De structuur van neuronale netwerken begrijpen, functionele en morfologische karakterisering van individuele neuronen is een noodzaak. Hier tonen we juxtasomal biocytine etikettering, die elektrofysiologische opnames maakt in de extracellulaire configuratie, maar met behoud van de mogelijkheid om intracellulair het etiket van de neuron voor post hoc reconstructie van dendritische en axonale architectuur.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Juxtasomal biocytine Labeling om de structuur-functie relatie van de individuele corticale neuronen Studie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De cerebrale cortex kenmerkt door meerdere lagen en vele verschillende celtypen die samen een netwerk zijn verantwoordelijk voor veel hogere cognitieve functies zoals besluitvorming, sensorisch-geleide gedrag of geheugen. Om te begrijpen hoe dergelijke complexe neuronale netwerken verrichten van dergelijke taken, een cruciale stap is om de functie (of elektrische activiteit) van individuele celtypen binnen het netwerk te bepalen, bij voorkeur wanneer het dier voert een relevante cognitieve taak. Bovendien is het even belangrijk om de anatomische structuur van het netwerk en de morfologische structuur van de individuele neuronen om reverse engineering de corticale netwerk bepalen. Technische doorbraken die vandaag beschikbaar zijn maken het mogelijk opnemen van cellulaire activiteit in wakker, gedragen dieren met de waardevolle optie van post hoc identificeren van de opgenomen neuronen. Hier tonen we de juxtasomal biocytine labeling techniek, die opname actie potentiometer impliceertal pieken in de extracellulaire (of losse-patch) configuratie met conventionele patch pipetten. De juxtasomal opnameconfiguratie relatief stabiel en toepasselijk over gedragsvoorwaarden, zoals verdoofd verdoofd, wakker-kop vast, en zelfs in de vrij bewegende dieren. Aldus is deze methode kan legen celtypespecifieke actiepotentiaal spiking in dierlijke gedrag reconstructie van de individuele neuronen en uiteindelijk de gehele corticale microschakeling. In deze video manuscript, laten we zien hoe individuele neuronen in de juxtasomal configuratie met biocytine in de-urethaan verdoofde rat voor post-hoc-identificatie en morfologische reconstructie kan worden bestempeld.
Inleiding
Neuronale netwerken bestaan uit meerdere celtypes, gekenmerkt door zeer specifieke morfologische en fysiologische eigenschappen 1-7. Bijgevolg individuele celtypen voeren specifieke taken binnen het netwerk (zie bijvoorbeeld GENTET et al.. 8 en Burgalossi et al.. 9). We nu pas beginnen te celtype-specifieke functies te begrijpen over neuronale netwerken en veel is nog te ontdekken. Hiervoor zijn veel laboratoria uitvoering experimentele benaderingen die de analyse van de morfologische eigenschappen van hetzelfde neuronale populatie waaruit fysiologische parameters verkregen 1,10-15 mogelijk. Hier tonen w....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van de Animal
Alle experimentele procedures worden uitgevoerd in overeenstemming met de Nederlandse wet en na evaluatie door een lokale ethische commissie uitgevoerd aan de Vrije Universiteit Amsterdam, Nederland.
- Verdoven een Wistar rat (P25-P45, ♂ / ♀) met isofluraan (2-3% zuurstof) en vervolgens met urethaan (20% in 0,9% NaCl, 1,6-1,7 g / kg) door intraperitoneale injectie. Beoordelen van de diepte van de anesthesie door monitoring snuifje terugtrekking, ooglid reflexen en vibrissae bewegingen.
- Dien een bijkomende dosis van urethaan (10% van de aanvangsdosis) wanneer het dier onvoldoende verdoving ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Gedetailleerde kennis over 3D structuur van individuele neuronen is van cruciaal belang voor het ophelderen van organisatorische principes van neuronale netwerken. Onze methode houdt in een pijpleiding naar hoge kwaliteit biocytine etikettering bereiken van een in vivo voorbereiding, waardoor post hoc neuronale indeling en de gedetailleerde reconstructie van dendritische en axonale architectuur van enkele neuronen met een hoge resolutie. Afhankelijk van de kwaliteit van juxtasomal etikettering neuronen.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De juxtasomal methode laat opnemen in vivo actiepotentiaal vastspijkeren van enkele eenheden over gedragsvoorwaarden (verdoofd, wakker-hoofd vast of vrij bewegende) met de optie van-biocytine labelen van de opgenomen neuron voor post hoc celtype classificatie en / of 3D-reconstructie. Het grote voordeel is fysiologische parameters in de extracellulaire (dus invasief) informatie te verkrijgen, maar het kunnen de neuron intracellulair label met biocytine 16,17,32. Naast labeling biocytine Deze.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De authros hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij willen Profs bedanken. Huibert Mansvelder en Bert Sakmann voor uitgebreide ondersteuning, dr. Marcel Oberlaender voor vruchtbare discussies en het verstrekken van neuronale tracing, en Brendan Lodder voor technische ondersteuning. De gegevens werden verkregen met behulp van de ntrode VI voor LabView, genereus geleverd door R. Bruno (Columbia Univ., NY, USA). Dit onderzoek werd gesteund door het Max Planck Instituut en het Bernstein Center for Computational Neuroscience, Tübingen (gefinancierd door het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Center for Neurogenomics and Cognitive Research (CNCR) , Neuroscience Campus Ams....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| SM-6 control system | Luigs Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 versterker | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B versterker | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, Inc. | ||
| Piezo-elektrisch apparaat | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| LabView | National Instruments, Austin, TX, USA | LabView-verwervingssoftware | |
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY | ||
| Sugi absorberende watten | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochroom C uit paardenhart | Sigma | C2506 | |
| Catalase uit runderlever | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standaard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex snelle tandheelkundige cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytisch glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22.350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
Referenties
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
