Consensus Brain-afgeleide eiwit, Extraction Protocol voor de studie van mensen en muizen Brain Proteome behulp Zowel 2D-DIGE en Mini 2DE Immunoblotting

Summary

Een gemeenschappelijke eiwitextractie protocol met behulp van ureum / thioureum / SDS buffer voor menselijke en muizen hersenweefsel maakt het identificeren van eiwitten door 2D-DIGE en de daaropvolgende karakterisering door mini 2DE immunoblotting. Deze methode maakt een meer reproduceerbare en betrouwbare resultaten te verkrijgen van menselijke biopsies en experimentele modellen.

Abstract

Tweedimensionale gelelektroforese (2DE) is een krachtig hulpmiddel om proteoom veranderingen mogelijk gerelateerd aan verschillende fysiologische of pathologische omstandigheden duidelijk worden. In principe is deze techniek gebaseerd op de scheiding van eiwitten op basis van hun iso-elektrisch punt in een eerste stap, en anderzijds naar hun molecuulgewichten door SDS polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE). In dit rapport wordt een geoptimaliseerd monstervoorbereiding protocol voor kleine hoeveelheid menselijke post-mortem en muis hersenweefsel wordt beschreven. Deze methode maakt het mogelijk om zowel tweedimensionale fluorescentie verschil gelelektroforese (2D-DIGE) en mini 2DE immunoblotting voeren. De combinatie van deze benaderingen kan men niet alleen nieuwe eiwitten en / of eiwitmodificaties voorbeeld in hun expressie door de compatibiliteit met massaspectrometrische detectie, maar ook een nieuw inzicht in markers validatie. Zo, mini-2DE gekoppeld aan western blotting vergunningen om bericht te identificeren en te valideren-Translationele modificaties, eiwitten katabolisme en geeft een kwalitatieve vergelijking tussen verschillende omstandigheden en / of behandelingen. Hierin geven we een methode om onderdelen van eiwitcomplexen gevonden in AD en Lewy body dementie, zoals de amyloïd-beta peptide en de alfa-synucleïne bestuderen. De werkwijze kan dus worden aangepast voor de analyse van het proteoom en onoplosbare eiwitten extraheren uit menselijk hersenweefsel en muismodellen ook. Tegelijkertijd kan het nuttige informatie voor de studie van moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij neurodegeneratieve ziekten als potentiële nieuwe biomerkers en therapeutische targets.

Introduction

Psychische en neurologische aandoeningen vertegenwoordigen 13% van de wereldwijde ziektelast, moet nieuwe uitdagingen zoals pathofysiologische mechanismen, risicofactoren en prodromale biomarkers worden onderzocht ^1. In lijn met deze doelstelling, proteomics studies van het menselijk brein onmisbaar geworden moleculaire pathways betrokken bij processen zoals geheugen, gedrag, emoties en neuronale plasticiteit bijvoorbeeld, niet alleen voor de fysiologische, maar ook voor pathologische omstandigheden duidelijk worden. Daarom is het gebruik van diermodellen en meer specifiek de transgene muizen, brengt een groot aantal mogelijkheden om de etiologie van human....

Protocol

1. Homogenisering en Total Eiwitextractie van de mens en de muis hersenweefsel

1. Hersenweefsel homogenisering. Homogeniseer het hersenweefsel 10% (w / v) in 8 M ureum, 2 M thioureum en 1% w / v SDS buffer (UTS) met een potter glas (menselijke monsters) of Teflon homogenisator (voor muizen monsters). Ultrasone trillingen bij 60 Hz 30 pulsen met een ultrasone generator toepassing van 0,5 sec voor volledige desintegratie weefsels ^{13, 14.}
   1. Bepaal eiwitconcentratie met Bradford assay, met behulp van BSA als standaard. Dit UTS buffer extractie is volledig compatibel met een dimensie SDS-PAGE zolang lysates zijn niet over-verhit tot carbamylering....

Results

Proteomics on hersenweefsel blijft een uitdaging omdat geen ideale buffer bestaat om 100% van eiwitten, in het bijzonder membraan-geassocieerde eiwitten van het cytoskelet of herstellen. De eerste reeks experimenten waren gericht op de zoektocht naar een geschikte lysebuffer compatibel met de twee benaderingen en die het mogelijk maakt om een ​​groot panel van eiwit te herstellen. Zo werden drie lysis buffers onderzocht op de meest geschikte bepalen. Eerst werd het gebruikt gemeenschappelijke biochemische en moleculaire.......

Discussion

Het ontdekken van pathologische expressie veranderingen van eiwitten, zoektocht naar biomarkers en de modulatie van mogelijke pistes voor farmacologische doelwitten behoren tot de doelstellingen van de Neuroproteomics benadert ^30. Temidden van de opkomende instrumenten, het veld 2DE voegt een veelbelovende afwachtend. Niettemin moet een consensus om variabiliteit te minimaliseren en verhoging reproduceerbaarheid in de experimenten worden bereikt. In het verlengde van dit idee een gestandaardiseerd protocol om.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo	GE Healtcare	25-8010-65
Immobiline DryStrip	GE Healtcare		Reference in function of the pH interval/size
IPG Buffer, pH X-X	GE Healtcare		Reference in function of the pH interval desired
AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1	GE Healtcare	551797N
DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l	GE Healtcare	17-1335-01
KIT BOX IPG 1 * 1 KIT	GE Healtcare	28-9334-92	Plastic box to make the passive rehydration
MILLEX GS Filter	Millipore	SLGS033SB
Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)	Bio-Rad		Reference in function of the MW to separate
IPGphor III Isoelectric Focusing Unit	GE Healtcare	11-0033-64
Ettan DALTsix Large Electrophoresis System	GE Healtcare	80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm	Gel Company	P2D1.5