Hier beschrijven we een protocol met behulp van de mini-himar1 mariner-transposon mutagenese voor het genereren van een hoge dichtheid insertiemutant bibliotheek scherm, isoleren en identificeren van nieuwe alginaat toezichthouders in de prototypische Pseudomonas aeruginosa stam PAO1.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Identificatie van nieuwe genen geassocieerd met alginaat Productie in
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Pseudomonas aeruginosa is een Gram-negatieve, milieu-bacterie met veelzijdige metabolische mogelijkheden. P. aeruginosa is een opportunistische bacteriële pathogenen die chronische longinfecties bij patiënten met cystische fibrose (CF) stelt. De overproductie van een capsulair polysaccharide genoemd alginaat, ook wel mucoidy, bevordert de vorming van slijmerige biofilms die resistenter dan plankton cellen antibiotische chemotherapie en het afweersysteem zijn. Bovendien, de conversie van de nonmucoid tot mucoïde fenotype is een klinische merker voor het ontstaan van chronische infectie bij CF. Alginaat overproductie door P. aeruginosa is een endergonic proces dat zwaar belast cellulaire energie. Daarom wordt alginaat productie sterk gereguleerd in P. aeruginosa. Om beter te begrijpen alginaat regelgeving, een protocol beschrijven we het gebruik van de mini-himar1 transposon mutagenese voor de identificatie van nieuwe alginaat regulators in een prototype stam PAO1. De procedure bestaat uit twee fasen. Eerst hebben we overgedragen de mini-himar1 transposon (PFAC) van gastheer E. coli SM10/λpir in ontvangende P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugatie een hoge dichtheid insertiemutant bibliotheek, die werden geselecteerd op Pseudomonas isolatie agarplaten aangevuld met gentamycine maken. Ten tweede hebben we afgeschermd en geïsoleerd van de slijmerige kolonies op de plaats van inbrengen in kaart door middel van omgekeerde PCR met behulp van DNA-primers naar buiten wijzende uit de gentamycine cassette en DNA-sequencing. Met behulp van dit protocol, hebben we twee nieuwe alginaat regulatoren, MUCE (PA4033) en kinB (PA5484), in stam PAO1 met een wild-type muca codeert voor het anti-sigmafactor muca voor de master alginaat regulator AlgU geïdentificeerd (ALGT, σ 22) . Deze hoog-mutagenese protocol kan worden aangepast voor het identificeren van andere virulentie genen veroorzaken veranderingen in colony morfologie.
Inleiding
Het vermogen van de opportunistische, Gram-negatieve pathogeen Pseudomonas aeruginosa te alginaat overproductie is een belangrijke factor in het vermogen om een biofilm stellen. De overproductie van alginaat is een fenotype vaak aangeduid als mucoidy. De isolatie van slijmerige kolonies van de sputa van personen die lijden aan cystische fibrosis (CF) is een indicatie van een chronische infectie, en is rechtstreeks verbonden met een algemene daling van de gezondheid van de patiënt 1. Momenteel wordt ervan uitgegaan dat de verordening en de productie van alginaat in P. aeruginosa treedt vooral op bij twee operons. De eerste is het alginaat biosynthetische operon, die 12 genen bevat (algD - alg8 - alg44 - algK - Alge - algG - Algx - algL - Algi - algJ - algF - Alga) dat verantwoordelijk is voor de synthese en de uitvoer van het alginaat polymeer over zijn het periplasma aan het extracellulaire environment 2-5. De tweede operon is een cluster van genen te beginnen met de alternatieve sigma factor algU / T en verder met muca, mucB en mucD. AlgU / T is een positieve regulator, terwijl mucAB-D worden geclassificeerd als negatieve regulatoren van alginaat productie 6-8. Bovendien, transcriptiefactoren, zoals ALGB, AlgQ, ALGr en RpoN, alsmede post-transcriptionele en post-translationele modificatie van katabolische repressie controle kinaseactiviteit (KinB) en intramembrane proteolyse, zijn ook getoond betrokken te zijn bij alginaat regelgeving 9-14.
De mini-himar1 transposon vector bekend als PFAC werd oorspronkelijk opgericht in Dr Mekalanos 'laboratorium aan de Harvard Medical School 15. De PFAC plasmide bestaat uit een transposon geflankeerd door twee omgekeerde herhalingen van 27 bp en een weerstand tegen gentamycine cassette in het midden (aacC1: 534 bp), een gen coderend voor het hyperactive mariner transposase 16, en een gen dat codeert voor β-lactamase (bla) (figuur 1). Sequentie-informatie voor de transposon van PFAC is verkrijgbaar bij de GenBank: DQ366300 13. In PFAC er een meervoudige kloneringsplaats (MCS) dat de aacC1 gen dat wordt gebruikt voor de identificatie van chromosomale insertieplaats middels omgekeerde PCR. Een groot voordeel met behulp van de mini-himar1 transposon is geen specifieke gastheer factoren zijn nodig voor de omzetting (mutagenese). Daarnaast is er een grote dichtheid aan de TA dinucleotide insertieplaatsen gevonden in het genoom van P. aeruginosa. Bijvoorbeeld, TA dinucleotide insertieplaatsen optreedt 94.404 en 100.229 keer in de PAO1 (6.264.404 bps, GenBank NC_002516.2) en PA14 (6.537.648 bps; GenBank toegangsnummer NC_008463) genomen, respectievelijk. Vanwege de overvloed van TA dinucleotide in het genoom, mini-himar1 Transposon kan hoge dichtheid en willekeurige mutagenese, die bijzonder geschikt voor de analyse van virulentie genen en genen die sterk gereguleerd veroorzaken. Theoretisch kan de mini-himar1 transposon te voegen in elke niet-essentieel gen in het genoom van P. aeruginosa. Dit levert ongeveer 18 TA insertieplaatsen per open reading frame in de PAO1 genoom.
Hier, een protocol beschrijven we het gebruik van mini-himar1-transposon mutagenese om nieuwe regulatoren van mucoidy in P. identificeren aeruginosa. Meer specifiek, we biparentally geconjugeerd de PFAC vector die een mini-himar1 transposon van E. coli SM10/λpir in de nonmucoid prototrofe stam PAO1. Nadat de transposon is geïntegreerd in het genoom, de ontvangende stam wordt gekweekt op Pseudomonas isolatie agar (PIA) die triclosan die de groei van E. remt coli. Zo een bibliotheek van mutanten van P. aeruginosa kan de groei geselecteerd op PIA plaat aangevuld met gentamycine en de aanwezigheid van de mucoïde fenotype. Let op, een echte transposon-gemedieerde versus een integratie mutant zal een gentamycine resistent en carbenicilline-gevoelige fenotype hebben. In deze studie werden ongeveer 80.000 insertiemutanten van PAO1 geïsoleerd door middel van vier afzonderlijke vervoegingen. We vervolgens gescreend op mucoïde isolaten, en bepaalde de plaats van invoeging door restrictie-enzym digestie, ligatie en omgekeerde PCR. We voerden Southern blot analyse met behulp van weerstand tegen gentamycine cassette als een probe voor het aantal insertie per genoom bekijken. We hebben vastgesteld dat meer dan 90% van mutanten verkregen per conjugatie met dit protocol had slechts een enkele kopie van het himar1 in het genoom en de weergegeven gentamycine resistente en carbenicilline-gevoelige fenotype. Een totaal van 32 mucoïd isolaten werden geïdentificeerd, 22 van hen werden toegewezen aan verschillende loci van de P. aeruginosa PAO1chromosoom. Dit tarief van inbrengen biedt voldoende dekking om verschillende nieuwe regulatoren van alginaat overproductie identificeren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van Bacteriestammen en biparental Vervoeging
- Inoculeren E. coli SM10/λpir/pFAC in 5 ml Luria Broth (LB), aangevuld met 15 ug / ml gentamycine en in een incubator schudden overnacht bij 37 ° C.
- Inoculeren P. aeruginosa stam PAO1 in 5 ml LB, en plaats in een incubator schudden gedurende de nacht bij 42 ° C.
- Meet OD 600 overnachtende culturen en meng gelijke hoeveelheden PAO1 en E. coli PFAC zodat het uiteindelijke volume van 1-1,4 ml.
- Centrifugeer mengsel bij 6000 xg gedurende 5 minuten.
- Ondertussen drogen LB-platen om de vervoeging: laat platen geopend in de broedstoof bij 37 ° C gedurende 10-15 minuten.
- Verwijder alle 50 pl supernatant van celmengsel.
- Resuspendeer de celpellet in de resterende 50 pl supernatant en pipet op een droge LB plaat in een compact druppel.
- Plaats voorzichtig de plaat in een zuurkast te drogen (IMPORTANT Opmerking: Laat cellen verspreid over de plaat, dit zal aanzienlijk de efficiëntie van de vervoeging verlagen).
- Nadat de druppel droog is, keren de LB plaat en incubeer bij 37 ° C gedurende 4-6 uur.
- Terwijl de cel mengsel te incuberen, bereiden groot (OD 150 x 15 mm) PIA platen met 300 ug / ml gentamycine. Verwijder voor gebruik eventuele resterende vocht door in een incubator bij 37 ° C gedurende 15-20 minuten.
- Na de incubatie van de cel mengsel voltooid, verzamel de cellen met een steriele entoog en in een microcentrifugebuis met 1 ml LB en vortex of pipet, grondig te mengen.
- Spreid de cellen gelijkmatig op de grote PIA platen bevatten 300 ug / ml gentamycine. (BELANGRIJK: Voor deze stap is het best om grotere hoeveelheden van de cel mengsel toevoegen aan platen te scheiden (bijv. Plaat 1: 10 pl, Plaat 2: 50 ui, Plate 3: 100 ul, Plaat 4: 500 ul, enz.) .
- Incubeer overnacht bij 37° C.
2. Detectie en isolatie van Mucoïde Kolonies
- Verwijder platen uit incubator en onderzoeken voor slijmerige kolonies.
- Isoleer een slijmerige kolonie en strook voor isolatie op kleine bordjes (100 OD x 10 mm) met PIA en 300 ug / ml gentamycine.
- Incubeer overnacht bij 37 ° C.
- Herhaal stap 2.2 op de vorige overnacht cultuur.
- Herhaal stap 2.2-2.4 twee keer de stabiliteit van de slijmerige isolaat te bepalen.
- Na de laatste stap isolaat, enten 4,5 ml LB met een mucoïde kolonie en incubeer in shaker overnacht bij 37 ° C.
- De volgende dag, label 3 microcentrifugebuizen voor elke slijmerige mutant.
- Bereid twee 1,25 ml porties van overnacht cultuur in 2 buizen voor genomische DNA-extractie en identificatie van de transposoninsertie website (zie Protocol nr. 3).
- Daarnaast archiveren elk slijmerige mutant door pipetteren 1 ml overnacht cultuur in een appropriately-gemerkte cryovial die een gelijk volume 10% magere melk. Bewaren bij -86 ° C.
3. gDNA restrictiedigestie en eileiders
- Uittreksel gDNA van mucoïde mutant met elke voorkeurswerkwijze (bijv.. Fenol-chloroform, spinkolom, enz.).
- Bepaal de concentratie van de gDNA, verteren totaal 2 ug met 1 pl van het restrictie-endonuclease SalI, 0,5 ul runderserumalbumine, 5 gl enzym SalI buffer (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2 , 1 mM Dithiothrietol (DTT), pH 7,9 bij kamertemperatuur), en het geschikte volume van dH 2 O tot een totaal volume van 50 pl te bereiken.
- Verteren DNA overnacht bij 37 ° C. (Belangrijk:. Afhankelijk van de efficiëntie van het restrictie-enzym, kan het noodzakelijk zijn een extra 1 ui aan de digest en incubeer overnacht bij 37 ° C gedurende 1-2 uur Dit komt bovenop de nacht digest.)
- Zuiver het DIGEsted DNA met elke voorkeurswerkwijze (bijv. agarose gel zuivering rotatie kolommen) en elueer met 25 ul buffer.
- Ligeren van de gedigereerde DNA door het mengen 11 pl gezuiverd DNA met een gewenste concentratie van ~ 10-20 ng / ul, 1,5 ui ligatiebuffer (330 mM Tris-acetaat pH 7,5, 660 mM kaliumacetaat, 100 mM magnesiumacetaat, 5 mM DTT), 1,5 gl 100 mM ATP en 1 pi DNA ligase.
- Incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geroerd en vervolgens inactivatie van het enzym door incubatie gedurende 15 minuten bij 70 ° C. (Opmerking: het incuberen van het mengsel bij kamertemperatuur gedurende langer kan het succes van de ligatie verhogen).
4. Omgekeerde PCR (iPCR) en Sequence Analysis
- Voer iPCR op ligatieproduct met de volgende voorwaartse en achterwaartse primers en thermocycling voorwaarden:
-Forward Primer (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
-Reverse Primer (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
Thermocycler Condities:
1. 94 ° C gedurende 1 minuut.
2. 94 ° C gedurende 1 minuut.
3. 58 ° C gedurende 2 minuten.
4. 72 ° C gedurende 2 minuten.
5. 72 ° C gedurende 8 minuten.
6. 10 ° C te houden.
Herhaal de stappen 2-4 voor 34 cycli.
(NB: Amplified iPCR producten kunnen bij 4 ° C worden bewaard) - Voer agarosegelelektroforese succesvolle amplificatie iPCR bevestigen.
- Voer sequencing op het iPCR product met de Gm3OUT en Gm5OUT primers. Het inbrengen site en de oriëntatie van himar1 in kaart gebracht.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Zoals weergegeven in figuur 1, de mini-transposon himar1 mariner vector, PFAC bevat twee 27 bp omgekeerde herhalingen met TA insertieplaatsen flankeren de aacC1 gentamycineresistentiegen cassette, met σ 70-afhankelijke promoter, en een meervoudige kloneringsplaats (MCS). Bovendien, de PFAC vector bevat genen die voor de zeer actieve himar1 transposase, β-lactamase (bla) en de tra overdracht operon. De TA insteekopeningen zorgen voor een efficiënte ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het is belangrijk op te merken dat deze methode kan worden gebruikt in andere Pseudomonas species met deze aanpassingen: incuberen P. fluorescens en P. putida bij 30 ° C en P. stutzeri bij 42 ° C; P. stuzeri worden gekweekt op LB-platen gesupplementeerd met 150 ug / ml gentamycine, in stap 1.11, blz. stutzeri cellen worden overgebracht in 500 ui LB plaats van 1 ml. Daarnaast zijn er twee belangrijke stappen voor dit protocol. Ten eerste moet de ontvangende stam gekwe...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteur Hongwei D. Yu is de Chief Science Officer en medeoprichter van Progenesis Technologies, LLC.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Aeronautics and Space Administration West Virginia Space Grant Consortium (NASA WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) en NIH P20RR016477 en P20GM103434 aan de West Virginia IDeA Network for Biomedical Research Excellence. Wij danken Vonya M. Eisinger voor de technische ondersteuning bij dit werk.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolatie-agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Kleine platen (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Grote platen (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Benchtop schudkweekincubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | schudden bij 200 rpm |
| Incubatorkast | VWR | 1540 | |
| Benchtop microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrofotometer | Bio-Rad | 170-2525 | of voorkeursmethode/leverancier |
| Wegwaarneembare inoculatiesluizen | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1,5 ml microcentrifugebuisjes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2,0 ml cryogeen vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 15 ml buisjes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | of voorkeursmethode/leverancier |
| QIAquick PCR-zuiveringskit (250) | Qiagen | 28106 | of voorkeursmethode/leverancier |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | of voorkeursmethode/leverancier |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, restrictie-endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2,0 ml cryogeen vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
Referenties
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
- Chitnis, C. E., Ohman, D. E. Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure. Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).
- Franklin, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase. J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).
- Franklin, M. J., Ohman, D. E. Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).
- Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).
- Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity. Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).
- Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor. J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).
- Browne, P., Barret, M., O'Gara, F., Morrissey, J. P. Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria. BMC Microbiol. 10, 300 (2010).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).
- Damron, F. H., et al. Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN. J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).
- Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).
- Schurr, M. J. Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate. J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).
- Wong, S. M., Mekalanos, J. J. Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).
- Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
