Isolatie van kanker stamcellen uit menselijke stalen van prostaatkanker

Samenvatting

De isolatie van kankerstamcellen (KSC) rechtstreeks van menselijke weefsels is voorwaarde voor hun biologische karakterisering. Dit manuscript beschrijft een methode voor de isolatie van prostaat CSC van menselijk weefsel, terwijl ook het verstrekken van tips over het oplossen van moeilijke stappen.

Samenvatting

De kanker stamcellen (CSC) model is aanzienlijk herzien in de afgelopen twee decennia. Gedurende deze tijd CSC geïdentificeerd en rechtstreeks geïsoleerd uit humane weefsels en serieel gepropageerd in immunodeficiënte muizen, meestal via antilichaamidentificatie subpopulaties van cellen en fractionering door flowcytometrie. Echter, de unieke klinische kenmerken van prostaatkanker aanzienlijk de studie van de prostaat CSC uit verse stalen van menselijke tumoren beperkt. We hebben onlangs gemeld de isolatie van prostate CSC rechtstreeks uit humane weefsels door hun HLA klasse I (HLAI)-negatief fenotype. Prostaatkankercellen worden geoogst van chirurgische specimens en mechanisch gescheiden. Een celsuspensie gegenereerd en gelabeld met fluorescent geconjugeerd HLAI en stromale antilichamen. Subpopulaties van HLAI-negatieve cellen eindelijk geïsoleerd met behulp van een flowcytometer. De belangrijkste beperking van dit protocol is het vaak microscopische en multifocale aard vanprimaire kanker in prostatectomie exemplaren. Toch geïsoleerde levende prostaat CSC zijn geschikt voor de moleculaire karakterisatie en functionele validatie door transplantatie in immunodeficiënte muizen.

Inleiding

Intratumorale heterogeniteit wordt beschouwd als een merker voor kanker ¹ zijn. Inderdaad hebben verscheidene mechanismen van intratumorale heterogeniteit beschreven, waaronder genetische mutatie en interacties met de micro. Bovendien kunnen sommige kankers cellulair hiërarchie bevatten met een subpopulatie van kanker stamcellen (CSC) de eigenschappen van tumor-initiërende capaciteit en zelfvernieuwing seriële transplantatie assays ^2-5 vertoont. Aanvankelijk beschreven in hematologische ^{6, 7} borst en hersenen ⁸ maligniteiten zijn CSC ook onderzocht bij prostaatkanker ^9-12 en andere tumortypes ^2-5.

CSC wordt algemeen beschouwd als een cellulaire fractie bij een heterogene populatie ^2-5. Daarom is de functionele en moleculaire karakterisering van CSC is afhankelijk van hun verrijking van bulk populaties. Dienovereenkomstig, tijdens de laatste twee decennia verschillende voldaanhodologies CSC verrijking zijn ontwikkeld die gewoonlijk uit de scheiding van gemerkte populaties door flowcytometrie. Daarnaast is een belangrijke overweging in de studie van CSC is dat de hiërarchische organisatie van weefsels kan worden verstoord door experimentele manipulaties zoals seriële passages in kweek of immunodeficiënte muizen. Hierdoor heeft de directe isolatie van CSC uit humane weefsels ontwikkeld tot een belangrijke methode in het veld CSC.

Prostaatkanker is een belangrijke oorzaak van kanker morbiditeit en sterfte in de Verenigde Staten en over de hele wereld ^13. Daarom is de isolatie en biologische karakterisering van de prostaat CSC is van significant belang. Prostaat CSC zijn eerder verrijkt uit cellijnen, patiënt afgeleid xenotransplantaten, en de patiënt afgeleid lage passage suspensiekweken ^9,10,12,14.

We hebben onlangs meldde de isolatie van prostaat CSC direct uit menselijke chirurgische samples op grond van hun HLAI-negatieve celoppervlak fenotype ^10. Hier hebben we detail de voor het isoleren van deze cellen procedures. Prostaattumoren worden geoogst van chirurgische specimens en maakte in cel suspensies. De cellen worden vervolgens gekleurd met antilichamen tegen HLAI en stromale en levensvatbaarheid markers en CSC worden geïsoleerd door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS). Geïsoleerde CSC kan vervolgens worden gebruikt voor assays die levensvatbare cellen.

Protocol

1. Oogsten en verwerken van menselijke prostaatkankerweefsel van Chirurgische Specimens

1. Bereid twee 50 ml polystyreen conische buizen met 15 ml van Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine.
2. Pathologie onderhoudspersoneel oogsten primaire en metastatische prostaatkanker monsters van prostatectomie en palliatieve chirurgie exemplaren, respectievelijk, op grond van een Institutional Review Board goedgekeurde protocol. Metastatische monsters kunnen worden verkregen uit lymfklierdissecties bij de primaire operatie de wervels tijdens palliatieve chirurgische procedures, zoals ruggenmerg decompressie en de longen tijdens diagnostische verwijderen van enige metastatische laesies, onder anderen.
   1. Oogst overtollige massa weefsel niet noodzakelijk voor klinische diagnostiek in de eerste 50 ml polystyreen conische buis uit stap 1.1 en onmiddellijk bewaren bij 4 ° C. De harvested weefsel moet ten minste een 4-5 cm ² in het gebied en 1-2 cm dikte te meten.
3. Laboratoriumpersoneel verwerken bulk weefsel verkregen van de pathologie dienst ter voorbereiding op histologisch onderzoek en het genereren van cel suspensies.
   1. Verwerking van bulk weefsels mag niet meer dan 24 uur van chirurgische resectie om maximale levensvatbaarheid van de cellen te garanderen.
   2. Werken in een bioveiligheid kast met een steriel scalpel en pincet, neem 2-4 mm dik horizontale coupes van macroscopische tumoren. Onmiddellijk slaan de secties in de tweede 50 ml polystyreen conische buis vanaf stap 1.1.
   3. Bij macroscopische knobbeltjes niet worden gevisualiseerd van prostatectomie monsters, het verzamelen van willekeurige 2-4 mm dik horizontale coupes uit de achterste lobben en overgangszone.
4. Scheid een gedeelte van de chirurgische weefsel met een steriele scalpel en pincet en repareren in 10% formaline voorafgaand aan generatie van celsuspensies. Archief analyseren dit materiaal histologisch de aanwezigheid van prostaatkanker weefsel bevestigen.

2. Generatie Cell Schorsingen van Tissue Secties

1. Werken in een steriele bioveiligheid kast, breng een weefselsectie van een 60 x 15 mm kweekschaal met 1 ml steriele 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
   1. Mechanisch vermaal het monster met behulp van een steriel scalpel en pincet.
   2. Geen enzymatische ontsluitingen zijn in dit protocol.
2. Spoel de suspensie 1 ml in een steriele 50 ml conische buis.
   1. Voeg 1 ml om de cultuur schotel en herhaal de fijnwrijving stap totdat de sectie weefsel volledig wordt gescheiden, meestal 3-4x.
   2. Herhaal deze procedure serieel totdat alle coupes zijn losgekoppeld.
3. Resuspendeer de inhoud van 50 ml polystyreen conische buis met een 5 ml serologische piPette en vortex op maximale snelheid (ongeveer 3200 rpm) gedurende 1 minuut.
4. Filter de resulterende suspensie door een 35-um cel zeef en verzamelen in een tweede steriele 50 ml polystyreen conische buis.
5. Genereer een pellet door centrifugeren bij 450 g gedurende 10 minuten.
6. Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet met 5 ml rode bloedcel lysisbuffer en incubeer de oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de rode bloedcel lysisbuffer door centrifugatie gedurende 5 min bij 450 x g bij kamertemperatuur.
7. Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in 1 x PBS aangevuld met 5% FBS en kwantificeren van het aantal levensvatbare (trypan blauw-negatieve) cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde celteller. Genereer een 1x10 ⁶ cellen / ml suspensie en op te slaan op ijs niet langer dan 1 uur.
   1. De levensvatbaarheid en het rendement van de cellen kan sterk tussen tumorspecimens variëren. In de prostatectomie instelling, kan levensvatbaarheid variëren tussen 45-70%, en five 2-4 mm kan worden verwacht dikke horizontale coupes van een macroscopische tumor knobbeltje ongeveer 3x10 ⁶ levensvatbare cellen opleveren.

3. Antilichaam kleuring van cellen voor FACS

1. Label vijf 15 ml conische buizen van polystyreen zoals hieronder getoond. Gebruik CD45 en CD31-antigeen etikettering om hematopoietische en endotheelcellen elementen respectievelijk uitsluiten.
   1. Onbevlekt
   2. _IgG2a κ-PE + IgG ₁ κ-FITC
   3. HLAI-PE + IgG ₁ κ-FITC
   4. _IgG2a κ-PE + CD31-FITC + CD45-FITC
   5. HLAI-PE + CD45-FITC + CD31-FITC
2. Verdeel de gekwantificeerde celsuspensie uit de vorige paragraaf (stap 2.7) in de vijf buizen in stap 3.1. Voeg de antilichamen in een verdunning van 1:250, en incubeer de celsuspensies op ijs gedurende 30 minuten.
3. Centrifugeer de cellen bij 450 g gedurende 3 min bij 4 ° C en gooi de supernatanten.
4. Was de cellen door resuspenderen elk pellet 1x met steriel PBS gesupplementeerd met 10% FBS, gevolgd door centrifugatie bij 450 xg gedurende 3 min bij 4 ° C.
5. Resuspendeer de cellen in een 1 ml oplossing van 1x PBS met 4 ',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) bij een concentratie van 10 ug / ml.
6. Filter de uiteindelijke oplossing door 35 micrometer zeef caps in 12 mm x 75 mm polystyreen buizen.

4. Isolatie van Prostaat CSC door FACS

1. Gebruik een doorstroomcytometer voor celsortering.
2. Temperatuurregelknoppen compensatie cuvetten van buizen # 1, # 2, # 3 en # 4.
3. Maak poorten die puin en clusters van cellen uit te sluiten met behulp van forward-en side-scatter parameters.
4. Bepaal de FITC en PE-poorten met behulp van de schorsingen van buis # 3 en # 4 buis, respectievelijk.
5. Gate levensvatbare (DAPI-negatief) cellen met behulp van de Pacific Blue-A-kanaal.
6. Met behulp van buis # 5 discard CD31-positieve en CD45-positieve cellen enverzamelen zowel HLAI-negatieve en HLAI-positieve populatie in steriele 15 ml polystyreen conische buizen met 2 ml RPMI aangevuld met 10% FBS.
7. Centrifugeer de gesorteerde celsuspensies bij 450 xg gedurende 5 minuten en vervolgens resuspendeer de pellets in 200-500 ul RPMI gesupplementeerd met 10% FBS.
8. Kwantificeren levensvatbare (trypaanblauw-negatief) cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celgetalmeter.

Resultaten

Figuur 1. Human prostaatkanker tumor oogsten en flowcytometrie grafiek, die illustreert specifieke populaties uit een menselijke prostaatkanker. (A) Tumor knobbeltjes worden geoogst om een celsuspensie te genereren. Tumor inhoud van het verwerkte monster wordt bevestigd middels conventionele hematoxyline en eosine kleur...

Discussie

Dit protocol beschrijft de isolatie van CSC uit verse menselijke prostaatkankercellen weefsels. Een aantal belangrijke overwegingen invloed op de succesvolle afloop van dit protocol.

Het herstel van de hoge aantallen levensvatbare prostaatkankercellen is afhankelijk van een zorgvuldige bruto evaluatie van chirurgische monsters. In onze ervaring, is de succesvolle isolatie van tumorigenic prostaatcellen best gegarandeerd wanneer macroscopische tumoren worden waargenomen en verwerkt ^10.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RPMI	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetaal bovien serum	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
PBS	Corning Cell Gro	21-031-CM
60 mm, 15 mm Celkweker	Corning	3295
35 µm Celzeef	BD Falcon	352340
50 ml conische buis	Crystalgen	23-2263
15 ml conische buis	Crystalgen	23-2265
Rode bloedcel lyseringsbuffer	Sigma	R7757
HLA klasse I (W6/32) PE antilichaam	Abcam	ab43545
CD31 FITC antilichaam	eBioscience	11-0319-42
CD45 FITC antilichaam	Abcam	ab27287
IgG2aκ PE antilichaam	BD Pharminogen	555574
IgG1κ FITC antilichaam	BD Pharminogen	551954
DAPI	Invitrogen	d3571
12 mm x 75 mm Polystyreen buizen met celzeef dop	BD Falcon	352235
Vortex Mixer	Crystalgen	CG-BV1000
10% Neutraal Buffer Formaline	Fisher	RBBP-0480

```