Een strategie voor de gevoelige, Large Scale Quantitative Metabolomics

Samenvatting

Metaboliet profilering is waardevol geweest in de studie van het metabolisme in gezondheid en ziekte. Gebruik te maken van de normale fasen vloeistofchromatografie gekoppeld aan een hoge resolutie massaspectrometrie met polariteit schakelen en een snelle duty cycle, beschrijven we een protocol bij de polaire metabole samenstelling van biologisch materiaal met een hoge gevoeligheid, nauwkeurigheid en resolutie te analyseren.

Samenvatting

Metaboliet profilering is waardevol geweest in de studie van het metabolisme in gezondheid en ziekte. De huidige platforms verschillende beperkende factoren, zoals arbeidsintensief monster preparaten lage detectiegrenzen, langzame scan snelheden, intensieve methode optimalisatie voor elke metaboliet, en het onvermogen om zowel positief meten en negatief geladen ionen in enkele experimenten. Daarom kon een roman metabolomics protocol metabolomics studies te bevorderen. Amide-gebaseerde hydrofiele chromatografie maakt polaire metabolietanalyse zonder chemische derivatisering. Hoge resolutie MS met behulp van de Q-Exactive (QE-MS) is verbeterd ionenoptiek, verhoogde scansnelheden (256 msec bij een resolutie van 70.000), en heeft de mogelijkheid van het uitvoeren van positieve / negatieve schakelen. Met een koude methanol extractie strategie en koppelen van een amide-kolom met QE-MS maakt robuuste detectie van 168 gerichte polaire metabolieten en duizenden extra functies tegelijk. Dateen verwerking wordt uitgevoerd met in de handel verkrijgbare software uitgevoerd op een zeer efficiënte wijze en onbekende kenmerken geëxtraheerd uit de massaspectra worden opgevraagd in databases.

Inleiding

Metabolomics, gedefinieerd als een experiment dat meerdere metabolieten meet tegelijk, heeft een gebied van intense belangstelling geweest. Metabolomics geeft een directe uitlezing van de moleculaire fysiologie en heeft inzicht in ontwikkeling en ziekte zoals kanker ^1-4 verstrekt. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) en gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) behoren tot de meest gebruikte instrumenten ^5-9. NMR name is gebruikt voor flux experimenten omdat zware isotoop gemerkte verbindingen zoals ^13C gelabelde metabolieten zijn NMR-actieve ^10,11. Echter, deze strategie vereist relatief hoge zuiverheid van het monster en de grote hoeveelheid van het monster, die haar toepassingen in metabolomics beperkt. Ondertussen, gegevens uit NMR moet intensieve analyse en samengestelde toewijzing van complexe NMR spectra moeilijk. GC-MS is op grote schaal gebruikt voor polaire metabolieten en lipide-studies, maar het vluchtige compoun vereistds en daardoor vaak derivatisering van metabolieten, die soms ingewikkelde chemie die tijdrovend zijn en introduceert experimentele noise.

Vloeistofchromatografie (LC) gekoppeld aan triple quadrupool massaspectrometrie gebruikt de eerste quadrupool voor het selecteren van de intacte ouder ionen, die vervolgens worden gefragmenteerd in de tweede quadrupool, terwijl de derde quadrupool wordt gebruikt karakteristieke fragmenten of dochter ionen selecteren. Deze methode, waarbij de overgang van ouder ionen specifieke dochter ionen registreert, wordt meervoudige reactie controle (MRM) genoemd. MRM is een zeer gevoelig, specifiek en robuuste methode voor zowel kleine moleculen en eiwitkwantificering ^12-15,21. Echter, MRM heeft wel zijn beperkingen. Om een ​​hoge specificiteit te bereiken een MRM methode moet worden gebouwd voor elk metaboliet. Deze methode bestaat uit het identificeren van een bepaald fragment en bijbehorende geoptimaliseerde botsingsenergie, die pre-kennis van de prope vereistrties van de metabolieten van belang, zoals chemische structuur informatie. Daarom, met enkele uitzonderingen waarbij neutrale verlies gemeenschappelijke fragmenten, is het niet mogelijk om onbekende metabolieten identificeren met deze methode.

In de afgelopen jaren hebben een hoge resolutie (HRMS) instrumenten uitgebracht, zoals de LTQ-orbitrap en Exactive serie, de QuanTof en TripleTOF 5600 ^16-18,22. HRMS kan een massa verschaffen verhouding (m / z) van intacte ionen rekening binnen een fout van enkele ppm. Daarom kan een HRMS instrument bediend door het detecteren alle precursorionen (dwz het volledige scan) directe structurele informatie te verkrijgen van de exacte massa en de resulterende elementaire samenstelling van het analyt, en deze informatie kan worden gebruikt om potentiële metabolieten identificeren. Inderdaad kunnen alle informatie over een verbinding worden verkregen met een exacte massa, tot het niveau van structurele isomeren. Ook een volledigscanmethode vereist geen voorkennis van de metabolieten en geen methode optimalisatie nodig. Aangezien alle ionen met m / z vallen in het scanbereik kan worden geanalyseerd HRMS een vrijwel onbeperkte capaciteit in termen van het aantal metabolieten die kunnen worden gekwantificeerd in een enkele run tegenover de MRM methode. HRMS is ook vergelijkbaar met een drievoudige quadrupool MRM kwantitatieve capaciteit vanwege de korte werkcyclus leidt tot een vergelijkbaar aantal gegevenspunten die worden verkregen in een volledige MS scannen. Daarom HRMS biedt een alternatieve benadering voor de kwantitatieve metabolomics. Onlangs is een verbeterde versie van HRMS genoemd Q-Exactive massaspectrometrie (QE-MS) kan in het schakelen tussen positieve en negatieve standen met voldoende snelle cyclustijden in een werkwijze, waarbij het ​​detectiebereik ¹⁹ vergroot worden gebruikt. Hier beschrijven we onze metabolomics strategie met behulp van de QE-MS.

Protocol

1. Voorbereiding van LC-MS reagentia, Oprichting van een Chromatography Method, en Oprichting van Instrument Operating Procedures

1. Bereiding van LC Oplosmiddelen
   1. Bereid 500 ml mobiele fasen. A 20 mM ammoniumacetaat en 15 mM ammoniumhydroxide in 3% acetonitril / water, uiteindelijke pH 9.0; en B is 100% acetonitril.
   2. Losjes de dop op de fles, plaats het in een waterbad sonificator en ultrasone trillingen gedurende 10 min zonder extra verwarming. (Deze stap is ervoor te zorgen dat alle ammoniumzouten volledig oplost en dat er geen resterende luchtbellen.)
   3. Overdracht 250 ml oplosmiddel in een 250 ml glazen fles voor LC-MS gebruikt, en houdt de rest bij 4 ° C.
2. Bereid de standaardoplossing lage massa bereik. Het is belangrijk om een ​​aangepaste laag massabereik kalibratiemengsel metabolomics toepassingen zodat nauwkeurige massa worden gedetecteerd bij lage molecuulgewichten.
   1. Weeg 5 mg van beide Sodium fluoracetaat en homovanillinezuur en los ze in 5 ml water tot een eindconcentratie van 1 mg / ml te maken. Los diazinon in methanol tot een eindconcentratie van 10 mg / ml te maken.
   2. Voor te bereiden 1 ml van negatieve lage massa kalibratie-oplossing, meng 960 ml thermo negatieve kalibratie-oplossing met 20 ml van natrium fluoroaceate en homovanillinezuur oplossing. Aan 1 ml positieve lage massa kalibratie-oplossing, meng 990 ml thermo positieve kalibratie-oplossing en 10 ml diazinon oplossing. (De geringe massa ijkoplossing worden bewaard bij 4 ° C en worden vers bereid elke 2 maanden.)
3. Kalibratie van QE-MS bij een geringe massa Range
   1. Voor het uitvoeren van lage massa bereik kalibratie, het uitvoeren van een standaard massa calibratie (m / z, 150-2,000) in zowel positieve als negatieve standen op basis van instructies van de fabrikant.
   2. Zodra een regelmatige massa calibratie geeft pas de scan bereik 60-900 m / z in het instrument bedieningspaneelen een bron CID van 25 eV voor positieve modus en 35 eV voor negatieve modus wordt toegepast. (Dit robuuste signalen van de cafeïne fragment ionen en sulfaationen geven. Het scanbereik hier is vastgesteld, omdat de laatste m / z niet groter dan 15x van het uitgangsmateriaal m / z moeten)
   3. Zodra de ionenbron is stabiel, voer vervolgens de aangepaste kalibratie. Opmerking: Een stabiele bron wordt gedefinieerd als minder dan 10% van de totale ionenstroom variatie in positieve modus, en minder dan 15% in de negatieve modus. De aangepaste kalibratie ionen en bijbehorende m / z zijn vermeld in tabel 1.
4. Bepaal de LC-MS instrumentatie voor polaire metaboliet analyse. LC is gekoppeld met een QE-MS metaboliet scheiding en detectie.
   1. Rust de QE-MS met een verwarmde elektrospray ionisatie (H-ESI). Stel de relevante tuning parameters voor de sonde als opgesomd: heater temperatuur, 120 ° C; schede gas, 30; hulpgas, 10; sweep gas, 3; spuiten voltage, 3,6 kV voorpositieve modus en 2,5 kV voor negatieve modus. Stel de capillaire temperatuur 320 ° C en S-lens 55.
   2. Bouw een volledige scan methode als volgt: Volledige scan range: 60-900 (m / z); resolutie: 70.000; maximale injectie tijd: 200 msec met typische injectie tijden rond de 50 msec; Automatic Gain Control (AGC): 3.000.000 ionen. Deze instellingen resulteren in een duty cycle van ongeveer 550 msec om scans uit te voeren in zowel positieve als negatieve modus.
   3. Bepaal de chromatografie-methode. Gebruik van een amide-kolom (100 x 2.1 mm ID, 3,5 mm) voor verbinding scheiding bij kamertemperatuur ^13,15. De mobiele fase A is zoals hierboven beschreven en mobiele fase B acetonitril. Gebruik een lineaire gradiënt als volgt: 0 min, 85% B; 1.5 min 85% B, 5,5 min, 35% B; 10min, 35% B, 10.5 min, 35% B, 14.5 min, 35% B, 15 min, 85% B en 20 min, 85% B. De stroomsnelheid 0,15 ml / min 0-10 min en 15 tot 20 min en 0,3 ml / min 10,5-14,5 min.

2. Preparation van Metabolite Monsters

1. Bereid een extractiemiddel. Meng 40 ml methanol (LC-MS grade) en 10 ml water (LC-MS) af in een 50 ml buis, en bewaar het op -80 ° C vriezer gedurende ten minste 1 uur voor gebruik. Opmerking: Deze procedure en de volgende stappen kunnen worden aangepast voor de extractie van biologisch weefsel en vloeistofmonsters.
   1. Cultuur darmkanker HCT 8 cellen in drie 10 cm schalen of 6-well platen vol groeimedium, RPMI 1640 aangevuld met 10% hitte geïnactiveerd foetaal runderserum en 100.000 eenheden / l penicilline en 100 mg / l streptomycine.
   2. Wanneer de cellen te bereiken 80% confluentie, snel te verwijderen van het medium, en plaats de schaal of bord op de top van droogijs ^13,15. Voeg 1 ml extractievloeistof onmiddellijk (80% methanol / water), en breng de plaat om de -80 ° C vriezer. Voor een 10 cm schaal, voeg 3 ml extractieoplosmiddel aan elk putje. (Proberen om het medium te verwijderen zoveel mogelijk het ion onderdrukking effect door restzouten van medium te voorkomen.)
   3. Laat de plaat gedurende 15 minuten. Haal hem uit de diepvries en schraap cellen in het oplosmiddel op droog ijs. Breng de oplossing 1,7 ml Eppendorf buisjes en centrifugeer met de snelheid van 20.000 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten. (Bereid cel metabolieten uit drie afzonderlijke gerechten tot drie gelijke monsters te maken. Het doel van het houden van twee buizen is een als back-up.)
   4. Breng de bovenstaande twee nieuwe Eppendorf buizen, en droog ze in een snelheid vacuüm. Dit duurt ongeveer 3-6 uur afhankelijk van de snelheid vacuüm gebruikt. (De monsters kunnen ook 's nachts gedroogd onder stikstofgas.)
   5. De droge buizen van elk monster in de -80 ° C vriezer. Als u klaar bent, Los een monster in 20 ml water (LC-MS graad), en injecteer 5 ml tot LC-QE-MS voor analyse.

3. Instellen van Sample Sequence

1. Zodra de kalibratie correct is uitgevoerd op de QE-MS uitgevoerd, evenwicht LC kolom voor 5 min met 85% A met een stroomsnelheidsnelheid van 0,15 ml / min, hetgeen de begintoestand van de LC gradiënt.
2. Het opzetten van de reeks monsters in willekeurige volgorde. Opmerking: Zo distribueert fluctuaties die door de LC-MS aan elk monster en zorgt nauwkeurigere vergelijking tussen verschillende monsters. Elke 6 monsters, voeg een was run, die dezelfde MS-methode deelt, behalve de LC gradiënt 95% A gedurende 10 min, gevolgd door een 5 minuten kolomequilibratiebuffer bij 85% A met een stroomsnelheid van 0,15 ml / min. Voeg blanco monsters (100% water) na elke wasbeurt run om het systeem achtergrond beoordelen en overdracht niveaus.
3. Sla de volgorde en zodra de LC kolom toont stabiele druk, ongeveer 400 psi, start de reeks run. Als er geen andere monster worden uitgevoerd nadat deze volgorde, voeg dan een stop vrij aan het einde van de sequentie, die een stroomsnelheid van 0 ml / min in het einde van de gradiënt heeft en kies "standby" na beëindiging volgorde.
4. Herstart het hetzelfde monster set 12 uur na de kalibratie. (Dit is om de massa fout fluctuatie beoordelen na kalibratie.)

4. Bericht Analyse Instrument Onderhoud

1. Eind sequentie Was de kolom met 95% A bij een stroomsnelheid van 0,2 ml / min gedurende 2 uur, en eventueel omkeren van de kolom voor het wassen.
2. Verwijder de kolom LC en LC rechtstreeks aansluiten op de ionenbron door een vakbond. Bereid reinigingsmiddel, water / methanol / mierenzuur (v: v: v, 90:10:0.2), ingesteld MS standby-modus en wash LC-MS systeem met een stroomsnelheid van 0,1 ml / min gedurende 1 uur verwijderen de resterende neergeslagen zouten of andere verontreinigingen. Laat de stroomsnelheid als er te veel systeemdruk.
3. Stel de capillaire temperatuur op 50 ° C, en verwijder het ion kooi. Verwijder voorzichtig het ion sweep kegel en het ion verbindingsbuis na de capillaire temperatuur daalt tot 50 ° C. Gebruik een ruwe maas, zoals schuurpapier, om onzuiverheden op het oppervlak van het ion sweep kegel verwijderen.
4. Plaats de ion overdrachtbuis in een 15 ml Falcon buis met 10 ml 90% water / methanol met 0,1% mierenzuur. Na sonicating de buis in een waterbad sonicator gedurende 20 minuten, giet het oplosmiddel binnen, te vervangen door 10 ml pure methanol en ultrasone trillingen nog eens 20 minuten. (Indien nodig kan de sonicatie worden uitgevoerd bij 40 ° C of een nog hogere temperatuur een betere reiniging te bereiken.)

Analyse van LC-MS-gegevens 5.

1. Om het monster volgorde te laten verlopen, na het beëindigen van de eerste twee monsters in de reeks, kijk pieken voor onbekende metabolieten. Gebruik een CSV-bestand lijst metaboliet namen, neutrale chemische formule en de detectie-modus (positief of negatief), als de input-bestand, en de output bestand bevat uitgepakt pieken en massa fout in ppm. Als de vorm van de piek abnormaal of massa fout uit meer dan 5 ppm, dan de rest van de sequentie moet worden gestopt en probleemoplossing moet worden gedaan.
2. Kies de methode van de "piek alignmenten frame extractie "op de handel verkrijgbare software. Selecteer ruwe data van LC-MS en groeperen. Kies monsters in het midden van de run volgorde zoals chromatografie referentiemonster voor piek uitlijning. Upload een frame zaad met inbegrip van bekende metabolieten voor de gerichte metabolieten analyse met gegevens verzameld en de bijbehorende kader zaad.
3. Voer data-analyse in positieve en negatieve modus afzonderlijk. Gebruik de standaardinstelling voor andere parameters. Schakel de database zoekfunctie en uitvoeren van de workflow. De verwerkte gegevens exporteren als een Excel-blad met piekoppervlak van elk frame. De eerste sets van frames komen overeen met de metabolieten in de gerichte lijst. Opmerking: Voor een gerichte metabolietanalyse, wordt de metabolieten verkregen informatie gebaseerd op eerdere studies ^13,15.
4. Voor een ongerichte metabolietanalyse, kies de methode van "component winning". Laad blanco monsters voor achtergrond aftrekken. Stel piek intensiteit drempel eent 10 ^5, m / z breedte van 10 dpm en signaal-ruis verhouding van 3.
5. Gebruik menselijke metabolome databank voor onbekende verbindingen identificatie. Gebruik een CV filter om de componenten met grote cv's binnen identieke monsters te verwijderen. Handmatig doen via elk onderdeel en pak die met goed gedefinieerde piek of relatief groot verschil in verschillende monsters types voor database-search. Exporteer gegevens met hits in de database. (Peak uitlijning kan worden overgeslagen als de piek uitlijning score is te laag.)

Resultaten

De nauwkeurigheid van metabolomics data is sterk afhankelijk van de prestaties van LC-QE-MS instrument. Om te bepalen of het instrument werkt in goede staat en of de toegepaste methode worden er ook verscheidene bekende metaboliet LC pieken uit het totale ionchromatografie (TIC), zie figuur 1. Polaire metabolieten, zoals aminozuren, glycolyse tussenproducten , TCA tussenproducten, nucleotiden, vitamines, ATP, NADP ⁺ en ga zo maar door hebben goede retentie op de kolom en goede piekvormen in d...

Discussie

De meest kritische stappen voor een succesvolle metaboliet profilering in cellen met dit protocol zijn: 1) het regelen van het groeimedium en zorgvuldige extractie van de cellen; 2) het aanpassen van de LC-methode gebaseerd op methode setup MS om te zorgen voor voldoende (meestal minstens 10) datapunten over een piek voor kwantificering; 3) het doen van een lage massa calibratie voordat u monsters; 4) het injecteren van niet meer dan 5 ml om te voorkomen retentietijd verschuiven en piekverbreding veroorzaakt door water;...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Positieve kalibratiemix	Thermo Scientific	#88323	Het is lichtgevoelig. Bewaren bij 4 °C
Negatieve kalibratiemix	Thermo Scientific	#88324	Bewaren bij 4 °C
Diazinon	Sant Cruz Biotechnology	#C0413	Het veroorzaakt irritatie van de ogen, dus werk in een afzuigkap. Bewaren bij 4 °C
H-ESI naaldinsert	Fisher Scientific	#1303200	Deze kan worden vervangen of gereinigd met 5% mierenzuur/water (verwijder rubberen ring) indien verstopt.
Xbridge amide kolom	Waters	#186004860	Een beschermkoluom wordt aanbevolen om de levensduur van de kolom te verlengen.