Method Article

Een protocol voor het analyseren van hepatitis C virus replicatie

DOI:

10.3791/51362

⸱

June 26th, 2014

 ,  , 
1Liver Program at Regenerative Medicine Institute, Department of Biomedical Sciences, Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatitis C virus (HCV) treft 3% van de wereldbevolking en veroorzaakt ernstige leverkwalen waaronder chronische hepatitis, cirrose en leverkanker. HCV is een omhuld RNA-virus van de familie Flaviviridae. Voor deze behandeling niet volledig effectief en veroorzaakt bijwerkingen. Er is geen HCV-vaccin. Aldus is verdere inspanningen vereist voor een vaccin te ontwikkelen en betere therapie. Een HCV celcultuur systeem is essentieel voor het bestuderen van verschillende groeistadia HCV waaronder virale binnenkomst, genoom replicatie, verpakking en uitgang. In de huidige werkwijze voorgesteld, gebruikten we een wildtype intragenotype 2a chimeer virus, FNX-HCV, en een recombinant FNX-Rluc virus met een Renilla luciferase reportergen de virusreplicatie te bestuderen. Een menselijke hepatoomcellijn (Huh-7 gebaseerde) werd gebruikt voor transfectie in vitro getranscribeerde RNA HCV genoom. Celvrije kweeksupernatanten, eiwit lysaten en total RNA werden geoogst op verschillende tijdstippen na transfectie groei HCV beoordelen. HCV-genoom replicatie status werd geëvalueerd door kwantitatieve RT-PCR en visualiseren van de aanwezigheid van HCV dubbelstrengs RNA. De HCV-eiwitexpressie werd bevestigd door Western blot en immunofluorescentie assays met antilichamen specifiek voor HCV NS3 en NS5A eiwitten. HCV RNA getransfecteerde cellen vrijgegeven infectieuze deeltjes in de cultuur supernatant en de virale titer werd gemeten. Luciferasebepalingen werden gebruikt om de replicatie niveau en de besmettelijkheid van reporter HCV beoordelen. Samenvattend stellen wij diverse virologische assays voor het karakteriseren van verschillende stadia van de HCV replicatie cyclus.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatitis C virus (HCV) veroorzaakt cirrose en leverkanker. Het treft 170 miljoen mensen wereldwijd met 350.000 mensen sterven jaarlijks 1-3. HCV is een positieve streng RNA-virus met een genoom grootte van 9,6 kb. Het HCV-genoom wordt vertaald als een polyproteïne van ~ 3000 aminozuurresten die proteolytisch wordt gesplitst door verschillende cellulaire en virale proteasen in 10 polypeptiden. HCV is het prototype virus in het geslacht Hepacivirus en behoort tot de familie Flaviviridae 4. Bij blootstelling HCV vestigt een chronische infectie bij 80% van de individuen. De infectie is meestal asymptomatisch en tijdige diagnose kan therape....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een algemeen overzicht van het protocol is geïllustreerd in figuur 1.

1. Cellen

  1. Bereid compleet groeimedium dat 10-15% foetaal runderserum (FBS), 10 mM niet-essentiële aminozuren, 10 mM Hepes, penicilline (100 eenheden / ml), streptomycine (100 mg / ml) en 2 mM L-glutamine bevat.
  2. Handhaaf Huh-7.5.1 cellen 13 volledig groeimedia die de hierboven supplementen voor in vitro analyse van hepatitis C virale replicatiecyclus.
  3. Cultuur virusstammen in Huh-7.5.1 cellen met de gespecificeerde aangevuld kweekmedium bij 37 ° C met 5% CO2.

2.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatitis C virus is een RNA-virus. Aldus genetische manipulatie Daartoe heeft de HCV genome cDNA gekloneerd in een bacterieel plasmide vector. Een T7 RNA polymerase promotersequentie werd onmiddellijk voor het einde van het HCV genoom van de 5 'geïntroduceerd. Een algemeen overzicht van de analyse HCV werkstroom weergegeven in figuur 1. HCV RNA genoom genereren nauwkeurige 3 'uiteinde, is het HCV-genoom bevattende plasmide geknipt met XbaI restrictie-enzym en de gegenereerde enkelstren.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze illustratie beschrijft een werkwijze voor het analyseren van het hepatitis C virus replicatie cyclus. HCV is een menselijk pathogeen en het voorgeschreven protocol inzake bioveiligheid moeten strikt worden opgevolgd. Besmettelijke HCV celkweek systemen zijn eerder 11-13,16,17 beschreven. Er zijn enkele cruciale punten die we bij het volgen van de geïllustreerde protocol te implementeren. Ten eerste is het van groot belang om een ​​goede kwaliteit van intacte volledige lengte viraal genomisch RNA voor dow.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Fisher Scientific10-017-CV
Non essential amino acidFisher ScientificMT25025CI
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol RedLife Technologies11058-021
Huh-7.5.1The Scripps Research InstituteThe cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) Cedars-Sinai Medical CenterThe HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. 
XbaINew England Biolabs Inc.R0145S
Mung Bean NucleaseNew England Biolabs Inc.M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production SystemPromegaP1320
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm)BioexpressE-5010-4
Gene Pulser Xcell Total SystemBio-Rad165-2660
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 English & Scientific Consulting Kft.10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
PVDF membrane packageBio-Rad162-0263
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry MilkBio-Rad170-6404XTU
Tween-20Bio-Rad170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2]Abcamab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23]Abcamab13830
Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents GE Healthcare Life SciencesRPN2236
SUPERSCRIPT III RT Life Technologies18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROXLife Technologies11744500
ViiA 7 real-time PCR systemLife TechnologiesNA
Renilla Luciferase Assay System kitPromegaE2810
RNase-Free DNasePromegaM6101
GloMax-Multi Detection System (Luminometer)Promega

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
  2. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
  3. Lavanchy, D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis C VirusHCV ReplicationViral RNA TransfectionQuantitative RT PCRWestern BlotImmunofluorescence AssayViral Titer MeasurementLuciferase AssayCell Culture SupernatantHuh 7 Cells

Related Articles