Juxtasomal biocytine Labeling om de structuur-functie relatie van de individuele corticale neuronen Studie

Summary

De structuur van neuronale netwerken begrijpen, functionele en morfologische karakterisering van individuele neuronen is een noodzaak. Hier tonen we juxtasomal biocytine etikettering, die elektrofysiologische opnames maakt in de extracellulaire configuratie, maar met behoud van de mogelijkheid om intracellulair het etiket van de neuron voor post hoc reconstructie van dendritische en axonale architectuur.

Abstract

De cerebrale cortex kenmerkt door meerdere lagen en vele verschillende celtypen die samen een netwerk zijn verantwoordelijk voor veel hogere cognitieve functies zoals besluitvorming, sensorisch-geleide gedrag of geheugen. Om te begrijpen hoe dergelijke complexe neuronale netwerken verrichten van dergelijke taken, een cruciale stap is om de functie (of elektrische activiteit) van individuele celtypen binnen het netwerk te bepalen, bij voorkeur wanneer het dier voert een relevante cognitieve taak. Bovendien is het even belangrijk om de anatomische structuur van het netwerk en de morfologische structuur van de individuele neuronen om reverse engineering de corticale netwerk bepalen. Technische doorbraken die vandaag beschikbaar zijn maken het mogelijk opnemen van cellulaire activiteit in wakker, gedragen dieren met de waardevolle optie van post hoc identificeren van de opgenomen neuronen. Hier tonen we de juxtasomal biocytine labeling techniek, die opname actie potentiometer impliceertal pieken in de extracellulaire (of losse-patch) configuratie met conventionele patch pipetten. De juxtasomal opnameconfiguratie relatief stabiel en toepasselijk over gedragsvoorwaarden, zoals verdoofd verdoofd, wakker-kop vast, en zelfs in de vrij bewegende dieren. Aldus is deze methode kan legen celtypespecifieke actiepotentiaal spiking in dierlijke gedrag reconstructie van de individuele neuronen en uiteindelijk de gehele corticale microschakeling. In deze video manuscript, laten we zien hoe individuele neuronen in de juxtasomal configuratie met biocytine in de-urethaan verdoofde rat voor post-hoc-identificatie en morfologische reconstructie kan worden bestempeld.

Introduction

Neuronale netwerken bestaan ​​uit meerdere celtypes, gekenmerkt door zeer specifieke morfologische en fysiologische eigenschappen ^1-7. Bijgevolg individuele celtypen voeren specifieke taken binnen het netwerk (zie bijvoorbeeld GENTET et al.. ⁸ en Burgalossi et al.. ^9). We nu pas beginnen te celtype-specifieke functies te begrijpen over neuronale netwerken en veel is nog te ontdekken. Hiervoor zijn veel laboratoria uitvoering experimentele benaderingen die de analyse van de morfologische eigenschappen van hetzelfde neuronale populatie waaruit fysiologische parameters verkregen ^1,10-15 mogelijk. Hier tonen we juxtasomal etiketteringstechniek ^16,17 die elektrofysiologische opnames gaat met conventionele patch pipetten in de extracellulaire (dus invasief) configuratie in combinatie met elektroporatie van de opgenomen neuron met biocytine. Degrote voordeel van deze benadering is dat de invasieve aard zodat actiepotentiaal stekelige individuele neuronen wordt opgenomen zonder dat (bijvoorbeeld dialyse) de intracellulaire inhoud van de cel. Gevolgd door elektroporatie, de juxtasomal aanpak biedt de mogelijkheid van post hoc identificatie en reconstructie cel functie (fysiologie) te koppelen aan de structuur (morfologie). Typisch morfologische reconstructie omvat reconstructie van dendritische en axonale morfologie die kan worden uitgebreid voor kwantificering van de wervelkolom en / of bouton dichtheden of reconstructie van neuronale morfologie bij nanometerresolutie middels elektronenmicroscopie. De juxtasomal opnametechniek kan worden gebruikt voor in vivo opname van diverse celtypen in corticale lagen of sub-corticale gebieden in een aantal soorten, hoewel de meeste studies de techniek hebben toegepast in kleine knaagdieren zoals muizen of ratten. Ons onderzoek is gericht op het opnemen en labelen van neuronenvan de rat primaire somatosensorische cortex (S1) en het gaat om visuele identificatie van opgenomen neuronen ^18, dendritische reconstructies in combinatie met nauwkeurige registratie in een gestandaardiseerde referentiekader te reverse engineeren corticale netwerken ^4,19 en gedetailleerde reconstructie van axonalestructuur tot celtype-specifieke lokale kenmerken en lange afstand projectie richt ^20.

Vergeleken met andere in vivo opnametechniek (intracellulair of hele-cel), juxtasomal opnamen zijn relatief stabiel en kunnen daarom worden toegepast op gedragstoestanden inclusief narcose ^21,22, verdoofd ^14, wakker-kop vast ²³ of zelfs vrij bewegende dieren ⁹ . Hier tonen we juxtasomal etikettering S1 van een urethaan verdoofde rat, hoewel we benadrukken de algemene toepasbaarheid van deze techniek om veel voorbereidingen van keuze.

Protocol

1. Voorbereiding van de Animal

Alle experimentele procedures worden uitgevoerd in overeenstemming met de Nederlandse wet en na evaluatie door een lokale ethische commissie uitgevoerd aan de Vrije Universiteit Amsterdam, Nederland.

1. Verdoven een Wistar rat (P25-P45, ♂ / ♀) met isofluraan (2-3% zuurstof) en vervolgens met urethaan (20% in 0,9% NaCl, 1,6-1,7 g / kg) door intraperitoneale injectie. Beoordelen van de diepte van de anesthesie door monitoring snuifje terugtrekking, ooglid reflexen en vibrissae bewegingen.
2. Dien een bijkomende dosis van urethaan (10% van de aanvangsdosis) wanneer het dier onvoldoende verdoving diepte bereikt of wanneer vibrissae samentrekkingen tijdens het experiment worden waargenomen.
3. Plaats de verdoofde dier op de stereotaxisch frame uitgerust met een verwarmingselement, plaatst rectale temperatuur sonde en de lichaamstemperatuur van het dier te handhaven op 37,5 ± 0,5 ° C door een verwarmingselement.
4. Plaats hoofd van het dier in de stereotaxisch frame; knip het haar bovenop het hoofd met behulp van een schaar om de huid zichtbaar te maken.
5. Injecteer 100 ui 1% lidocaïne (0,9% NaCl) subcutaan lokale verdoving op de gebruikslocatie en wacht 3-5 minuten. Verwijder de huid die het oppervlak van de schedel door te snijden in de caudale naar rostraal richting en reinig het restmateriaal.
6. Reinig de schedel uitgebreid met 0,9% NaCl en absorberende doekjes.
7. Bepaal de coördinaten van het doelgebied op de linker hersenhelft (voor de primaire somatosensorische cortex (S1): 2.5 mm achter en 5,5 mm lateraal van bregma). Markeer de locatie op de schedel met een chirurgische huid marker pen.
8. Schraap het been zachtjes door een tandartsboor van het van belang zijnde tot het bot wordt transparant en bloedvaten zijn duidelijk zichtbaar.
9. Voeg een 0,5 mm x 0,5 mm craniotomie door het snijden van een venster in de verdunde schedel met een scalpel (# 11), schade aan de dura mater vermijdenen bloedvaten. Optioneel: markeer de randen van de craniotomie met behulp van een chirurgische huid marker pen om de zichtbaarheid te verbeteren.
10. Breng een dun laagje van superlijm op de droge schedel en vervolgens tandheelkundige cement om een bad (dwz opname kamer) omsluit de craniotomie construeren.
11. Knip de snorharen aan de contralaterale zijde precies 5 mm van de snorhaar follikel. Optioneel: markeer de getrimde snor met zwarte mascara.

2. Juxtasomal Recordings en biocytine Labeling

1. Maak patch pipetten van borosilicaatglas met binnenkant tip diameter van ~ 1 micrometer om elektroden te verkrijgen met 3-5 MQ weerstand. Opmerking: De ideale pipet morfologie voor de juxtasomal opname is een geleidelijke slank taper, een lage kegel hoek, en een ~ 1 micrometer tip (figuur 1).
2. Afhankelijk van de opname diepte (ten opzichte van het pial oppervlak), moet de conische afmetingen van de registratie-elektrode worden aangepast. Kritisch belang is dat thij taper diameter moet kleiner zijn dan 75 micrometer zijn op het punt van binnenkomst in de hersenen om mechanische schade of stress om de opname te ontwijken. Dit geeft aan dat voor oppervlakkige corticale opnamen, een tapsheid van 300-500 urn met een buitendiameter van maximaal 75 urn is vereist (figuur 1A) dat opnamen van relatief diepe corticale lagen vereisen een langere tapsheid van 1,500-1,800 um, opnieuw met maximale buitendiameter diameter van 75 micrometer (bij 1.800 micrometer van de elektrode tip).
3. Laad de patch pipet met een normale rat bel (NRR) aangevuld met 2% biocytine (zie tabel 1 voor oplossingen en reagentia) en monteer de patch pipet op een micromanipulator vaste hoofd podium.
4. Stel de hoek van de elektrodehouder tot 34 ° ten opzichte van het sagittale vlak specifiek gericht kolom D2 rat S1.
5. Sluit de hoofd podium op een versterker in bridge-modus (dwz stroomtang).
6. Plaats de pleisterPipetteer in de nabijheid van de craniotomie. Vul het bad met 0,9% NaCl en bepaal de elektrode weerstand die dient tussen 3-5 MQ, bepaald door een vierkant puls met positieve stroominjectie (1 nA 200 msec aan / uit).
7. Vaststellen overdruk van 100-150 mbar en vooraf de patch pipet in 1 micrometer stappen terwijl die positieve stroom als vierkante pulsen (1 nA, 200 msec aan / uit). Monitor de robuuste weerstand verandering bij het leggen van contacten met de dura mater. Op dit punt, stelt u de coördinaten van de micromanipulator om 'nul' om nauwkeurige diepte metingen mogelijk te maken.
8. Advance in 1 micrometer stap-modus totdat de patch pipet dringt de dura mater aangegeven door een plotselinge daling van de weerstand elektrode. Verwijder het bedrijf druk van de pipet.
9. Zoek naar afzonderlijke eenheden en bevordert tegelijk in 1 micrometer stappen. Bewaken van de elektrode weerstand continu door het toepassen van 200 msec aan / uit pulsen. Een toename elektrode weerstand typically geeft de nabijheid van een neuron. Vooraf de elektrode tot positieve actiepotentiaal (AP) golfvormen van ~ 2 mV worden geregistreerd (Figuren 2A en 2B).
10. Optioneel: Noteer de spontane stekelige patroon van het neuron en bepaal-whisker opgeroepen door spiking bijvoorbeeld caudaal afbuigen individuele bakkebaarden 200 msec onder een hoek van 3,3 ° met een piëzo-elektrische inrichting ^18.
11. Vooraf de elektrode totdat de weerstand 25-35 MQ en spikes hebben amplitudes van 3-8 mV tot optimale omstandigheden van juxtasomal vulling te verkrijgen. Start de juxtasomal vullen door toepassing vierkante pulsen van positieve stroom (1 nA, 200 msec aan / uit). Langzaam en geleidelijk verhogen van de huidige stappen van 0,1 nA terwijl het toezicht op de AP golfvorm en frequentie (Figuren 2A en 2B).
12. Bewaak het membraan opening als een duidelijke toename van de AP frequentie tijdens de on-fase van het blok puls (figuur 2C ). De piek golfvorm tijdens het vullen toont een verhoogde breedte en verminderde na-hyperpolarisatie (figuren 2C en 2D). Aanvullende parameters zijn onder meer geluid of een kleine (1-5 mV) negatieve DC verschuiving.
13. Verhogen of te verlagen van de huidige (1 nA) tijdens het vullen van een stabiele biocytine infusie behouden. Verminder of stop de stroompulsen bij plotselinge toename van de AP frequentie toxiciteit vermijden door overmaat instroom van extracellulaire ionen zoals natriumionen. Opmerking: elk neuron zal anders reageren op de huidige injectie en juxtasomal etikettering parameters moeten worden aangepast afhankelijk van de individuele opname-omstandigheden.
14. Nauw het signaal volgen na het stoppen van de huidige injectie. De spike golfvorm na een vulling sessie wordt meestal verbreed en toont een sterk gereduceerd na hyperpolarisatie. Wacht tot het herstel van het neuron, dat is duidelijk wanneer de piek golfvorm terug naar zijn oorspronkelijke eigenschappen (dwz de aanwezigheid vannormaal na-hyperpolarisatie, figuur 2).
15. Herhaal biocytine vullen sessies na volledig herstel van het neuron te biocytine belasting voor betere kleuring kwaliteit te verhogen.
16. Trek de patch pipet in stappen van 1 micrometer tot de piek amplitude afneemt aan mechanische stress te verminderen naar de cel. Wacht minstens 1 uur voor de biocytine om intracellulair te verspreiden terwijl nauwlettend controle van de lichaamstemperatuur van het dier en de ademhaling.

3. Perfusie van het dier en de hersenen verwijderen

1. Bereid de perfusie setup, spoelen, en preload de buis met 0,9% NaCl.
2. Plaats het dier op een chirurgische dienblad en beveiligen met standaard etikettering tape. Zorg voor voldoende diepte van de anesthesie, voet knijpen en ooglid reflexen moeten afwezig zijn.
3. Voeg een mediaal incisie (5-6 cm) lateraal door de buikwand net onder de ribbenkast en vervolgen in posterieure anterieure richting het borstbeen bloot.Trek het borstbeen naar voren en de lever zorgvuldig scheiden van het middenrif.
4. Voeg een kleine incisie in het membraan, dwars door de onderste ribben en blijven de incisie langs de gehele lengte van de buikholte naar het hart bloot.
5. Verwijder het pericardium.
6. Steek de naald in de linker ventrikel en een insnijding in het rechter atrium. Perfuseren met 0,9% NaCl (~ 8 ml / min) tot ontkleuring van de lever is voltooid.
7. Schakel de infusie tot 4% paraformaldehyde (PFA) tot stijfheid van voorpoot en onderkaak is duidelijk.
8. Onthoofden de rat met behulp van een schaar
9. Verwijder het resterende nekspieren en de schedel volledig bloot.
10. Plaats de schaar in de hersenstam aan de rugzijde en snijd het bot voorzichtig langs de pijlnaad, het handhaven van de dorsale positie.
11. Verwijder de beenderen aan beide zijden van de pijlnaad de hersenen bloot behulp van een tang. Verwijder de dura zorgvuldig d voorkomenAmage.
12. Steek voorzichtig een botte spatel om de ventrale zijde van de hersenen en verwijder de hersenen zachtjes.
13. Post-fix het hele brein overnachting in PFA bij 4 ° C. Schakel de hersenen 0,05 M fosfaatbuffer (PB) en bewaar bij 4 ° C.

4. Het snijden van de hersenen in Tangential Secties

1. Neem de hersenen uit de 0,05 M PB en zet het op een filter papier dat naar anterior. Gebruik een scherp scheermesje af te snijden van de kleine hersenen langs het frontale vlak en scheid de hersenhelften door te snijden langs het midden van de sagittale vlak.
2. Solliciteer secondelijm op de montageplaat en monteer de linker hersenhelft op haar sagittaalvlak met anterior naar rechts. Bevestig de montageplaat onder een hoek van 45 ° op een vibratome en dompel de hersenen in 0,05 M PB.
3. Bevestig een scheermesje op vibratome en zorg ervoor dat het eerste contact met het hersenoppervlak in het midden van de anterieure-posterieure vlak van de halve bol. Snijd 24 100 pmsecties en verzamelen ze in een 24-wells plaat met 0,05 M PB.

5. Histologische Procedures

1. Voer histologische protocollen voor het cytochroom oxidase kleuring ²⁴ en de avidine-biotine-peroxidase werkwijze volgens eerder beschreven werkwijzen ^25. Optioneel: visualiseer biocytine met fluorescerende avidine / streptavidine-Alexa conjugaten. Hierdoor kan bovendien dubbel-kleuring met retrograde of anterograde tracing technieken.
2. Wash secties 5 x 5 min met 0,05 M PB en bereiden 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)-bevattende oplossing voor het cytochroom oxidase kleuring om vaten visualiseren laag 4 (L4) van S1 (zie Tabel 2 voor oplossingen en reagentia). Incubeer secties 6-12 van de pia in de voorverwarmde oplossing gedurende 30-45 minuten bij 37 ° C.
3. Spoel secties met 0,05 M PB voor 6 x 5 min en lessen endogene peroxidase activiteit door incubatie van alle secties in 3% H ₂ O ₂ in 0,05 M PB gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
4. Spoel secties met 0,05 M PB voor 5 x 10 minuten. Incubeer secties in ABC-oplossing (zie tabel 3 voor oplossingen en reagentia) overnacht bij 4 ° C.
5. Spoel secties met 0,05 M PB voor 5 x 10 min en de voorbereiding van de DAB-oplossing voor de-biocytine gevulde neuron visualiseren (zie tabel 4 voor oplossingen en reagentia). Incubeer secties in gefiltreerde oplossing 45-60 minuten bij kamertemperatuur.
6. Spoel secties met 0,05 M PB voor 5 x 10 minuten. Mount hoofdstukken over microscoop dia's en dekglas met Mowiol (zie tabel 5 voor oplossingen en reagentia).
7. Bepaal etikettering kwaliteit met behulp van een lichtmicroscoop.

Results

Gedetailleerde kennis over 3D structuur van individuele neuronen is van cruciaal belang voor het ophelderen van organisatorische principes van neuronale netwerken. Onze methode houdt in een pijpleiding naar hoge kwaliteit biocytine etikettering bereiken van een in vivo voorbereiding, waardoor post hoc neuronale indeling en de gedetailleerde reconstructie van dendritische en axonale architectuur van enkele neuronen met een hoge resolutie. Afhankelijk van de kwaliteit van juxtasomal etikettering neuronen...

Discussion

De juxtasomal methode laat opnemen in vivo actiepotentiaal vastspijkeren van enkele eenheden over gedragsvoorwaarden (verdoofd, wakker-hoofd vast of vrij bewegende) met de optie van-biocytine labelen van de opgenomen neuron voor post hoc celtype classificatie en / of 3D-reconstructie. Het grote voordeel is fysiologische parameters in de extracellulaire (dus invasief) informatie te verkrijgen, maar het kunnen de neuron intracellulair label met biocytine ^16,17,32. Naast labeling biocytine Deze...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SM-6 control system	Luigs Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 Manipulatorblock X2
Lynx-8 versterker	Neuralynx
Axoclamp-2B versterker	Axon Instruments
Osada model EXL-M40	Osada, Inc.
Piezo-elektrisch apparaat	Physik Instrumente	PL140.10
LabView	National Instruments, Austin, TX, USA		LabView-verwervingssoftware
Ntrode Virtual Instrument	R. Bruno, Columbia Univ., NY
Sugi absorberende watten	Kettenbach	30601
Cytochroom C uit paardenhart	Sigma	C2506
Catalase uit runderlever	Sigma	C9322
DAB	Sigma	D5637
H2O2	Boom	7047
Vectastain standaard ABC-kit	Vector	PK6100
Triton X100	Sigma	T9284
Urethane	Sigma	U2500
Isoflurane	Pharmachemie	45.112.110
Lidocaine	Sigma	L5647
Simplex snelle tandheelkundige cement	Kemdent	ACR308/ACR924
Biocytin	Molekula	36219518
PFA	Merck Millipore	8187151000
Trizma base	Sigma	T4661
Mowiol 4-88	Aldrich	81381
Analytisch glycerol	Fluka	49767
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma Aldrich	31434
KCl	Sigma Aldrich	60130
CaCl	Sigma Aldrich	22.350-6
MgCl2	Fluka	63072