Methodenartikel

Een protocol voor het analyseren van hepatitis C virus replicatie

DOI:

10.3791/51362

⸱

26 juni 2014

 ,  , 
1Liver Program at Regenerative Medicine Institute, Department of Biomedical Sciences, Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatitis C Virus (HCV) is een belangrijk humaan pathogeen dat leveraandoeningen veroorzaakt, inclusief cirrose en kanker. Een HCV-infectieus celkweeksysteem is essentieel voor het begrijpen van het moleculaire mechanisme van HCV-replicatie en het ontwikkelen van nieuwe therapeutische benaderingen. Hier beschrijven we een protocol om verschillende stadia van de HCV-replicatiecyclus te onderzoeken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatitis C virus (HCV) treft 3% van de wereldbevolking en veroorzaakt ernstige leverkwalen waaronder chronische hepatitis, cirrose en leverkanker. HCV is een omhuld RNA-virus van de familie Flaviviridae. Voor deze behandeling niet volledig effectief en veroorzaakt bijwerkingen. Er is geen HCV-vaccin. Aldus is verdere inspanningen vereist voor een vaccin te ontwikkelen en betere therapie. Een HCV celcultuur systeem is essentieel voor het bestuderen van verschillende groeistadia HCV waaronder virale binnenkomst, genoom replicatie, verpakking en uitgang. In de huidige werkwijze voorgesteld, gebruikten we een wildtype intragenotype 2a chimeer virus, FNX-HCV, en een recombinant FNX-Rluc virus met een Renilla luciferase reportergen de virusreplicatie te bestuderen. Een menselijke hepatoomcellijn (Huh-7 gebaseerde) werd gebruikt voor transfectie in vitro getranscribeerde RNA HCV genoom. Celvrije kweeksupernatanten, eiwit lysaten en total RNA werden geoogst op verschillende tijdstippen na transfectie groei HCV beoordelen. HCV-genoom replicatie status werd geëvalueerd door kwantitatieve RT-PCR en visualiseren van de aanwezigheid van HCV dubbelstrengs RNA. De HCV-eiwitexpressie werd bevestigd door Western blot en immunofluorescentie assays met antilichamen specifiek voor HCV NS3 en NS5A eiwitten. HCV RNA getransfecteerde cellen vrijgegeven infectieuze deeltjes in de cultuur supernatant en de virale titer werd gemeten. Luciferasebepalingen werden gebruikt om de replicatie niveau en de besmettelijkheid van reporter HCV beoordelen. Samenvattend stellen wij diverse virologische assays voor het karakteriseren van verschillende stadia van de HCV replicatie cyclus.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatitis C virus (HCV) veroorzaakt cirrose en leverkanker. Het treft 170 miljoen mensen wereldwijd met 350.000 mensen sterven jaarlijks 1-3. HCV is een positieve streng RNA-virus met een genoom grootte van 9,6 kb. Het HCV-genoom wordt vertaald als een polyproteïne van ~ 3000 aminozuurresten die proteolytisch wordt gesplitst door verschillende cellulaire en virale proteasen in 10 polypeptiden. HCV is het prototype virus in het geslacht Hepacivirus en behoort tot de familie Flaviviridae 4. Bij blootstelling HCV vestigt een chronische infectie bij 80% van de individuen. De infectie is meestal asymptomatisch en tijdige diagnose kan therapeutische interventie aan de lever achteruitgang te voorkomen toe te staan. Huidige behandeling niet optimaal en er geen vaccin beschikbaar is 5,6.

De etiologie van hepatitis C werd eerst beschreven in 1989 7. Bestuderen HCV replicatie is belangrijk voor hepatitis C vaccin en behandelingsonderzoek, maar het waslang gehinderd door het ontbreken van een efficiënt viraal kweeksysteem. Een moleculaire kloon van HCV werd aangetoond besmettelijk bij chimpansees op intrahepatische inoculatie 8 zijn. Vervolgens werden sub-genomische HCV replicons beschreven, waardoor het virale genoom replicatie stadium ontleden in een celkweeksysteem 9,10. Ontdekking van een genotype 2a HCV isoleren JFH-1 (Japanse Fulminante hepatitis-1), kunnen infecteren celkweek nieuwe wegen geopend voor HCV replicatie onderzoek 11-13. Genotype 2a stam JFH-1 gebaseerde inter-en intra-genotypische chimere virussen en genotype 1 HCV gebaseerd besmettelijke cultuur systemen zijn ook beschikbaar 14-18.

We hebben met succes gebruik JFH-1 stam en HCV intragenotype 2a chimere virus aan de hoge-resolutie functionele profilering kaart van eiwit domeinen en cis-werkende RNA elementen 19,20 te verkrijgen. Volgens deze hier beschrijven we een effectieve systeem routinematig gebruikt waarmeebestuderen van verschillende stadia van de HCV replicatiecyclus en gastheer-pathogeen interactie. We presenteren virologische assays virale genoom replicatie en de novo infectiviteit van intragenotype 2a HCV en Renilla luciferase reportergen HCV beoordelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een algemeen overzicht van het protocol is geïllustreerd in figuur 1.

1. Cellen

  1. Bereid compleet groeimedium dat 10-15% foetaal runderserum (FBS), 10 mM niet-essentiële aminozuren, 10 mM Hepes, penicilline (100 eenheden / ml), streptomycine (100 mg / ml) en 2 mM L-glutamine bevat.
  2. Handhaaf Huh-7.5.1 cellen 13 volledig groeimedia die de hierboven supplementen voor in vitro analyse van hepatitis C virale replicatiecyclus.
  3. Cultuur virusstammen in Huh-7.5.1 cellen met de gespecificeerde aangevuld kweekmedium bij 37 ° C met 5% CO2.

2. Virus en plasmideconstructen

  1. Genereer de complementaire DNA (cDNA) vorm van HCV RNA en het kloneren in een plasmide vector voor het gemak van genetische manipulatie. Opmerking: De ontdekking van de Japanse fulminante hepatitis 1, JFH-1 (HCV genotype 2a), isoleer heeft kritisch voor onderzoek HCV geweest envoornamelijk voor het HCV replicatiecyclus 11-13 bestuderen. Inter-en intragenotypic chimère virussen gebaseerd op JFH-1 HCV worden vaak gebruikt in onderzoek 14-18. Bouw van synthetische intragenotype 2a chimere virus, FNX-HCV, en een monocistronische chimere reporter stam was eerder 19 en bouwdetails vallen buiten het bestek van dit protocol beschreven.
  2. Gebruik pFNX-HCV intragenotype 2a virus als het bevat een 5'NTR structurele gebieden en p7, en een deel van de NS2 niet-structurele gebieden (nucleotiden 1-2878) van de J6CF ouderstam (toegangsnummer NCBI Nr. AF177036), zoals alsook de niet-structurele componenten van de JFH-1 virale stam (NCBI toetreding geen. AB047639). Opmerking: FNX-HCV werd gesynthetiseerd gebaseerd op de sequentie van Jc1 intragenotype 2a chimere HCV eerder gerapporteerd 15.
  3. Genereer een monocistronisch chimere reporter viraal construct, de pFNX-Rluc basis van de pFNX-HCV-stam (aangehaald in stap 2.2) door er een Renilla luciferasegen tussen de 5 'NTR en core-gen (tussen nt 388 en 389). Vervolgens sluit u de luciferasegen en core-gen van deze constructie gebruik van een mond-en klauwzeer virus 2A (F2A) peptide sequentie, die zou werken als een decollete signaal.
  4. Ingenieur het RNA-polymerase-null (Pol-) virale construct met behulp van de pFNX-HCV of het pFNX-Rluc virale achtergrond. Vervang de NS5B polymerase katalytische residuen GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8623), een van deze virale backbones met AAG aminozuurresten.

3. In vitro HCV RNA transcriptie

  1. Gebruik een intragenotype 2a chimere virus FNX-HCV en FNX-HCV Pol null (Pol-) HCV voor de evaluatie van virale replicatie (Figuur 2A).
  2. Lineariseren de virale plasmiden met restrictie-enzym XbaI en daarna behandelen met mung bean nuclease om stompe uiteinden te genereren. Zuiver het verteerd plasmiden door anionenwisselingschromatografie. Controleer de integriteit of het gelineariseerde plasmide-DNA door het onderwerpen gelelektroforese (figuur 2B) agarose.
  3. Transcriberen de gelineariseerde virale plasmiden met de T7-RNA polymerase.
  4. Zuiver het nieuw gesynthetiseerde DNase behandelde RNA met een RNA zuiveringskit.
  5. Controleer de RNA productie door agarose gelelektroforese (figuur 2C).
  6. Kwantificeren van de RNA door spectrofotometrie.
  7. Bewaar de gegenereerde RNA -80 ° C in 10 ug aliquots werken. Opmerking: variatie RNA kwaliteit minimaliseren binnen elke proefopzet transcriberen alle RNA voor elk monster en virale controle tegelijk.

4. HCV RNA Transfectie en Sample Collection

  1. Oogst de Huh-7.5.1 cellen met behulp van trypsine.
  2. Om cellen, centrifuge spoelen en resuspendeer de schorsing tweemaal met koude laag serum media. Resuspendeer de cellen in laag serum media 1 x 10 7 cellen per ml.
  3. Meng een totaal van 10 & #956, g getranscribeerd viraal RNA met 400 ul van geresuspendeerde cellen (4 x 10 6 cellen) in een 0,4 cm elektroporatie-cuvette. Transfecteren de cellen via elektroporatie bij 270 V, 100 Ω en 950 uF.
  4. Resuspendeer de geëlektroporeerde cellen in 10 ml compleet kweekmedium met 15% FBS. Opmerking: Verhoogde overlevingsvermogen van geëlektroporeerde cellen wordt gezien wanneer de Huh-7.5.1-cellen werden gekweekt in 15% foetaal runderserum.
  5. Plaat de cellen in zowel T-25 kolven (~ 1,2 x 10 6 cellen per kolf) en 48 putjes (1 x 10 4 cellen per putje) voor elk van de volgende tijdstippen: 4, 48 en 96 uur.
  6. Vervang het medium bij 4-8 uur na transfectie met verse AANGEVULD groeimedium met 10% FBS om dode celresten uit de gekweekte kolven en platen te verwijderen.
  7. Oogst celcultuur supernatanten op 48, 96 uur tijdstippen en cellulaire resten te verwijderen van verzamelde monsters door centrifugering van cellen bij 1500 rpm gedurende 10 min bij 4 º C.
  8. Bewaar de cel-vrije supernatanten bij -80 º C. Lyseren van de cellen op eiwit en RNA analyse door Western blot en omgekeerde transcriptie-kwantitatieve PCR op de aangegeven tijdstippen.

5. Reverse transcriptie-kwantitatieve PCR (RT-qPCR) voor het beoordelen van de HCV-exemplaren van het genoom

  1. Voer een twee-staps RT-qPCR aan de HCV RNA genoom aantal kopieën te bepalen.
  2. Reverse transcriptie 1 ug totaal cellulair RNA met behulp van reverse transcriptase en een primer specifiek voor HCV sense streng die bindt aan 5'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') of een primer specifiek voor huishoud-gen peptidylprolyl isomerase G (R PPIG : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). Ook reverse transcriberen FNX-HCV-RNA (gegenereerd in stap 3) van bekende exemplaren van het genoom (10 januari-10 september-standaard) met sense HCV streng primer.
  3. Verricht qPCR met behulp van 50 ng van de resulterende getranscribeerd cDNA met behulp van specifieke primers HCV (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') en DNA bindende groene kleurstof bevattende qPCR super mix. Voer qPCR voor huishoud-gen PPIG evenals (primers PPIG F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; PPIG R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Opmerking: Voor de berekening van accurate intracellulair HCV-RNA-niveau in monsters, gebruiken cellulaire huishoud-gen, PPIG , expressie (Ct cyclus) voor normalisatie. Gebruik het aantal kopieën van de FNX-HCV-genoom als de standaard voor het aantal kopieën bepalen.
  4. Gebruik de volgende voorwaarden bij het uitvoeren van qPCR HCV RNA aantal kopieën te bepalen: 95 º C gedurende 15 seconden en 60   º C gedurende 30 sec (40 cycli) met behulp van real-time PCR-systeem.
  5. Zie Figuren 3A en 3B voor genoomreplicatie resultaten.

6. Western blot analyse voor het detecteren van HCV-eiwitexpressie (figuur 3C)

  1. Gebruik cellysaten frOM viraal RNA getransfecteerd bij 96 uur na transfectie voor eiwit western blotting analyse.
  2. Los het cellysaat met SDS-PAGE en transfer naar polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan.
  3. Blokkeer het membraan met behulp van een blokkerende oplossing die 5% magere melk, 0,2% Tween 20 in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
  4. Incubeer het membraan met primaire muis monoklonaal antilichaam NS3 (1 op 1000 verdunning) en beta-actine (1 op 5000 verdunning).
  5. Add geit anti-muis IgG geconjugeerd aan mierikswortelperoxidase (1 in 5000 verdunning) en gedetecteerd door chemiluminescentie.

7. Immunofluorescentietest (IFA)

  1. Bevestig de HCV-geïnfecteerde en getransfecteerde cellen met methanol gedurende 30 minuten bij -20 ° C voor immunofluorescentie assay.
  2. Was de cellen met PBS drie keer en blokkeren met IFA blokkerende buffer.
  3. Gebruik konijn polyklonaal anti-NS5A primair antilichaam (vriendelijk verschaft door Dr Dasgupta, UCLA) of muizen monoklonale anti-DSRNA antilichaam J2 bij een verdunning van 1:200 (1 ug / ml) en incubeer gedurende 5 uur 's nachts bij 4 º C.
  4. Was de cellen met PBS driemaal na het primaire antilichaam.
  5. Add geit anti-konijn IgG polyklonaal 488 secundair antilichaam of geit anti-muis IgG polyklonaal 594 secundair antilichaam bij een 1:1000 verdunning (1 ug / ml) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
  6. Was de cellen met PBS drie keer en vlek kernen met behulp van Hoechst kleurstof en bekijken met behulp van fluorescentie microscoop (Figuur 3D).

8. Meten virustiter

  1. Plate naïeve Huh-7.5.1 cellen bij ongeveer 3 x 10 3 cellen / putje met een 96-wells plaat. De volgende dag voeren 10-voudige seriële verdunningen van celvrij supernatant geoogst van HCV RNA getransfecteerde cellen met kweekmedium en beënt in drievoud op Huh-7.5.1 cellen.
  2. Fix cellen op 72 uur na infectie met behulp van methanol (30 minuten bij -20 º C) en immunostain voor HCV NS5A eiwit zoals vermeld in het hoofdstuk 7.
  3. Gebruik de hoogste verdunning te tellen voor de NS5A positieve brandpunten en bereken het gemiddelde aantal van de focus vormende eenheid (FFU) per milliliter. Zie Figuur 4 voor HCV titer.

9. Renilla luciferasereporter test voor virale genoom replicatie en besmettelijkheid

  1. Voor evaluatie virale genoom replicatie, plaat HCV-RNA geëlektroporeerd Huh-7.5.1 cellen in drievoud in 48 putjes (1 x 10 4 cellen / putje).
  2. Lyseren van de cellen met 75 ul van passieve lysis buffer bij de 6 uur, 48 uur en 96 uur na transfectie.
  3. Schud de platen voorzichtig gedurende 15 min bij kamertemperatuur en bewaar bij -80 ° C.
  4. Om de Renilla luciferase enzymatische activiteit te meten, dooi lysaat eiwit en Renilla luciferase assay reagens op kamertemperatuur.
  5. Voeg 20 ul van eiwit lysaat per putje van een 96-wel l witte luminescentie plaat en plaats de plaat in een lichtmeter.
  6. Doseer 100 ul Renilla luciferasetest reagens (coelenterazine substraat + buffer) per goed en na 2 sec pre-lezen vertraging; integreren het uitgezonden licht gedurende 10 sec.
  7. Bereken het gemiddelde en standaardafwijking voor elk monster uit de luciferase waarden van biologische drievoud en onderwerpt de gegevens aan statistische analyse (figuur 5).
  8. Ter beoordeling van infectiviteit, enten 500 ui celvrij supernatant, verkregen uit HCV-RNA-getransfecteerde cellen voor de aangegeven tijdstippen (48 uur en 96 uur) in drievoud op naïeve Huh-7.5.1 cellen in 48-well platen.
  9. Vervang de virale inoculum met 500 ul vers medium per well na 6 uur na infectie.
  10. Lyse van de cellen op 48 uur na infectie en onderworpen aan Renilla luciferase assay zoals beschreven in stap 8,2-8,7 (figuur 5).
TITEL "> 10. Statistische analyse

  1. De fout bars in de grafieken geven standaarddeviaties (SD). De P-waarden werden berekend door de ongepaarde t-test.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatitis C virus is een RNA-virus. Aldus genetische manipulatie Daartoe heeft de HCV genome cDNA gekloneerd in een bacterieel plasmide vector. Een T7 RNA polymerase promotersequentie werd onmiddellijk voor het einde van het HCV genoom van de 5 'geïntroduceerd. Een algemeen overzicht van de analyse HCV werkstroom weergegeven in figuur 1. HCV RNA genoom genereren nauwkeurige 3 'uiteinde, is het HCV-genoom bevattende plasmide geknipt met XbaI restrictie-enzym en de gegenereerde enkelstren...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze illustratie beschrijft een werkwijze voor het analyseren van het hepatitis C virus replicatie cyclus. HCV is een menselijk pathogeen en het voorgeschreven protocol inzake bioveiligheid moeten strikt worden opgevolgd. Besmettelijke HCV celkweek systemen zijn eerder 11-13,16,17 beschreven. Er zijn enkele cruciale punten die we bij het volgen van de geïllustreerde protocol te implementeren. Ten eerste is het van groot belang om een ​​goede kwaliteit van intacte volledige lengte viraal genomisch RNA voor dow...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken F. Chisari voor het verstrekken van de Huh-7.5.1-cellijn. Wij willen Justine Ho bedanken voor het bewerken van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door Cedars-Sinai Medical Center Institutioneel Programmatisch Onderzoeksaward en National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 aan V.A.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Fisher Scientific10-017-CV
Non essential amino acidFisher ScientificMT25025CI
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol RedLife Technologies11058-021
Huh-7.5.1The Scripps Research InstituteThe cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) Cedars-Sinai Medical CenterThe HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. 
XbaINew England Biolabs Inc.R0145S
Mung Bean NucleaseNew England Biolabs Inc.M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production SystemPromegaP1320
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm)BioexpressE-5010-4
Gene Pulser Xcell Total SystemBio-Rad165-2660
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 English & Scientific Consulting Kft.10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
PVDF membrane packageBio-Rad162-0263
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry MilkBio-Rad170-6404XTU
Tween-20Bio-Rad170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2]Abcamab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23]Abcamab13830
Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents GE Healthcare Life SciencesRPN2236
SUPERSCRIPT III RT Life Technologies18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROXLife Technologies11744500
ViiA 7 real-time PCR systemLife TechnologiesNA
Renilla Luciferase Assay System kitPromegaE2810
RNase-Free DNasePromegaM6101
GloMax-Multi Detection System (Luminometer)Promega

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
  2. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
  3. Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
  4. Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
  5. Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
  6. Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
  7. Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
  8. Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
  9. Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
  10. Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
  11. Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
  12. Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
  13. Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
  14. Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
  15. Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
  16. Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
  17. Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
  18. Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
  19. Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
  20. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
  21. Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
  22. Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
  23. Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
  24. Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
  25. Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
  26. Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
  27. Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

HCV replicatietransfectie van viraal RNAkwantitatieve RT PCRWestern blotimmunofluorescentie assaymeting van virale titerluciferase assaycelcultuursupernatantHuh 7 cellen

Gerelateerde artikelen