Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Voorbereiding van de Primaire Myogene Precursor Cell / myoblast Culturen van Basal gewervelde Geslachten

20.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51354

⸱

30 april 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham, 2Nutrition Métabolisme Aquaculture, INRA UR1067, 3Laboratoire de Physiologie et Genomique des Poissons, INRA UR1037

In dit artikel

Samenvatting

In vitro cultuur systemen onmisbaar voor ons begrip van gewervelde myogenese bewezen. Er moet echter nog veel te leren over nonmammalian skeletspieren ontwikkeling en groei, met name in de basale taxa. Een efficiënte en robuuste protocol voor isolatie van de volwassen stamcellen van dit weefsel, de myogene voorlopercellen (MTR), en met behoud van hun zelf-vernieuwing, proliferatie en differentiatie in een primaire kweek instelling maakt de identificatie van geconserveerde en afwijkende regelmechanismen gedurende de gewervelde geslachten.

Samenvatting

Vanwege de inherente moeilijkheden en tijd die met het bestuderen van de myogene programma in vivo primaire kweek toepassen die van een bewoner volwassen stamcellen van skeletspieren, de myogene voorlopercellen (MPL) zijn onmisbaar voor ons begrip van zoogdierlijke skeletspieren ontwikkeling bewezen groei. Vooral onder de basale taxa van Vertebrata echter gegevens zijn beperkt beschrijven van de moleculaire mechanismen die de zelf-vernieuwing, proliferatie en differentiatie van de mediterrane partnerlanden. Van bijzonder belang zijn mogelijke mechanismen die het vermogen van basale gewervelde dieren aanzienlijke postlarval skelet myofiber hyperplasie (dwz beenvissen) en volledige regeneratie ondergaan volgende aanhangsel verlies (dwz urodele amfibieën) ten grondslag liggen. Daarnaast kan het gebruik van gekweekte myoblasts helpen bij het begrijpen van de wedergeboorte en de reprise van het myogene programma en de verschillen tussen hen. AanDaartoe hebben we in detail een robuust en efficiënt protocol (en variaties daarin) voor het isoleren en onderhouden MTR en hun nageslacht, myoblasten en onvolwassen myotubes in celkweek als platform voor het begrijpen van de evolutie van het myogene programma, beginnend met meer basale vertebraten. Voortbouwend op het modelorganisme status van de zebravis (Danio rerio), rapporteren we over de toepassing van dit protocol om kleine vissen van de karperachtigen clade Danioninae. In tandem, kan dit protocol worden gebruikt om een bredere vergelijkende benadering te realiseren door het isoleren van de mediterrane partnerlanden van de Mexicaanse axolotl (Ambystomamexicanum) en zelfs knaagdieren. Dit protocol wordt nu op grote schaal gebruikt in het bestuderen myogenesis in verschillende vissoorten, waaronder regenboogforel, zalm, en zeebrasem 1-4.

Inleiding

Aanzienlijke kennis van zoogdieren myogenesis is verkregen door de reprise van dit proces in zowel primaire muis (Mus musculus) myoblast culturen en de goed beschreven-muis afgeleide cellijn, C2C12 5. Beginnend in 1950 6, hebben deze culturen geleid tot veel vooruitgang in het inzicht in de murinemyogenic programma en daarmee, myogenese in andere vertebraten. Bovendien eencellige myofiber explantaat technieken begrijpen van de interacties tussen satelliet cellen en omliggende myovezels 7-9 verhoogd uit. Celculturen worden bijzonder aantrekkelijk voor onderzoek van myogenese vanwege de korte tijd van precursor gedifferentieerde cel 10, relatieve gemak van transfectie van RNAi 11-14, transgene 15,16 en overexpressie 14,17,18 studies, in vitro expansie, gevolgd door in vivo implantatie 18-20, en zelfs compArison van myogene voorloper cellen en hun regulerende agenten verspreid over taxa 21,22. Hoewel verschillen vanwege de kunstmatige omgeving van het kweeksysteem beschreven 5,23, hebben deze in vitro systemen bewezen onmisbaar onze dissectie van de ingewikkelde programma voor de vorming van meerkernige worden, terminaal gedifferentieerde myofibersfrom mononucleaire proliferatieve progenitorcellen bekend als myosatellite cellen (MSC) van de zoogdieren.

Buiten de klasse Mammalia, echter, het behoud en / of de divergentie van mechanismen die de myogenesis zijn slecht begrepen, grotendeels te wijten aan de moeilijkheid in het kweken van myogene voorloper cellen (MTR) en myoblasts uit verschillende taxa. Inderdaad, primaire myoblast alleen culturen beschreven in drie vogels 24-26, een reptiel 27, een paar amfibieën 28-30, en sommige vissen 1,3,4,31-33. Continue myogene cellijnen van veanders dan knaagdieren 34-36 rtebrates zijn nog zeldzamer, met de enige niet-zoogdieren myogene cellijn wordt afgeleid van de Japanse kwartel (Cortunix japonica), QM7 37. Ondanks vele pogingen tot immortalisatie, een teleost myogene cellijn blijft ongrijpbaar en een protocol voor efficiënte transfectie van deze cellen werd pas dit jaar 15 gepubliceerd. Zo helder en goed geoptimaliseerde protocollen voor het kweken van primaire MTR en myoblasten uit een verscheidenheid van gewervelde dieren zijn hard nodig om niet alleen verder onze kennis van de evolutie van het myogene programma uit te breiden, maar om de kracht van vergelijkende fysiologie in dienst om doorbraken te maken in de behandeling van menselijke skeletspier ziekten en aandoeningen.

Terwijl de literatuur bevat veel meldingen van MPC / myoblast isolatie 38-49, is het gebruikelijk voor auteurs om de protocollen voor dergelijke isolaties beschrijven in het kort, vaak onvolledig, formaten. Verder is de meest leerzame protocollen reported zijn ontwikkeld voor muizen 50-53, en sommige van deze beroepen op antilichaam selectie 54,55 of fluorescentie transgenen 56,57, waardoor deze protocollen onbruikbaar of onpraktisch binnenste niet-knaagdieren gebruikt door de spieren biologen. Met weinig bekend over piscine, amfibieën en reptielen myogenesis, een gedetailleerde en grondige protocol, beschreven met audiovisuele begeleiding en met bewezen efficiëntie in ver verwante soorten, zouden de meeste die aan de orde zijn.

Voor het eerst beschreven door Powell en collega's in 1989 58, werd de volgende protocol in eerste instantie ontwikkeld om MTR en myoblasts isoleren van zalmachtigen (namelijk, regenboogforel, Oncorhynchus mykiss, en Atlantische zalm, Salmo salar) en enkele grotere karperachtigen (dwz goudvis, Carassiusauratusauratus) . In 2000, Fauconneau en Paboeuf geoptimaliseerd een primaire myoblast cultuur voor regenboogforel 59 en minoroptimizations made dat protocol bruikbaar in meerdere kleinere visjes van de Danioninae clade (zebravis, Danio rerio, en gigantische danio, Devario aequipinnatus) 32 als gevolg van de vele genetische tools beschikbaar voor zebravis werk en dus zijn naaste familieleden. Beenvissen aantrekkelijk organismen studie vanwege hun uiteenlopende groeistrategie (althans in de meeste soorten). Grote zalmachtigen, net als de meeste vissen, groeien van onbepaalde, met groeipotentieel bezitten die een asymptoot op de vervaldag, zelfs op hoge leeftijd 60-62. In tegenstelling tot de zebravis, grote danionins zoals de reus danio 63 en besnorde groei danio weergave mogelijkheden typisch voor beenvissen, het maken van hun directe nevenschikking een ideaal platform voor het begrijpen of MPC cellot keuze speelt een rol in de skeletspier hyperplasie versus hypertrofie.

Ook hebben we aangetoond dat dit protocol kan worden gebruikt met muizen en axolotl met relatief hoge cel opbrengst vi quateriliteit indices. Urodele salamanders, zoals de Mexicaanse axolotl (Ambystomamexicanum), beschikken over de opmerkelijke vermogen om weefsels te regenereren, met inbegrip van hele ledematen en staarten 64-66. Deze eigenschap maakt deze amfibieën interessante modellen van de skeletspieren verspillen en veroudering. De hieronder beschreven protocol, kan een soortgelijke benadering worden uitgevoerd zoals is gedaan in vele vissoorten, waardoor een nog grotere vergelijkende context voor deze studies. Zoals velen echt vergelijkende biologen waarderen, de meest betekenisvolle vooruitgang in de fundamentele biologie en translationele medische biologie kan worden gemaakt wanneer de gegevens worden geanalyseerd binnen het breedste spectrum (hier, de gehele gewervelde lineage).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Ethiek Verklaring: Alle experimenten met gewervelde dieren hierin beschreven werd vooraf goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Alabama in Birmingham en is in overeenstemming met de door het Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health van de richtlijnen van de VS Department of Health and Human Services.

1. Voorbereiding voor Cultuur

  1. Bereid de basis medium als volgt: 9 mM NaHCO3 (1,51 g per 2 L), 20 mM HEPES (9,53 g per 2 L) in DMEM (13.48 g / L; 26,96 g per 2 L).
    1. Bepaal de pH en stel 7,40 met HCl of NaOH.
    2. Bepaal osmolaliteit en breng de ~ 300 mOsm met NaCl (indien nodig).
    3. Filter steriliseren met behulp van (2) 1 L vacuüm sterilisatie systemen en bewaar bij 4 ° C beschermd tegen licht, tot 2-3 maanden.
      OPMERKING: Zie de tabellen 1 en 2, volledige reagens, gereedschappen, consumAbles en apparatuur informatie.
  2. Bereid poly-L-lysine behandelde platen door 5 mg-γ bestraalde poly-L-lysine (> 300.000 mw) in 50 ml ultrazuiver steriel water. Meng voorzichtig door inversie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur waarbij volledige ontbinding van lysine polymeren.
  3. Pipetteer de benodigde hoeveelheid poly-L-lysine oplossing in elk putje, afhankelijk van het plaattype (Tabel 3). Laat platen in laminaire stroming kap tot 5 minuten staan.
  4. Verwijder vervolgens poly-L-lysine-oplossing en tweemaal spoelen met steriel water. Laat platen drogen in laminaire stroming kap gedurende 20 minuten.
  5. Verkrijgen 1 mg laminine (Engelbreth-Holm-Swarm oorsprong) en los op in 50 ml basismedium tot een uiteindelijke concentratie van 20 ug / ml. Breng laminine oplossing poly-L-lysine-behandelde celkweek platen bij 2 ug / cm 2. (Zie tabel 3 voor verschillende plaat maten)
  6. Draai de oplossing om fu zorgenll goed dekking. Seal platen met laboratorium tape en plaats in de incubator voor 24 uur. De incubator moet worden ingesteld op welke temperatuur soorten worden gebruikt (zie Tabel 7), en geen extra gassen moeten worden toegevoegd aan incubator.
    OPMERKING: laminine moet kunnen hechten aan platen gedurende 24 uur voor het zaaien cellen. Doet u dit niet zal resulteren in een slechte tot geen mobiele therapietrouw.
  7. Bereid media zoals beschreven in Tabel 4. Volledige media best voorbereid de dag van gebruik.
  8. Ter voorbereiding van weefsel isolatie, monteren de volgende items en autoclaaf: 300-500 ml beker (s); glazen petrischaaltjes; scalpel handgrepen; pincet (fijn en grof); dissectie schaar; en enkele vellen waterafstotend autoclaaf papier.
    OPMERKING: Voor iedere persoon helpen met de dissectie proces, (2) scalpel handgrepen, (1) pincet (type afhankelijk van persoonlijke voorkeur), (1) dissectie schaar, en (5-10) bladen van waterafstotende autoclaaf papiervoldoende.
  9. Naast de autoclaaf producten hierboven monteren 70% ethanol, een gewichtsverdeling, steriele 50 ml conische buizen (aantal afhankelijk van de grootte van cultuur) en ijs.

2. Tissue Dissection

  1. Voordat u begint, ervoor te zorgen dat een voldoende voorraad van vissen beschikbaar is.
    OPMERKING: De leeftijd van de vis te gebruiken is van cruciaal belang. Terwijl de vis van twee verschillende soorten van soortgelijke gewichten kan zijn, zal een jongere vis van de ene soort meer MPCs dan een oudere vis van een andere soort bezitten. Als algemene regel, jongere exemplaren, vooral bij het werken met zalmachtigen, zijn het beste. Voor danionins, kan vis zo oud als een jaar optimaal worden benut, terwijl zalmachtigen leeftijd van 4-6 maanden of jonger (tot 15 gram) optimaal zijn.
  2. Voor elk 5 g weefsel wordt ontleed, portie 25 ml isolatiemedium in een steriele 50 ml conische buis.
  3. Weeg opnemen massa, en het nummer van de tube (s). Plaats de buisjes op ijs.
  4. Euthanaseren 2-3 visop een door onderdompeling in> 300 mg / L natrium bicarbonaat gebufferde tricaïne methaansulfonaat. Laat opercular beweging te staken gedurende> 5 minuten en dan dompel vis in 70% ethanol (in de steriele bekers) gedurende 30 seconden.
  5. Haal vis uit 70% ethanol en leg op waterafstotende autoclaaf papier. Direct achter de opercula, gebruik een scalpel een oppervlakkige, ondiepe incisie te maken. Verwijder de schalen en de huid door grijpen de huid op de eerder genoemde incisie en trek niet aan de staart van de vis.
  6. Na verwijdering huid, accijnzen de ebaxiale, fast-glycolytisch 'witte' spieren van de vis aan beide kanten (het vermijden van de slow-oxidatieve 'rode' spieren gelegen in de buurt van de laterale lijn) en plaats in isolement medium. Gooi de rest van de vis zoals vereist door instelling.
    OPMERKING: Hoewel het heel goed mogelijk om cultuur MPCs afkomstig van rode spier, bijna elke publicatie behulp teleost MPCs heeft gebruikt cellen geïsoleerd uit de ebaxiale myotome.
  7. Herhaal stappen 2.4-2.6 totdat een hoeveelheid van spieren verkregen. Tijdens de dissectie, ervoor zorgen dat gepoolde spierweefsel blijft op het ijs om levensvatbaarheid van de cellen te behouden.

3. Mechanische Dissociatie

  1. Giet een tube van 25 ml / 5 g spierweefsel in een glazen petrischaal. Met behulp van twee scalpel omgaat met aangehechte # 10 scalpelmesjes, gehakt weefsel om een ​​suspensie of moes consistentie. A "heen-en-weer" beweging van de mesjes trekken langs elkaar beste werkt.
    OPMERKING: Terwijl weefsel homogeniseerders passend lijkt, zal het aantal levensvatbare cellen drastisch worden verminderd, zo niet afgeschaft.
  2. Met behulp van een 25 ml serologische pipet en serologische pipet, verwijder de gesuspendeerde weefsel en vervangen in de oorspronkelijke conische buis.
  3. Herhaal de stappen 3,1-3,2 totdat alle weefsel in alle buizen mechanisch is losgemaakt.
  4. Centrifugeer weefsel gedurende 5 minuten bij 300 g en 10 ° C.
  5. Follwegens centrifugeren, gooi de 25 ml media supernatant met een 25 ml serologische pipet, vacuüm aspirator, of door zorgvuldige decanteren.
  6. Voeg 25 ml wasmedium aan elke buis, resuspendeer weefsel en recentrifuge hierboven.
  7. Twee keer wassen met wash medium, het verwijderen van het supernatant telkens.

4. Enzymatische Dissociatie

  1. Tijdens stap 3.4, bereiden collagenaseoplossing door het combineren van 0,22 g Type IV collagenase en 44 ml base medium (of voldoende hoeveelheid op 0,11 g/0.22 ml).
  2. Roer in een bekerglas gedurende 10-15 minuten bij 4 ° C. Filter steriliseren met een 50 ml spuit en een 0,45 pm spuitfilter.
    OPMERKING: Meer dan een spuitfilter kan nodig zijn, afhankelijk van het collagenase preparaat. Collagenase verkregen van andere dan Worthington Biochemical verkopers vormt meer moeite bij het filtreren. Collagenase wordt gebruikt om peptidebindingen dissociëren collageen dat de endomysium vormen. Dezespijsvertering zal dat beschermende barrière van de myovezels verwijderen.
  3. Per g spierweefsel, resuspendeer weefsel in een 0,2% collagenase oplossing. Voor 5 g spierweefsel, voeg 10 ml collagenase-oplossing en 15 ml van de basis medium.
  4. Voeg 10 ul van PSF per ml collagenase oplossing / basismedium (bijv. 250 ul tot 25 ml). Zorg weefsel goed gesuspendeerd, omdat dit de efficiëntie van de enzymatische digestie beïnvloeden.
  5. Incubeer spierweefsel in collagenase gedurende 60 minuten bij 18 ° C met zachte wiegen. Afhankelijk van de mate van mechanische dissociatie en soorten kunnen collagenase digestie worden verlengd tot 90 minuten, hoewel dit cellevensvatbaarheid kunnen beïnvloeden.
  6. Na digereren door collagenase, centrifuge conische buizen bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 12 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer weefsel in 25 ml wasmedium.
  7. Recentrifuge bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 126; C. Herhaal met het wassen medium een ​​tweede keer.
  8. Na het wassen weefsel tweemaal, resuspendeer spierweefsel in 25 ml wassen middelgrote en vermaal met een 10 ml serologische pipet tot het weefsel / medium homogenaat in en uit gaat van de pipet met relatief gemak. 5-10 verwrijvingen is meestal voldoende.
    1. Herhaal dit met een 5 ml serologische pipet en vervolgens een 16 metalen canule bevestigd aan een spuit.
  9. Centrifugeer conische buizen bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 12 ° C. Decanteren supernatant.
  10. Tijdens bovengenoemde 5 minuten centrifugatie bereiden trypsine digestie oplossing combineert 0,25 g trypsine met 5 ml basismedium.
  11. Roer bij 4 ° C gedurende 10-15 minuten en filter gesteriliseerd met een 20 ml spuit en 0,45 urn spuitfilter.
  12. Ophalen conische buizen en voeg 100 ul trypsine oplossing en 4,9 ml dissociatie medium voor iedere 1 g spierweefsel elke buis. Voor EXAmple, voeg 500 ul trypsine oplossing en 24,5 ml dissociatie medium tot 5 g spierweefsel.
    OPMERKING: Trypsine is een serine protease dat myogene voorlopercellen zal scheiden van de basale lamina.
  13. Resuspendeer weefsel in de trypsine / dissociatie medium goed. Incubeer gedurende 20 minuten bij 18 ° C.
  14. Na de eerste trypsine incubatie, centrifuge conische buizen bij 300 xg gedurende 1 min bij 12 ° C.
  15. Neutraliseer trypsine door combinatie van de supernatanten met isolatiemedium bij een concentratie van 1 volume supernatant aan 4 delen isolatiemedium. Bewaar bij 4 ° C gedurende de tweede trypsine digestie.
  16. Om de resterende pellet van weefsel, herhaalt u de stappen 4,12-4,15, het combineren van de bovendrijvende volgende stap 4.15 met het supernatant / isolatie medium vanaf de eerste trypsinedigestie.
  17. Alternatief: De collagenase en trypsine ontsluitingen kunnen worden gecombineerd tot cel opbrengst te maximaliseren.
    1. Hiertoe vermaal de collagenase verteren met een metalen canule (6 lang en 16 gauge werkenbeste) bevestigd aan een injectiespuit 20 ml tot homogenaat gemakkelijk voorbij de canule.
    2. Om het homogenaat, voeg 500 ul trypsine-oplossing (bereid in stap 4.10) en incubeer bij 18 ° C gedurende 20 minuten.
    3. Na de incubatie, centrifuge conische buizen bij 300 xg gedurende 1 minuut bij 12 ° C.
    4. Neutraliseer trypsine door combinatie van de supernatanten met isolatiemedium bij een concentratie van 1 volume supernatant aan 4 delen isolatiemedium.
    5. Bewaar bij 4 ° C gedurende de tweede trypsine digestie.
    6. Ga verder met stap 4.18 als met het standaard protocol.
  18. Doseer de laatste supernatant / isolatie medium mengsel in 50 ml conische buizen en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten bij 12 ° C.
  19. Verwijder de bovenstaande vloeistoffen zorg de cel niet te verstorenpellets. Pipetteer 2 ml compleet medium in elke buis, oplossen elke cel pellet.
  20. Combineer cellen gesuspendeerd in compleet medium in een 50 ml conische buis.
  21. Spoel elke buis met 1 ml compleet medium, gecombineerd met de pool van cellen die hiervoor geresuspendeerd.
  22. Vermaal met een metalen canule en spuit 5-10 keer.
  23. Filter celsuspensie door middel van een 100 um cel zeef, spoelen met compleet medium.
  24. Filter de celsuspensie door een 40 um cel zeef.
  25. Voeg voldoende volledig medium tot 50 ml en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten bij 15 ° C.

5. Tellen, verdunning en Seeding van Cellen

  1. Na de laatste centrifugeren in stap 4.25, verwijder supernatant door voorzichtig decanteren of met een serologische pipet. Resuspendeer de celpellet in 5 ml compleet medium.
  2. Met cellen volledig gesuspendeerd, verwijderen 20 ul; Van de celsuspensie en plaats in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
  3. Voeg 5 ul van Trypan blauwe kleurstof en wacht 5 minuten. Met behulp van een hemocytometer, bepaalt het aantal levensvatbare cellen.
  4. Bij bepaling, verdunnen cellen om de benodigde concentratie. Teleost MTR worden best gezaaid met 150.000-200.000 cellen per cm 2. Voor zes putjes plating strategie verdunnen cellen 1,5 x 10 6 - 2,0 x 10 6 per ml ondersteunt voldoende proliferatie en differentiatie.
  5. Ophalen poly-L-lysine-behandelde, laminine beklede platen en zaadcellen. (Zie tabel 5 voor plaat-specifieke verdunningen en plateren volumes.) NB: Tabel 6 geeft gemiddelde aantal cellen geïsoleerd per gram spierweefsel geïsoleerd uit diverse soorten beenvissen. Regenboogforel (O. mykiss) vertonen minder MPCs per gram spierweefsel dan doen zebravis (D. rerio) en zal daardoor vereisen meer vis te isoleren uit voor een goede zaaien.
  6. Seal platen met laboratorium tape en plaats in koelen incubator op de juiste temperatuur. MPCs van alle hier genoemde (sparen voor muizen) diersoorten kunnen worden geïncubeerd onder normale atmosferische omstandigheden zonder koolstofdioxide (CO 2) suppletie. (Zie Tabel 7.)
  7. Alternatief: Sommige laboratoria hebben een protocol dat vraagt ​​voor het toestaan ​​MPCs te houden aan de cultuur substrata 40 minuten vastgesteld.
    1. Spoel daarna platen met wasmedia aan een losjes verbonden en niet-hechtende cellen te verwijderen. Waarschuwing: Deze stap is zeer belangrijk om "niet-specifieke" hechting van andere cellen (bijv. fibroblasten) aan de kweek substraten voorkomen.
    2. Voeg complete media en plaats cellen in de incubator en de zorg voor zoals hieronder beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Vierentwintig uur na het zaaien, myogene voorloper cellen (MTR) moet zichtbaar bevestigd aan de laminin substraat (zie de figuren 1a en 1d). Na het zaaien, cellen (MTR) stelt een spindel-achtige vorm, wijzen op dit type cel (figuur 1) en zijn MYOD1 + (figuur 2). In Danio soorten, MPCs lijken compacter met kleinere bipolaire processen dan doen MTR van Oncorhynchus en Salmo soorten te zijn. Echter, meer dan vier dagen van cultuu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het myogene programma, in welke onderzochte species, kan het gemakkelijkst bestudeerd via een in vitro systeem. Inderdaad, na isolatie, myogene voorloper cellen (MTR) in vis of myosatellite cellen (MSC) in zoogdieren voer gemakkelijk deze sterk gereguleerde proces, waarbij de proliferatie, celcyclus terugtrekking, en terminale differentiatie van myoblasts en de fusie van die myoblasts in wording myotubes. Het algemene gebrek aan transgene gen reporter stammen van piscine soorten (met de mogelijke uitzondering v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Er is niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag veel dank uit te breiden tot Drs. Josep Planas en Juan Castillo voor hun professionele expertise in de ontwikkeling en toepassing van deze cultuur protocol om kleine vissen en amfibieën. Dank ook aan de talloze mensen die onvermoeibaar hebben geholpen met de dissectie en dissociatie van spierweefsel uit veel vis (zowel in soort en aantal), waaronder Matthew opladen, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily en Sinibaldo Romero. Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Alabama in Birmingham Departement Biologie start-up fondsen, Centrum voor protease Onderzoek NIH Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Grant # R03AR055350 en NDSU Advance FORWARD NSF Grant # HRD-0811239 om PRB. Ondersteuning werd ook door de UAB Nutrition Obesity Research Center award # P30DK056336, NIH NIDDK. De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijshet officiële standpunt van de NIH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Tabel 1. Gedetailleerde Reagensinformatie
ReagensBedrijf (Voorkeur v. Alternatief)Catalogusnummer (Voorkeur v. Alternatief)Hoeveelheid per Cultuur
& gamma;-geïrradieerd poly-L-lysineSigma-Aldrich (MP Biomedicals)P5899 (ICN19454405)5 mg
DMEM (hoge glucose)Sigma-Aldrich (cellgro)MT-50-003-PB (D7777)2 L
LaminineBD Biosciences (Sigma-Aldrich)CB-40232 (L2020)1 mg
Natrium Bicarbonaat (NaHCO3)Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)BP328-500 (S5761)1,51 g
HEPES (C8H18N2O4S)Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)BP310-1 (H6147)9,53 g
Antibioticum/AntimyoticumThermo Scientific (Sigma-Aldrich)SV3007901 (A5955)17-20 mL
Gentamicine SulfaatLonza (Sigma-Aldrich)BW17-519Z (G1397)2-3 mL
Donor Equine SeraThermo Scientific (Sigma-Aldrich)SH3007403 (H1270)75 mL
Fetaal bovien serumThermo Scientific (Sigma-Aldrich)SH3007103 (F2442)25 mL
Collagenase (Type IV)Worthington (Sigma-Aldrich)LS004189 (C9891)0,44 g
Trypsine (uit pancreas)MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)ICN15357125 (T5266)1 g
Tabel 2. Verbruiksartikelen, gereedschap en apparatuur
VerbruiksartikelGereedschapApparatuur
Celcultuur platenPincet (Grof)Serologische Pipetteerder
Steriele 50 mL Conische buizenPincet (Fijn)pH Meter
LaboratoriumtapeMeshandvattenKoelende Incubator (Echotherm)
0,2 μm Vacuüm Sterilisatie SystemenMesbladen (#10, #11)Laminare Flow Hood
Waterafstotend Autoclave PapierChirurgische SchaartjesVacuum Manifold
Serologische PipettenGlazen Petri SchaaltjesMicroosmolal Meter
12-16 G Cannula's met Luer Locks
Tabel 3. Geoptimaliseerde Volumes voor Coating Celcultuur Platen
Plaatformaatcm^2 per putjePoly-L-lysine*Laminine**
6 putjes9,51,6 mL1
24 putjes1,90,320,2
48 putjes0,950,160,1
96 putjes0,320,060,03
* 0,1 mg/mL concentratie** 0,020 mg/mL concentratie
Tabel 4. Media voor Isolatie, Dissociatie en Cultuur
ReagensIsolatieWasDissociatie
Basis Medium419,25 mL395,40 mL297,00 mL
Gentamicine Sulfaat**0,75 mL0,60 mL-
Donor Equine Serum75,00 mL--
Fetaal bovien Serum***---
* PSF: penicilline/streptomycine/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentratie; *** Gekarakteriseerde
Tabel 5. Aanbevolen Verdunningen en Plaatvolumes
Plaatformaatcm^2 per putjeVerdunningPlaatvolume
6 putjes9,51,5-2,0x10^6 cellen/mL1 mL
24 putjes1,91,5-2,0x10^6 cellen/mL250 μL
48 putjes0,951,5-2,0x10^6 cellen/mL150 μL
96 putjes0,321,5-2,0x10^6 cellen/mL50-100 μL
Tabel 6. Gemiddeld aantal cellen per g weefsel
SoortGemiddeld aantal cellen/g weefsel
Danio rerio6.400.000
Danio dangila1.783.000
Devario aequipinnatus1.797.000
Oncorhynchus mykiss66.800
Tabel 7. Aanbevolen Incubatie Temperaturen
SoortTemperatuur
Danio/ Devario spp.26 - 28 °C
Oncorhynchus/Salmo spp.10* - 18 °C
Ambystoma mexicanum18°C
* Lagere temperaturen ondersteunen lagere proliferatiesnelheden.

Referenties

  1. Rescan, P. Y., Gauvry, L., Paboeuf, G. A gene with homology to myogenin is expressed in developing myotomal musculature of the rainbow trout and in vitro during the conversion of myosatellite cells to myotubes. FEBS Letters. 362 (1), 89-92 (1995).
  2. Castillo, J., Codina, M., Martinez, M. L., Navarro, I., Gutierrez, J. Metabolic and mitogenic effects of IGF-I and insulin on muscle cells of rainbow trout. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 286 (5), 935-941 (2004).
  3. Bower, N. I., Johnston, I. A. Paralogs of Atlantic salmon myoblast determination factor genes are distinctly regulated in proliferating and differentiating myogenic cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (6), 1615-1626 (2010).
  4. Funkenstein, B., Balas, V., Skopal, T., Radaelli, G., Rowlerson, A. Long-term culture of muscle explants from Sparus aurata. Tissue & Cell. 38 (6), 399-415 (2006).
  5. Cornelison, D. D. Context matters: in vivo and in vitro influences on muscle satellite cell activity. Journal of Cellular Biochemistry. 105 (3), 663-669 (2008).
  6. Harris, M. Quantitative growth studies with chick myoblasts in glass substrate cultures. Growth. 21 (3), 149-166 (1957).
  7. Cornelison, D. D., Wold, B. J. Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells. Developmental Biology. 191 (2), 270-283 (1997).
  8. Yablonka-Reuveni, Z., et al. The transition from proliferation to differentiation is delayed in satellite cells from mice lacking MyoD. Developmental Biology. 210 (2), 440-455 (1999).
  9. Yablonka-Reuveni, Z., Seger, R., Rivera, A. J. Fibroblast growth factor promotes recruitment of skeletal muscle satellite cells in young and old rats. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (1), 23-42 (1999).
  10. Le Moigne, A., et al. Characterization of myogenesis from adult satellite cells cultured in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 34 (1), 171-180 (1990).
  11. Tripathi, A. K., Ramani, U. V., Patel, A. K., Rank, D. N., Joshi, C. G. Short hairpin RNA-induced myostatin gene silencing in caprine myoblast cells in vitro. Applied Biochemistry and Biotechnology. 169 (2), 688-694 (2013).
  12. Ghahramani Seno,, M, M., et al. Transcriptomic analysis of dystrophin RNAi knockdown reveals a central role for dystrophin in muscle differentiation and contractile apparatus organization. BMC Genomics. 11, 345(2010).
  13. Honda, M., Hosoda, M., Kanzawa, N., Tsuchiya, T., Toyo-oka, T. Specific knockdown of delta-sarcoglycan gene in C2C12 in vitro causes post-translational loss of other sarcoglycans without mechanical stress. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 323-321 (2009).
  14. Rochard, P., et al. Mitochondrial activity is involved in the regulation of myoblast differentiation through myogenin expression and activity of myogenic factors. The Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2733-2744 (2000).
  15. Jackson, M. F., Hoversten, K. E., Powers, J. M., Trobridge, G. D., Rodgers, B. D. Genetic manipulation of myoblasts and a novel primary myosatellite cell culture system: comparing and optimizing approaches. The FEBS Journal. 280 (3), 827-839 (2013).
  16. McGrew, M. J., Rosenthal, N. Transgenic analysis of cardiac and skeletal myogenesis. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (6), 251-256 (1994).
  17. Dong, Y., Pan, J. S., Zhang, L. Myostatin suppression of Akirin1 mediates glucocorticoid-induced satellite cell dysfunction. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
  18. Chen, Y., Melton, D. W., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. MiR-351 transiently increases during muscle regeneration and promotes progenitor cell proliferation and survival upon differentiation. Physiological Genomics. 44 (21), 1042-1051 (2012).
  19. Shadrach, J. L., Wagers, A. J. Stem Cells for skeletal muscle repair. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1575), 2297-2306 (2011).
  20. Wu, X., Wang, S., Chen, B., An, X. Muscle-derived stem cells: isolation, characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. Cell and Tissue Research. 340 (3), 549-567 (2010).
  21. Farini, A., Razini, P., Erratico, S., Torrente, Y., Meregalli, M. Cell based therapy for Duchenne muscular dystrophy. Journal of Cellular Physiology. 221 (3), 526-534 (2009).
  22. Kim, H. J., Archer, E., Escobedo, N., Tapscott, S. J., Unguez, G. A. Inhibition of mammalian muscle differentiation by regeneration blastema extract of Sternopygus macrurus. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 237 (10), 2830-2843 (2008).
  23. McGann, C. J., Odelberg, S. J., Keating, M. T. Mammalian myotube dedifferentiation induced by newt regeneration extract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13699-13704 (2001).
  24. Cosgrove, B. D., Sacco, A., Gilbert, P. M., Blau, H. M. A home away from home: challenges and opportunities in engineering in vitro muscle satellite cell niches. Differentiation; Research in Biological Diversity. 78 (2-3), 2-3 (2009).
  25. Colbert, D. A., Edwards, K., Coleman, J. R. Studies on the organisation of the chicken genome and its expression during myogenesis in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 5 (2-3), 91-96 (1976).
  26. Bowman, L. H., Emerson, C. P. Post-transcriptional regulation of ribosome accumulation during myoblast differentiation. Cell. 10 (4), 587-596 (1977).
  27. Sun, S. S., McFarland, D. C., Ferrin, N. H., Gilkerson, K. K. Comparison of insulin-like growth factor interaction with satellite cells and embryonic myoblasts derived from the turkey. Comparative Biochemistry and Physiology. Comparative Physiology. 102 (2), 235-243 (1992).
  28. Marusich, M. F., Simpson, S. B. Changes in cell surface antigens during in vitro lizard myogenesis. Developmental Biology. 97 (2), 313-328 (1983).
  29. Schrag, J. A., Cameron, J. A. Regeneration of adult newt skeletal muscle tissue in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 77, 255-271 (1983).
  30. Hinkle, L., McCaig, C. D., Robinson, K. R. The direction of growth of differentiating neurones and myoblasts from frog embryos in an applied electric field. The Journal of Physiology. 314, 121-135 (1981).
  31. Yamane, H., Nishikawa, A. Differential muscle regulatory factor gene expression between larval and adult myogenesis in the frog Xenopus laevis: adult myogenic cell-specific myf5 upregulation and its relation to the notochord suppression of adult muscle differentiation. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
  32. Alexander, M. S., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors. Muscle & Nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
  33. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
  34. Gabillard, J. C., Sabin, N., Paboeuf, G. In vitro characterization of proliferation and differentiation of trout satellite cells. Cell and Tissue Research. 342 (3), 471-477 (2010).
  35. Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
  36. Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 477-483 (1968).
  37. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  38. Antin, P. B., Ordahl, C. P. Isolation and characterization of an avian myogenic cell line. Developmental Biology. 143 (1), 111-121 (1991).
  39. Malatesta, M., Giagnacovo, M., Cardani, R., Meola, G., Pellicciari, C. Human myoblasts from skeletal muscle biopsies: in vitro culture preparations for morphological and cytochemical analyses at light and electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 976, 67-79 (2013).
  40. Scott, I. C., Tomlinson, W., Walding, A., Isherwood, B., Dougall, I. G. Large-scale isolation of human skeletal muscle satellite cells from post-mortem tissue and development of quantitative assays to evaluate modulators of myogenesis. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. , 10-1007 (2013).
  41. Baquero-Perez, B., Kuchipudi, S. V., Nelli, R. K., Chang, K. C. A simplified but robust method for the isolation of avian and mammalian muscle satellite cells. BMC Cell Biology. 13, (2012).
  42. Lu, A., et al. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Therapy. 15 (15), 1116-1125 (2008).
  43. Rouger, K., et al. Progenitor cell isolation from muscle-derived cells based on adhesion properties. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 55 (6), 607-618 (2007).
  44. Michal, J., et al. Isolation and characterization of canine satellite cells. In vitro cellular & Developmental Biology Animal. 38, 467-480 (2002).
  45. McFarland, D. C., et al. Isolation and characterization of myogenic satellite cells from the muscular dystrophic hamster. Tissue & Cell. 32 (3), 257-265 (2000).
  46. Burton, N. M., Vierck, J., Krabbenhoft, L., Bryne, K., Dodson, M. V. Methods for animal satellite cell culture under a variety of conditions. Methods in Cell Science: an Official Journal of the Society for In vitro Biology. 22 (1), 51-61 (2000).
  47. Pavlath, G. K. Isolation, purification, and growth of human skeletal muscle cells. Methods in Molecular Medicine. 2, 307-317 (1996).
  48. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
  49. Doumit, M. E., Merkel, R. A. Conditions for isolation and culture of porcine myogenic satellite cells. Tissue & Cell. 24 (2), 253-262 (1992).
  50. Barjot, C., Jbilo, O., Chatonnet, A., Bacou, F. Expression of acetylcholinesterase gene during in vitro differentiation of rabbit muscle satellite cells. Neuromuscular Disorders: NMD. 3 (5-6), 443-446 (1993).
  51. Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2012).
  52. Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2012).
  53. Musaro, A., Barberi, L. Isolation and culture of mouse satellite cells. Methods in Molecular Biology. 633, 101-111 (2010).
  54. Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
  55. Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. J. Vis. Exp. (49), (2011).
  56. Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells and Development. 17 (4), 653-667 (2008).
  57. Bosnakovski, D., et al. Prospective isolation of skeletal muscle stem cells with a Pax7 reporter. Stem Cells. 26 (12), 3194-3204 (2008).
  58. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
  59. Powell, R. L., Dodson, M. V., Cloud, J. G. Cultivation and differentiation of satellite cells from skeletal muscle of the rainbow trout Salmo gairdneri. Journal of Experimental Zoology. 250 (3), 333-338 (1989).
  60. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Effect of fasting and refeeding on in vitro muscle cell proliferation in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Cell and Tissue Research. 301 (3), 459-463 (2000).
  61. Rescan, P. Y. Muscle growth patterns and regulation during fish ontogeny. General and Comparative Endocrinology. 142 (1-2), 111-116 (2005).
  62. Johnston, I. A., Bower, N. I., Macqueen, D. J. Growth and the regulation of myotomal muscle mass in teleost fish. The Journal of Experimental Biology. 214, 1617-1628 (2011).
  63. Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 129 (2-3), 207-219 (2001).
  64. Biga, P. R., Goetz, F. W. Zebrafish and giant danio as models for muscle growth: determinate vs. indeterminate growth as determined by morphometric analysis. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291 (5), 1327-1337 (2006).
  65. Roy, S., Gatien, S. Regeneration in axolotls: a model to aim for! Experimental Gerontology. 43 (11), 968-973 (2008).
  66. Echeverri, K., Tanaka, E. M. Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail regeneration. Science. 298 (5600), 1993-1996 (2002).
  67. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
  68. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. 49 (5), 371-385 (2013).
  69. Seger, C., et al. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 240 (11), 2440-2451 (2011).
  70. Gabillard, J. C., Ralliere, C., Sabin, N., Rescan, P. Y. The production of fluorescent transgenic trout to study in vitro myogenic cell differentiation. BMC Biotechnology. 10, (2010).
  71. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Purification and separation of individual collagenases of Clostridium histolyticum using red dye ligand chromatography. Biochemistry. 23 (13), 3077-3085 (1984).
  72. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin inhibits myosatellite cell proliferation and consequently activates differentiation: evidence for endocrine-regulated transcript processing. The Journal of Endocrinology. 215 (1), 177-187 (2012).
  73. Sanchez-Gurmaches, J., Cruz-Garcia, L., Gutierrez, J., Navarro, I. mRNA expression of fatty acid transporters in rainbow trout: in vivo and in vitro regulation by insulin, fasting and inflammation and infection mediators. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 163 (2), 177-188 (2012).
  74. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin stimulates myosatellite cell differentiation in a novel model system: evidence for gene subfunctionalization. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1059-1066 (2012).
  75. Vraskou, Y., et al. Direct involvement of tumor necrosis factor-α in the regulation of glucose uptake in rainbow trout muscle cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), 716-723 (1152).
  76. Cleveland, B. M., Weber, G. M. Effects of insulin-like growth factor-I, insulin, and leucine on protein turnover and ubiquitin ligase expression in rainbow trout primary myocytes. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (2), 341-350 (2010).
  77. Seiliez, I., et al. Amino acids downregulate the expression of several autophagy-related genes in rainbow trout myoblasts. Autophagy. 8 (3), 364-375 (2012).
  78. Chapalamadugu, K. C., et al. Dietary carbohydrate level affects transcription factor expression that regulates skeletal muscle myogenesis in rainbow trout. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 153 (1), 66-72 (2009).
  79. Seiliez, I., et al. Myostatin induces atrophy of trout myotubes through inhibiting the TORC1 signaling and promoting Ubiquitin-Proteasome and Autophagy-Lysosome degradative pathways. General and Comparative Endocrinology. 186, 9-15 (2013).
  80. Codina, M., et al. Metabolic and mitogenic effects of IGF-II in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) myocytes in culture and the role of IGF-II in the PI3K/Akt and MAPK signalling pathways. General and Comparative Endocrinology. 157 (2), 116-124 (2008).
  81. Seiliez, I., Sabin, N., Gabillard, J. C. Myostatin inhibits proliferation but not differentiation of trout myoblasts. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (2), 220-226 (2012).
  82. Averous, J., Gabillard, J. C., Seiliez, I., Dardevet, D. Leucine limitation regulates myf5 and myoD expression and inhibits myoblast differentiation. Experimental Cell Research. 318 (3), 217-227 (2012).
  83. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Sensitivity of muscle satellite cells to pollutants: an in vitro and in vivo comparative approach. Aquatic Toxicology. 53 (3-4), 247-263 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Myogene precursorcellenprimaire celkweekweefseldissectiemechanische dissociatieenzymatische dissociatiecollagenasebehandelinglamininesubstraatceluitplatingmyogenese assayzebravissmodel
Voorbereiding van de Primaire Myogene Precursor Cell / myoblast Culturen van Basal gewervelde Geslachten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.