materialen, of materialen die niet kan wijzigen stijfheid wanneer cellen worden uitgeplaat, worden voornamelijk gebruikt om de effecten weefsel stijfheid op celfuncties te onderzoeken. Terwijl verzameld van statische studies informatie waardevol is, deze studies zijn niet indicatief voor het dynamische karakter van de cellulaire micro-omgeving in vivo. Om de effecten van dynamische stijfheid op celfunctie beter tegemoet ontwikkelden we een DNA verknoopt polyacrylamide hydrogel systeem (DNA gels). In tegenstelling tot andere dynamische substraten, DNA gels hebben de mogelijkheid om te verlagen of te verhogen van de stijfheid na fabricage zonder stimuli. DNA gels bestaan ​​uit DNA crosslinkten die worden gepolymeriseerd tot een polyacrylamide hoofdketen. Toevoegen en verwijderen verknopingen via levering van enkelstrengs DNA mogelijk maakt temporele, ruimtelijke en reversibele controle gel elasticiteit. We hebben laten zien in de vorige verslagen die de dynamische modulatie van DNA-gel elasticiteit beïnvloedt fibroblast en neuron gedrag. In dit verslag en video, bieden we een schema dat de DNA-gel verknoping mechanismen en stap-voor-stap instructies beschrijft over het preparaat DNA gels.

Inleiding

Statische en dynamische substraten twee categorieën biomaterialen die zijn ontwikkeld om de effecten van weefsel elasticiteit of stijfheid op celfunctie bestuderen. Statische substraten kunnen hun fysische eigenschappen veranderen nadat ze zijn vervaardigd en / of wanneer cellen worden uitgeplaat. Polyacrylamide (PA) gels waren de eerste tweedimensionale, statische substraten die werden gesynthetiseerd voor Mechanobiology onderzoeken 5,17. PA gels zijn gemakkelijk te bereiden, goedkoop, veelzijdig en kan worden vervaardigd met een groot aantal elastische moduli. Hoewel deze technische voordelen maken PA gels een algemeen toegepaste substraat, statische substraten zijn niet indicatief voor het dynamische karakter van de extracellulaire matrix (ECM) en de omliggende cellulaire omgeving in vivo. Bijvoorbeeld, de ECM stijfheid veranderingen ondergaat als gevolg van een verwonding, ontwikkeling of ziekte. Dynamische substraten zijn daarom de voorkeur als weefsel nabootsen substraat modellen in Mechanobiology studies 22,24,25.

Talrijke synthetisch zijn natuurlijke, tweedimensionale, driedimensionaal, statische en dynamische biomaterialen ontwikkeld om weefsel stijfheid 1,3,6,16,23,26 nabootsen. Sommige dynamische substraten vereisen hitte, UV-, elektrische stroom, ionen en de pH veranderingen in hun mechanische eigenschappen 2,4,7,8,12,15,16 veranderen, maar deze prikkels kunnen bio-applicatie van de hydrogel te beperken. DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels (DNA gels) dynamisch tweedimensionale elastische substraten. DNA crosslinks zorgen voor temporele, ruimtelijke en reversibele modulatie van DNA gel stijfheid door toevoeging van enkelstrengs DNA (ssDNA) media of buffer 9-11,13,14,18,21. Anders dan de bovengenoemde dynamische gels waar stimuli worden toegepast modulatie van elasticiteit, de DNA gels vertrouwen op de diffusie van toegepaste ssDNA voor de wijziging van elasticiteit. Daarom is de bovenste gel oppervlak, waar de cellen worden gekweekt, is het eerste gebied gemoduleerde omdat het tarief of elasticiteit modulatie afhankelijk van de gel dikte.

DNA gels zijn vergelijkbaar met hun tegenhangers PA gel in dat ze een polyacrylamide hoofdketen, maar de bis-acrylamide verknopingen vervangen verknopingen samengesteld DNA (figuur 1). Twee ssDNAs (SA1 en SA2) hybridiseren met een verharder streng (L2) te maken van de DNA-verknopingen van de gel. SA1 en SA2 hebben verschillende sequenties die beide bevatten een acrydite modificatie aan het 5'-end voor een effectieve integratie in de PA-netwerk. Voor de bereiding van de gels, SA1 en SA2 worden afzonderlijk gepolymeriseerd tot een PA hoofdketen en vervolgens het gepolymeriseerde SA1 en SA2 samen gemengd. L2, de crosslinker, wordt toegevoegd aan de SA1 en SA2 mengsel. De L2 basenvolgorde is complementair aan zowel SA1 en SA2 sequenties en L2 hybridiseert met SA1 plus SA2 aan het DNA crosslinks vormen. Eerste, DNA gel elasticiteit wordt bepaald door zowel L2 concentraties en verknoping (tabellen 1 en 2). DNA gels die gelijk stoichiometrische hoeveelheden L2, SA1 en SA2 zijn de stijfste gels omdat SA1 en SA2 zijn 100% verknoopt door L2 (aangeduid als 100% gels). Lagere concentraties L2 resulteren in een lager percentage DNA verknoping en derhalve zachter DNA gels. Gels zo laag als 50% verknoopt (aangeduid als 50% gels) zijn geconstrueerd 9-11.

figure-introduction-1
Figuur 1 DNA gel verknoping en uncrosslinking schematische 9-11,13,14,18,21 Stap 1:. SA1 (rood) en SA2 (blauw) zijn individueel gepolymeriseerd tot een polyacrylamide backbone (zwart). Na polymerisatie worden SA1 en SA2 gepolymeriseerde oplossingen met elkaar vermengd. Stap 2: L2 (groen) wordt toegevoegd en hybridiseert met SA1 plus SA2 de verknopingen van de gel. Stap 3: R2 hybridiseert met thij steunpunt van L2. Stap 4: steunpunt hybridisatie van R2 stuwt het openritsen van L2 uit SA1 en SA2.

In tegenstelling tot de PA gels, kan DNA-gels verstijven en te verzachten na de synthese. Daarom kunnen cellen gekweekt op DNA gels onderworpen aan dynamische stijfheid veranderingen. Om cel-hechtende gels verstevigen, L2 kunnen worden toegevoegd aan het kweekmedium van laag percentage gels het percentage verknopingen verhogen. Om cel-hechtende gels verzachten, L2 kan worden verwijderd om het percentage verknopingen 10,13,21 verminderen. L2 heeft een extra steunpunt sequentie aan het 3'einde om L2 te uncrosslink van SA1 en SA2 (tabel 1). Verwijdering van L2 wordt bereikt door hybridisatie van een omkering streng genoemd R2. R2 is een aanvulling op de volledige lengte van L2 en hybridiseert eerst met de L2 houvast. Toehold hybridisatie stuwt het openritsen van L2 uit SA1 en SA2, die de crosslink elimineert en vermindert de gel stijfheid.

In dit rapport envideo, stap-voor-stap instructies worden verstrekt voor het opstellen van verstijving en verzachtende DNA gels. Terwijl 100% en 80% gelpreparaten worden beschreven, kan dit protocol worden aangepast aan DNA gels van andere eerste en laatste verknoopt percentages creëren. In het algemeen zijn 100% en 80% gels bereid, geïmmobiliseerd op glazen dekglaasjes, gefunctionaliseerde en geënt met cellen. L2 wordt toegevoegd aan het medium van 80% gels en R2 wordt toegevoegd aan het medium 100% gels, 48 ​​uur na uitplaten. De toevoeging van L2 tot media verstijft 80% gels tot 100% verknoopt, terwijl de toevoeging van R2 naar media verzacht 100% gels tot 80% verknoopt. Verstijfde gels worden aangeduid als 80 → 100% gels en zacht gels worden aangeduid als 100 → 80% gelen in de tekst. Voor control of statische gels, ssDNA bestaande uit Ts of As is afgeleverd andere set 100% en 80% gels. Na minimaal twee dagen na elasticiteit modulatie, kunnen cellen worden verwerkt en geanalyseerd.

DNA crosslink # Van basen Sequence (steunpunt) Modificatie Smelttemperatuur (Tm, ° C) Reacties
5 '→ 3'
Ontwerp 1 SA1 10 GCA CCT TTG C 5 "acrydite 34,9
SA2 10 GTC AGA ATG A 5 "acrydite 23,6
L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG 56 Een 10 bp toehold sequentie wordt opgenomen.
R2 30 CAA GTG TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA R2 is complementair aan L2
Ontwerp 2 SA1 14 CGT GGC ATA GGA CT 5 "acrydite 46.9
SA2 14 GTT TCC CAA TCA GA 5 "acrydite 40.2
L2 40 TCT GAT TGG GAA AC Een GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C 65.9 Een 12 bp volgorde steunpunt is inbegrepen.
R2 40 GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A 65.9 R2 is complementair aan L2
Design 3 SA1 20 ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC 5 "acrydite 55
SA2 20 CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA 5 "acrydite 56.6
L2 40 TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T 68.8 Steunpunt is niet inbegrepen.
Controle Controle 20-40 AAA AAA (etc.) of
TTT TTT (etc.)

Tabel 1 Basis sequenties voor ssDNA 9-11,13,14,18,21. Cellulaire en mechanische studies hebben verscheidene d benutifferent crosslink ontwerpen DNA gels met verschillende statische en dynamische mechanische eigenschappen te genereren. De gemoduleerd verknoping ontwerpparameters zijn basensequentie sequentie en lengte of verknopen lengte. Vet en cursief lettertype illustreren baseparing tussen SA1 en L2 en tussen respectievelijk SA2 en L2.

Ontwerp
1 2 3
Acrylamide Concentratie (%) 10 10 10 4
SA1 plus SA2 gehybridiseerd met L2 (% verknoopt) 50 80 100 50 80 100 100 100
Elasticiteit (kPa, gemiddelde ± SEM) 6,6 ± 0,6 17,1 ± 0,8 29.8 ± 2.5 5.85 ± 0.62 12.67 ± 1.33 22.88 ± 2.77 25.2 ± 0.5 10,4 ± 0,6

Tabel 2 Young's modulus (E) van DNA gels 9-11,13,14,18,21. Acrylamide concentratie crosslink percentage en verknoping lengte kan worden gemoduleerd DNA gels. Designs 1, 2 en 3 hebben 20, 28 en 40 bp verknopen lengten respectievelijk. 100% gels voor alle ontwerpen hebben vergelijkbare moduli aangeeft crosslink lengte heeft geen invloed gel elasticiteit. Echter, variaties in concentratie acrylamide veranderen DNA gel elasticiteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Het gehele protocol van gelbereiding naar cel verwerking duurt minimaal zes dagen. Geschatte tijd voor gelbereiding is 8 uur plus een O / N incubatie. Geschatte tijd voor gel immobilisatie en DNA gloeien is 8 uur plus een O / N spoelen stap. Geschatte tijd voor gel functionalizering is 2 uur. Tijd voor mobiele plating en groei afhankelijk van het type cultuur en toepassing, maar minimaal vier dagen vereist.

1 Bereiding van DNA Gels

OPMERKING: Bereid DNA gels in drie verschillende stappen. Eerst individueel polymeriseren SA1 en SA2 ssDNA in een PA backbone. Deze oplossingen worden SA1 gepolymeriseerde oplossing en SA2 gepolymeriseerde oplossing, respectievelijk genoemd (§ 1.1). Tweede, ontbinding van de verharder, omkeerbare streng, en controle ssDNAs. Los het gevriesdroogde L2 ssDNA (verknopingsmiddel). Dit wordt 100% L2-oplossing en wordt 100% gels (§1.2) fabriceren. Verdun een hoeveelheid van 100% L2 oplossingtot 80%. Dit wordt 80% L2-oplossing en wordt gebruikt om 80% gels fabriceren. Ontbinden gevriesdroogde R2 (omkeerbaar streng) en controle ssDNA om te gebruiken in § 4. Ten derde, meng SA1 gepolymeriseerde oplossing SA2 gepolymeriseerde oplossing en 100% of 80% L2 oplossing in een verhouding van 10: 10: 6 (SA1: SA2: L2) tot 100% en 80% respectievelijk gels vormen. (§1.3).

1 Voorbereiding van SA1 en SA2 Gepolymeriseerd Solutions

  1. Selecteren en om de juiste SA1, SA2, L2 en R2 base sequenties van tabellen 1 en 2. Basesequenties en sequentielengte werden geoptimaliseerd in eerdere verslagen 9-11,13,14.
  2. Bereken alle oplossing formuleringen (tabellen 3-4). OPMERKING: Minutieus document berekeningen voor het oplossen van problemen. Constructie van een Excel template wordt aanbevolen en herhaaldelijk kan worden gebruikt voor DNA gel bereiding. Zie tabel 3 en 4 voor een voorbeeld van de tabel voor Design 2 (Tabellen 1 en 2). De in tabel 4 volumes in dit protocol worden gebruikt, maar volumes zal variëren met elk aliquot van gelyofiliseerd ssDNA.
Oplossing De concentratie van de oplossing Percentage Stock Solution in SA1 of SA2 Gepolymeriseerd Solution (v / v) Uiteindelijke concentratie van Solution in SA1 of SA2 Gepolymeriseerd Solution
Acrylamide (No-Bisacrylamide) 40% 25 10%
SA1 of SA2 oplossing 100% 60 60%
TBE buffer 10x 10 1x
TEMED 20% 2,5 0,50%
APS 2% 2,5 0,05%

Tabel 3. Percentage van de oplossingen voor het vervaardigen van SA1 of SA2 gepolymeriseerde oplossingen. De eerste kolom geeft de oplossingen voor het formuleren van de DNA-gels. De tweede kolom geeft de voorraad concentraties van deze oplossingen. De derde kolom geeft het percentage van de voorraad oplossingen in SA1 of SA2 gepolymeriseerde oplossingen (v / v). De laatste kolom geeft de eindconcentraties in SA1 en SA2 oplossingen.

ssDNA oplossingen (§1.1)
Oplossing Components
Oplossing Stock Concentratie Endlösung Concentratie Berekening Bedrag aan toevoegen Reacties
SA1 oplossing 320,7 nmol gevriesdroogde SA1 ssDNA 3,00 mM 320,7 nmol / 3,00 nmol gl -1 = 107 gl 107 ui TE-buffer gevriesdroogde ssDNA SA1 oplossing 60% van SA1 gepolymeriseerde oplossing.
107 gl / 0,600 = 178 gl
178 pi is de totale hoeveelheid SA1 gepolymeriseerde oplossing (tabel 3).
SA2 oplossing 324.4 nmol gevriesdroogde SA2 ssDNA 3,00 mM 324.4 nmol / 3,00 nmol gl -1 = 108 gl 108 ui TE-buffer gevriesdroogde ssDNA SA2 oplossing 60% van SA2 gepolymeriseerde oplossing.
108 gl / 0,600 = 180 gl
180 gl is het totale volume van SA2 gepolymeriseerde oplossing (tabel 3).
100% L2 oplossing 657,4 nmol gevriesdroogde L2 ssDNA 3,00 mM 657,4 nmol / 3,00 nmol gl -1 = 219 gl 219 ui TE-buffer gevriesdroogde ssDNA Verdun een hoeveelheid van 100% tot 80% L2 L2 oplossing
80% oplossing L2 80 gl 100% L2 ssDNA 80% - 20 ui TE-buffer 80 gl 100% L2 oplossing
Controle-oplossing 332,6 nmol gevriesdroogde poly T of A ssDNA 3,00 mM 332,6 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 111 ul 111 ui TE-buffer gevriesdroogde ssDNA
R2-oplossing 193,8 nmol gevriesdroogde R2 ssDNA 3,00 mM 193,8 nmol / 3,00 nmol gl -1 = 64,6 gl 64,6 ui TE-buffer gevriesdroogde ssDNA
Gepolymeriseerde oplossingen (§1.2)
SA1 gepolymeriseerde oplossing 40% acrylamide 10% 178 pi x 0,25 = 44,5 gl 45 pl Bereken de hoeveelheid acrylamide, TBE, APS en TEMED basis van een totaal volume van 178 pl (zie hierboven en tabel 3).
10x TBE 1x 178 pi x 0,10 = 17,8 ul 18 pl
100% SA1 oplossing 60% - 107 ul SA1 oplossing 60% van de SA1 gepolymeriseerde oplossing (zie hierboven en tabel 3).
2% APS 0,05% 178 pi x 0,025 = 4,45 pi 4,5 pl Toe en meng APS voor het toevoegen TEMED.
20% TEMED 0,50% 178 pi x 0,025 = 4,45 pi 4,5 pl
SA2 gepolymeriseerde oplossing 40% acrylamide 10% 180 pi x 0,25 = 45 gl 45 pl Bereken de hoeveelheid acrylamide, TBE, APS en TEMED basis van een totaal volume van 180 pl (zie hierboven en tabel 3).
10x TBE 1x 180 pi x 0,10 = 18 gl 18 pl
100% SA2 oplossing 60% - 108 ul SA2 oplossing 60% van de SA2 gepolymeriseerde oplossing (zie hierboven en tabel 3).
2% APS 0,05% 180 pi x 0,025 = 4,5 gl 4,5 pl Toe en meng APS voor het toevoegen TEMED
20% TEMED 0,50% 180 pi x 0,025 = 4,5 gl 4,5 pl
Gel-oplossingen (paragraaf 1.3)
100% Geloplossing 100% SA1 gepolymeriseerde oplossing 10 delen - 10 gl Componeren 100% gels met de volgende SA1: SA2: L2 verhouding 10: 10: 6.
100% SA2 gepolymeriseerd solution 10 delen - 10 gl
100% L2 oplossing 6 delen - 6 pi
80% Geloplossing 100% SA1 gepolymeriseerde oplossing 10 delen - 10 gl Componeren 80% gels met de volgende SA1: SA2: L2 verhouding 10: 10: 6.
100% SA2 gepolymeriseerde oplossing 10 delen - 10 gl
80% oplossing L2 6 delen - 6 pi
Dynamische gels (§3-4)
80 → 100% gel 80% gel 100% gel Berekening 1: 1 ui 100% L2 oplossing in kweekmedia Berekeningen zijn gebaseerd op het hebben van 20 ul gels op dekglaasjes. Eerst zet de delen 100% L2 oplossing in de 20 ul van gel in ui. Vervolgens wordt de hoeveelheid (in pl) 100% L2 oplossing moest nog 20% ​​van crosslinking. Voeg dit bedrag van 100% L2 oplossing voor gel.
(20 ul / 26 delen) x 6 delen = 4,6 pi
Berekening 2:
5 gl 0,2 x = 1 pi
100 → 80% gel 100% gel 80% gel Berekening 1: 1 ui 100% R2 oplossing in kweekmedia Berekeningen zijn gebaseerd op het hebben van 20 ul gels op dekglaasjes. Ten eerste, zet thij delen 100% L2 oplossing in de 20 ul van gel in ui. Vervolgens wordt de hoeveelheid (in pl) 100% L2 oplossing moest worden verwijderd om een ​​20% gel samen. Voeg deze hoeveelheid R2 oplossing gel.
(20 ul / 26 delen) x 6 delen = 4,6 pi
Berekening 2:
5 gl 0,2 x = 1 pi
100% gel (Control) 100% gel 100% gel - 1 ul van controle-oplossing in de cultuur media Mate van controle oplossing is gelijk aan het bedrag van de R2-oplossing toegevoegd.
80% gel (Control) 80% gel 80% gel - 1 ul van controle-oplossing in de cultuur media Mate van controle oplossing is gelijk aan het bedrag van 100% L2-oplossing toegevoegd.

Tabel 4 Voorbeeld berekeningen DNA gelbereiding. Mock van aantallen de berekeningen illustreren de bereiding van 80%, 100%, 100 → 80% en 80 → 100% gels. DNA gels Ontwerp 2 in tabel 1.

  1. Centrifuge gevriesdroogde SA1 ssDNA bij 2000 xg gedurende 15 seconden zodat alle ssDNA is onderin de flacon. OPMERKING: De juiste concentratie van SA1 oplossing is van cruciaal belang voor DNA-gel synthese.
  2. Bereid 3 mM SA1 door toevoeging van 107 pl 1x Tris-EDTA, pH 8,0 buffer (TE-buffer) aan de flacon (Tabellen 3-4).
  3. Heat SA1 in TE-buffer bij 70 ° C gedurende 5 minuten of totdat ssDNA pellet volledig is opgelost. OPMERKING: Verwarmingstemperatuur moet minimaal 5 ° C boven de smelttemperatuur (Tm) te waarborgen DNA in een enkelstrengs staat.
  4. Bereid SA1 polymerisatie door toevoeging van 40% acrylamide en 10x Tris-boraat-EDTA (TBE) buffer bij de aangegeven percentages (tabel 3). In dit voorbeeld, voeg 45 en 18 pl, respectievelijk 107 gl SA1 oplossing (tabel 4).
  5. Ontgas met stikstofgas gedurende 3 minuten mengen te vergemakkelijken. Plaats een P200 tip aan een stikstofbron gas in de oplossing langzaam toe stikstofgas door de oplossing te passen. Test de stroomsnelheid van stikstofgas in water voor ontgassing SA1 oplossing splatter voorkomen.
  6. Centrifugeer gedurende 15 sec bij 2.000 xg om de oplossing te verzamelen.
  7. Voeg 4,5 ul van 2% ammoniumpersulfaat (APS, Tabellen 3-4) gel polymerisatie te initiëren.
  8. Inverteer de buis verscheidene malen om te mengen.
  9. Centrifugeer gedurende 15 sec bij 2000 xg om oplossing homogene polymerisatie verzamelen.
  10. Voeg 4,5 ul van 20% tetramethylethyleendiamine (TEMED, tabellen 3-4) om de polymerisatie te katalyseren.
  11. Omkeren van de buismeermaals te mengen.
  12. Centrifugeer gedurende 15 sec bij 2000 xg om oplossing homogene polymerisatie verzamelen.
  13. Degas met stikstofgas voor 3-5 minuten om de polymerisatie te voltooien en te minimaliseren-un gereageerde monomeren.
  14. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de polymerisatie te voltooien. OPMERKING: Deze oplossing heet SA1 gepolymeriseerde oplossing.
  15. Herhaal stappen 1.1.3-1.1.16 met gevriesdroogde SA2 ssDNA, maar commentaar 45, 18, ​​4,5 en 4,5 pl acrylamide, TBE, APS en TEMED, respectievelijk 108 gl SA2 oplossing (tabellen 3-4). OPMERKING: SA1 en SA2 gepolymeriseerde oplossingen worden bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal een maand.

2 Voorbereiding van de L2, R2, and Control Solutions

  1. Herhaal stappen 1.1.3-1.1.5 met gevriesdroogde R2 ssDNA maar commentaar 64,4 ui TE-buffer (tabel 4).
  2. Herhaal de stappen 1.1.3-1.1.5 met gevriesdroogde controle ssDNA- maar voeg 111 ul TE-buffer (tabel 4 ).
  3. Herhaal stappen 1.1.3-1.1.5 met gevriesdroogde L2 ssDNA maar voeg 219 ul TE-buffer (tabel 4). OPMERKING: Dit is 100% L2 oplossing. Toevoeging van 100% L2 oplossing SA1 en SA2 gepolymeriseerde oplossingen (zie paragraaf 1.3) een 100% verknoopt DNA gel (100% gel) te vormen omdat zal SA1, SA2, en L2 zijn stoichiometrisch equivalent.
  4. Verdun een hoeveelheid van 100% L2 oplossing van 80% door toevoeging van 20 ul van 1 x TE-buffer tot 80 gl 100% L2 oplossing (tabel 4). OPMERKING: Deze oplossing is 80% L2 oplossing. Het toevoegen van 80% L2 oplossing SA1 en SA2 gepolymeriseerde oplossingen (zie paragraaf 1.3) een 80% verknoopte DNA gel (80% gel) te vormen omdat slechts 80% van SA1 en SA2 worden verknoopt aan L2. Oplossingen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal een maand.

3 Voorbereiding van Gel Solutions

  1. Warmte SA1 en SA2 gepolymeriseerde oplossingen bij 70 ° C tot oplossingsviscositeit wordt verlaagd (ongeveer 1 minuut). Verhoog de temperatuur tot 80 °C als oplossing is nog steeds te dik pipet.
  2. Voeg 10 ul of 10 delen SA1 gepolymeriseerde oplossing van 10 ul of 10 delen SA2 gepolymeriseerde oplossing (tabel 4). OPMERKING: SA1 en SA2 gepolymeriseerde oplossingen zijn zeer viskeuze en moeilijk te pipet. Aangezien de concentraties zijn van cruciaal belang voor de vorming van gel, gebruik maken van een positieve-displacement pipet uit dit punt naar voren of zie bespreking voor andere behandelingstechnieken. Ook pipet in meerdere, kleine porties (> 20 pl) in plaats van een enkel, groot volume.
  3. Mix SA1 en SA2 gepolymeriseerde oplossingen samen via afwisselend verwarmen (gedurende 15 sec bij 70 ° C) en roeren (voor 15 sec met een pipet tip) voor een totaal van 1 min.
  4. Voeg 6 gl of 6 delen 100% L2 oplossing 100% gel (tabel 4) te vormen.
  5. Meng door afwisselend verwarmen en roeren zoals beschreven in stap 1.3.3.
  6. Heat gel gedurende 1 uur bij de optimale hybridisatietemperatuur (35 ° C). Bereken eennnealing temperatuur met 5 ° C af te trekken van de ssDNA sequentie met de laagste smelttemperatuur (tabel 1).
  7. Pipetteer 100% gel in een 60-mm petrischaal.
  8. Toestaan ​​DNA verknopingen blijven rehybridize gel door incubatie gedurende 4 uur bij kamertemperatuur.
  9. Cover gel met PBS dat calcium en magnesium en incubeer O / N bij RT. OPMERKING: Gels zal ongeveer 3 keer hun oorspronkelijke volume zwellen. Daarnaast zal gels equilibreren met buffer en overmaat acrylamide diffunderen uit de gels. Calcium en magnesium in het PBS te stabiliseren DNA hybridisatie en gel te voorkomen barsten (zie Discussie voor toubleshooting gel barsten).
  10. Verwijder de resterende buffer van petrischaal.
  11. Tot 80% gels fabriceren, herhaalt u stap 1.3.1-1.3.10 maar vervang 100% L2 oplossing in stap 1.3.4 met 80% L2 oplossing. WINKEL 100% en 80% gels bij 4 ° C gedurende maximaal een maand. OPMERKING: De stijfheid verschillen tussen 80% en 100% gels fysisch onderscheiden.

    12. 2 Gel Immobilisatie op glas

    OPMERKING: Immobiliseer aliquots van 100% of 80% gels op glazen dekglaasjes (figuur 2).

    1. Verwarm 100% gel bij 70 ° C gedurende 30 seconden of totdat gel is dunner te pipetteren.
    2. Plaats glazen dekglaasjes op een 70 ° C verwarmingsblok en laat verwarmen 1-2 minuten.
    3. Voeg een druppel optische lijm aan elk glas dekglas.
    4. Voeg 20 ul 100% gel elk dekglaasje (tabel 4). OPMERKING: 10-30 gl kunnen worden afgegeven op elke dekglas.
    5. Laat gel te smelten en te verspreiden over glas dekglas. OPMERKING: Als gel topologie niet verschijnt, zelfs na het smelten, plat gel met een gesiliconiseerde glazen afdekplaat slip. Evenwel extra zwelling optreden in opeenvolgende stappen en bijdragen aan gel oneffenheid.
    6. Verwijder glas bevattende gel van verwarmingsblok en plaats in een 24-well weefselkweek schaal.
    7. Herhaal de stappen 2.1-2.6 met 8 0% gel.
    8. Serie gels 1 uur bij de optimale hybridisatietemperatuur (35 ° C). OPMERKING: Het is normaal dat gels te droog worden en dit zal worden opgelost wanneer gels worden geïncubeerd in PBS.
    9. Expose platen die 80% en 100% gels (UV, 365 nm) ultraviolet licht gedurende 15 minuten. OPMERKING: UV-blootstelling tegelijkertijd geneest lijm en steriliseert gels. Indien een UV verknoping kamer is niet beschikbaar, kan gels onder UV licht dat is uitgerust in een biologische veiligheidskast geplaatst. Na blootstelling aan UV, voeren volgende stappen van dit protocol onder een biologisch veiligheidskabinet om gel steriliteit te behouden. Gebruik ook steriele oplossingen vanuit dit punt naar voren.
    10. Laat DNA verknopingen te rehybridize bij kamertemperatuur gedurende 4 uur.
    11. Voeg PBS en incubeer O / N bij 4 ° C. OPMERKING: PBS incubatie spoelt, in evenwicht, en zwelt gels weer omdat herhaalde verwarming van de gels kan uitdrogen.

    51323 / 51323fig2highres.jpg "/>
    Figuur 2 Schematische voorstelling van gel immobilisatie en functionalisering. Na DNA-gels (grijs) worden bereid, gels worden om glazen dekglaasjes (wit) met optische lijm (groen) bevestigd. Gels worden tegelijkertijd uitgehard en gesteriliseerd met UV licht. Na zwelling, gels ongeveer 1 mm dik. Vervolgens worden gefunctionaliseerd gels in twee stappen (rode omlijsting). First, sulfo-SANPAH geconjugeerd aan acrylamide op de gel oppervlak door UV blootstelling aan licht. Ten tweede worden gels geïncubeerd met collageen of poly-D-lysine, die hecht aan het sulfo-N-hydroxysuccinimide ester sulfo-SANPAH. Dit cijfer is gewijzigd van 10.

    3 Gel Functionalisering

    OPMERKING: DNA gel functionalisering is vereist voor celadhesie aangezien polyacrylamide gels inert materiaal (figuur 2). In dit deel zullen gels worden gefunctionaliseerde in twee stappen. Eerst N -Sulfosuccinimidyl-6 (4 &# 39, -azido-2'-nitrofenylamino) hexanoaat of sulfo-SANPAH wordt covalent verbonden door fotolyse van nitrofenyl azide groep polyacrylamide de ruggengraat van het DNA gels. Ten tweede, primaire aminen in collageen of poly-D-lysine hechten aan de sulfo- N-hydroxysuccinimide ester sulfo-SANPAH om de eiwitten hechten aan het gel oppervlak.

    1. Verwijder buffer in putten met een pipet en zorg dat de gel niet aan te zuigen. OPMERKING: vacuümaspiratie niet uitvoeren om de waarschijnlijkheid van aspireren de gel te verminderen.
    2. Optioneel) Wash gels driemaal gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om overmaat acrylamide monomeer, TEMED en APS verwijderen.
    3. Voeg 300 ul van sulfo-SANPAH elke gel dekken.
    4. Expose gels UV (365 nm) gedurende 5 minuten.
    5. Verwijder sulfo-SANPAH.
    6. Spoel gels eenmaal met PBS om overmaat sulfo-SANPAH verwijderen.
    7. Herhaal de stappen 3,3-3,6.
    8. Incubeer gels in ongeveer 300 pi van 0,2 mg / ml poly-D-lysine voor 1 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C. OPMERKING: U incubeer gels met 0,2 mg / ml van collageen type 1 O / N bij 4 ° C.
    9. Was gels tweemaal met PBS gedurende 5 min om overmaat poly-D-lysine te verwijderen.
    10. Incubeer gels in ongeveer 300 pl media gedurende 30 minuten tot evenwicht gels.
    11. Verwijder media direct voor plating cellen.

    4 celkweek en Imaging

    OPMERKING: In dit gedeelte geven we informatie over de verzachting of stijf van de gel na cel plating. Een gedetailleerde celcultuur protocol is niet bedoeld om verschillende redenen. Ten eerste kan een groot aantal celtypen hechten aan DNA gels en elk celtype zullen specifieke aanpassingen door de onderzoeker voor mobiele plating vereisen. Ten tweede worden standaard cel en weefselkweek technieken die voor deze experimenten en is te vinden in tal van originele artikelen, technische artikelen en naslagwerken. Technieken voor specifiek plating fibroblasten en neuronen op DNA gels kan worden gevonden in Previlende publicaties 9-11,19-21.

    1. Plaat cellen. Voor protocollen met betrekking dissectie en / of kweken van neuronen of fibroblasten genoemd in dit artikel, raadpleegt u een van de volgende publicaties 9-11,19-21.
    2. Na minimaal 48 uur, moduleren gel stijfheid pipetteren 1 ui control, L2 of R2 oplossing dichtbij de gel (tabel 4).
      1. Gels verstijven van 80% tot 100% verknoopt (80 → 100% gels), voeg de resterende 20% van L2 tot 80% gels door toevoeging van 1 pi 100% L2 oplossing dichtbij de gel.
      2. Gels verzachten van 100% tot 80% verknoopt (100 → 80% gels), voeg R2 tot 20% van de verknopingen 100% gels verwijderd door toevoeging van 1 pi 100% R2 oplossing dichtbij de gel.
      3. Voor controles commentaar gelijke volumes controleoplossing een subset van 100% en 80% gels door toevoeging van 1 pi controleoplossing dichtbij de gel.
    3. Voer de gewenste cel verwerking en gegevensanalyse naminimaal 48 uur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Voorafgaand aan onze studies, werden cel-ECM interacties waargenomen op statische compliant biomaterialen of op onomkeerbare en unidirectionele dynamische substraten. Deze substraten geen juiste weergave van de dynamische aard van de cellulaire micro-omgeving. Ons werk verschuift de bestaande technische paradigma door een meer fysiologische model voor het bestuderen van cel-ECM interacties op verzachtende en verstijving dynamische biomaterialen. In vorige studies analyseerden we de effecten van dynamische substraten op ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het vermogen van DNA gels zacht of verstijven voor en na celadhesie zijn ze ideaal model voor de rol van dynamische stijfheid weefsels op celfunctie bestuderen. Alle drie ontwerpen zijn gebruikt in mechanische en biologische studies. Echter, alle drie ontwerpen hebben vergelijkbare elasticiteit bij verschillende crosslink percentages vermelding verknoping lengte ofwel geen invloed DNA gel elasticiteit (tabel 2). Daarentegen acrylamide concentratie beïnvloedt elasticiteit. Deze ontwerpen kunnen verschill...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag bedanken: Dr Frank Jiang, Dr David Lin, Dr Bernard Yurke en Dr Uday Chippada voor hun bijdrage aan de ontwikkeling van de DNA-gel technologie; Dr Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter voor hun opmerkingen en bewerkingen van dit manuscript; financieringsbronnen, waaronder de New Jersey Commissie over Spinal Cord Research (Grant # 07A-019-SCR1, NAL) en New Jersey Instituut voor Neurowetenschappen (MLP); en uitgevers van Tissue Engineering, deel A, voor de toestemming om de figuren 2 en 4 en Biomaterialen herdrukken voor toestemming om Figuur 3 herdrukken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ssDNAIntegrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com		Doe ssDNA niet in een vortex te mengen. Draai de fles voorzichtig om en/of pipet oplossing om te mengen.
PBS met calcium en magnesiumElk merk.
100x Tris-EDTA buffer (TE buffer)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com		T9285
10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)93290TBE is een reproductieve toxine.
40% Acrylamide oplossingFisher Scientific (Pittsburg, PA)BP14021Acrylamide is een toxine.
Ammoniumpersulfaat (APS)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)A3678Bereid een 2% oplossing in TE buffer. APS is een toxine en irriterend.
Tetramethylethyleendiamine (TEMED)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)T9281Bereid een 20% oplossing in TE buffer. TEMED is ontvlambaar, corrosief en een toxine.
12 mm diameter ronde dekglazenFisher Scientific (Pittsburg, PA)
fishersci.com		12-545-82
Norland optische lijm 72Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com		NOA72
24-well weefselkweekplaatElk merk.
MicrocentrifugebuizenElk merk.
Sulfo-SANPAHProteoChem of Thermo Fisher, (Rockland, IL)
proteochem.com of thermofisher.com		C111 of 22589Bereid een 0,315 mg/ml oplossing in water direct voor gebruik. Los op bij 37 °C en steriliseer met filter. Het is normaal om onopgelost sulfo-SANPAH in het filter waar te nemen. Sulfo-SANPAH is lichtgevoelig en daarom moet de oplossing worden beschermd tegen licht tot UV-blootstelling.
Poly-D-Lysine (PDL)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)P6407Bereid een 0,2 mg/ml oplossing in water en steriliseer met filter.
Collageen Type IAffymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com		13813Bereid een 0,2 mg/ml oplossing in 0,2 N azijnzuur. Oplossing moet altijd koud blijven om polymerisatie te voorkomen. Azijnzuur is ontvlambaar, giftig en corrosief.
22 x 60 dekglazenFisher Scientific (Pittsburg, PA)12-544-G
Positief verplaatsingspijpGilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com		F148504
WarmteblokFisher Scientific (Pittsburg, PA)11-718
UV lichtbronPlaats gels zo dicht mogelijk bij de UV lichtbron. UV licht kan huid- of oogletsel veroorzaken.
ThermometerElk merk.
StikstofgasGTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/		NI 5.0UH-R

Referenties

  1. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).
  2. Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate. Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).
  3. Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides. Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).
  4. Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).
  5. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  6. Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus. J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).
  7. Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane. Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).
  8. Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions. Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).
  9. Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses. Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).
  10. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel. Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).
  11. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel. Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).
  12. Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms. Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).
  13. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel. J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).
  14. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels. J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).
  15. Luo, Y., Shoichet, M. S. Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response. Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).
  16. Marklein, R. A., Burdick, J. A. Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions. Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).
  17. Pelham Jr, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  18. Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density. BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).
  19. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures. J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).
  20. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors. Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).
  21. Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels. Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).
  22. Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat. J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).
  23. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).
  24. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development A growing role for contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).
  25. Wuerfel, J., et al. Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis. Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).
  26. Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response. Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

DNA crossgelinkte hydrogelsbereiding van polyacrylamidegelDNA gelcrosslinkingaflevering van enkelstrengs DNAmodulatie van gel elasticiteitcelkweeksubstratenmechanobiologisch onderzoekdynamische stijfheidscontrolegedrag van fibroblastneuronenimmobilisatie met optische lijm
Bereiding van DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.