Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Histochemische kleuring van

42.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51381

⸱

13 mei 2014

 , 
1Feedstocks Division, Joint Bioenergy Institute, 2Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

In dit artikel

Samenvatting

De samenstelling van de plantencelwand varieert tussen weefselsoorten en kan lignine, cellulose, hemicellulosen en pectine omvatten. Er zijn verschillende kleuringstechnieken ontwikkeld om verschillen op celtypeniveau te visualiseren. Dit artikel is een samenstelling van veelgebruikte celwandkleuringstechnieken.

Samenvatting

Arabidopsis thaliana is een modelorganisme dat veel wordt gebruikt om verschillende cellulaire processen in planten te begrijpen en te manipuleren, en het is uitgebreid gebruikt in de studie van secundaire celwandvorming. De afzetting van de secundaire celwand vindt plaats nadat de primaire celwand is aangelegd, een proces dat uitsluitend wordt uitgevoerd door gespecialiseerde cellen zoals die weefsels vormen die vaten en vezels vormen. De meeste secundaire celwanden bestaan uit cellulose (40–50%), hemicellulose (25–30%) en lignine (20–30%). Er zijn verschillende mutaties geïsoleerd die de biosynthese van secundaire celwanden beïnvloeden, en de corresponderende mutanten kunnen al dan niet duidelijke biochemische samenstellingsveranderingen of visuele fenomenen vertonen, omdat deze mutaties kunnen worden gemaskeerd door compenserende reacties. Kleuringsprocedures zijn historisch gezien gebruikt om verschillen op cellulair niveau te tonen. Deze methoden zijn uitsluitend visuele analysemiddelen; niettemin is hun rol bij snelle en kritieke analyse van groot belang. Congorood en calcofluor wit zijn kleurstoffen die worden gebruikt om polysachariden te detecteren, terwijl Mäule en phloroglucinol worden vaak gebruikt om verschillen in lignine te bepalen, en toluidineblauw O wordt gebruikt om polysachariden en lignine differentieel te kleuren. De ogenschijnlijk eenvoudige technieken van sectioenering, kleuring en beeldvorming kunnen een uitdaging zijn voor beginners. Beginnend met de monstervoorbereiding met behulp van het A. thaliana model, beschrijft deze studie de protocollen van een verscheidenheid aan kleuringsmethodologieën die eenvoudig kunnen worden geïmplementeerd voor observatie van cel- en weefselorganisatie in secundaire celwanden van planten.

Inleiding

De celwand fabriek heeft een overvloed aan informatie binnen de verschillende onderdelen: lignine, cellulose, hemicellulose (xylan, glucuronoxylan, xyloglucan, arabinoxylan, gemengde koppeling glucaan, of glucomannaan), en pectine. Histologische technieken bieden belangrijke visuele aanwijzingen in het bestuderen van verschillen binnen de secundaire celwanden op organisatorisch en cellulair niveau. Verschillende histologische technieken werden ontwikkeld en is te vinden in de literatuur, maar deze technieken kan uitdagend en tijdrovend zijn voor beginners omdat zeer gedetailleerde protocollen met eenvoudige visuele instructies zijn zelden of nooit beschikbaar. Het doel van deze studie is om eenvoudige richtlijnen voor de histologische kleuring technieken bieden om beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen.

Snijden de stengel is de eerste stap bij visualisatie van celwanden en celvormen. Hoewel met de hand gesneden secties zijn goedkoop en nemen minder tijd voor te bereiden, gebruik van een vibratome biedt consistentie enlevert beelden van hoge kwaliteit. Met een vibratome kan produceren betere kwaliteit van de gegevens door het genereren van gelijke delen met dezelfde dikte, die helpt om scherpe beelden te produceren en vermindert de kans op het produceren onnauwkeurige verschillen tussen de monsters die eenvoudig worden veroorzaakt door een slechte monstervoorbereiding. Harsen gebruiken om verse exemplaren vast te stellen kan een uitdaging voor beginners en kan nog steeds tijdrovend zijn, zelfs voor experts als een analyse moet snel worden gedaan. Bovendien wordt het onmogelijk om eventuele biologische activiteit te meten met het monster wanneer deze is ingebed in een hars. Een eenvoudige techniek die agarose en een zelfgemaakte mal werkzaam is nuttig voor het inbedden stam weefsels, en het kan ook worden gebruikt in andere toepassingen die dissectie van zacht weefsel. Vergeleken met inbedding specimens hars, heeft deze methode het voordeel dat de weefsels in leven en reducerende monsterbuffer manipulatie. Snijden weefsels via een vibratome is zeer nauwkeurig en genereert homogenlende secties, die, afhankelijk van het doel van de studie, dan kan worden gebruikt met verschillende kleuringen.

De eenvoudigste methoden om lignine en andere aromaten visualiseren in dienst ultraviolet (UV) licht. Excitatie van aromatische gebaseerde moleculen met UV licht is een oude techniek, maar het is nog steeds een van de snelste benaderingen voor visualisatie van lignine. Echter, UV-visualisatie is eigenlijk niet ideaal voor lignine detectie omdat UV-licht andere aromaten zal prikkelen. Lignine bestaat voornamelijk uit drie bouwstenen, de monolignols (hydroxycinnamyl alcoholen: coniferylalcohol, sinapyl alcohol, en p-coumaryl alcohol) 1-3. Phloroglucinol vlek kan aanwijzingen geven de mate van cinnamaldehydes aanwezig in het xyleem, vezels, weefsels en trachea 4. Floroglucinol is een goede indicator van de algemene cinnamaldehydes en kan onderscheid maken tussen cinnamaldehydes en andere aromaten. De sinapyl alcohol monomeren kan worden gedetecteerden gedifferentieerd door het gebruik Maule vlek. Toluïdineblauw O is een polychromatische kleurstof en derhalve is de mogelijkheid om verschillende onderdelen van de celwand vlekken in verschillende kleuren 5,6. Het primaire gebruik van toluïdineblauw O is aan pectine en lignine 5,6 detecteren. Het voordeel van toluïdineblauw O is dat veel elementen van de celwand kan worden gevisualiseerd in een enkele stap. Zowel calcofluor witte en congorood gemakkelijk in gebruik en kunnen worden gebruikt om cellulose te visualiseren. Calcofluor witte vlekken cellulose, callose, en andere niet-gesubstitueerde of gesubstitueerde zwak β-glucanen 6-9, terwijl Congo rood vlekken direct β-(1 → 4)-glucanen en in het bijzonder cellulose 10,11. Het doel van deze studie is om eenvoudige richtlijnen voorzien in het gebruik van de hiervoor genoemde kleuring technieken om beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen van A. thaliana stengels.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Stem Embedding

  1. Maak een 7% agarose-oplossing in water (7 g elektroforese-grade agarose in 100 ml gedestilleerd water). De agar autoclaaf gedurende 20 minuten of door de magnetron gedurende 20 minuten bij laagste intensiteit (bijvoorbeeld 10% intensiteit van een 1250 watt magnetron).
  2. Bereid een zelfgemaakte mal voor het inbedden van de stelen met behulp van plastic flesjes.
    1. Met behulp van een scheermesje, afgesneden van de conische bodem van 2 ml met schroefdop microcentrifugebuis (deel A). Met een injectienaald, prik een gat in de buis dop iets groter dan de diameter van de steel worden ingebed. Vervolgens cut 0,5 cm van de bodem van een 0,6 ml microcentrifugebuis (deel B).
    2. Voeg de cut-off van 0,5 cm deel van de 0,6 ml microcentrifugebuis in de voorgesneden 2 ml microcentrifugebuis. Dicht de twee delen met Parafilm (figuur 1). OPMERKING: De onderkant van de buis wordt gesneden om de verwijdering van de ingebedde monster vergemakkelijken nadat de agarose is gestold. Thij gat in de dop zal helpen bij het houden van de stam stabiel als de stam is ingebed in agarose. De schimmel zal dienen om de agarose te houden en houd de stam recht bij het inbedden. De Parafilm houdt de beide delen A en B, totdat de agarose is ingesteld en de steel is ingebed.
    3. Met behulp van een scheermesje, snijd een deel voort uit het gebied van belang, (bijv. midden van de eerste stam internodium). OPMERKING: Idealiter zou de stengel vlak voor inbedding vernietiging te voorkomen door dehydratatie worden gesneden. Alternatief kan de steel tijdelijk opgeslagen in een plaat met een filterpapier bevochtigd met water. Deze plaat kan op ijs tot klaar om te worden ingebed weefsel uitdroging en vervorming te voorkomen worden geplaatst. Opslag van de steel voor een periode langer dan 30 minuten zonder hoge vochtigheid zal de steel te drogen.
  3. Smelt de agarose in de magnetron op lage intensiteit. LET OP: De fles met agarose kan heet zijn. Gebruik een mitt te halen de fles. Laat de gesmolten agarose stand bij kamertemperatuur (tussen 20 ° C en 25 ° C) tot het afkoelt tot ongeveer 50 ° C.
  4. Langzaam pipet 5 ml van de agar in de premade plastic mal om het flesje te vullen. OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de mallen. Luchtbellen lacunes leiden in de agarose mal en zal niet volledig bedekken de stam steekproef, die uiteindelijk zal leiden tot ongelijke snijden van het monster secties.
    1. Laat de agarose afkoelen 30-60 sec tot halfvaste geworden. Test met een kleine tandenstoker, om ervoor te zorgen dat het kan binnendringen en opstaan, maar niet zweven, in de agarose. OPMERKING: Als de stam wordt geplaatst wanneer de agarose nog warm is zal het monster beschadigen door verschrompeling van de stam, het vernietigen van de cel morfologie.
    2. Plaats de steel in deze agarose-vial. Zorg ervoor dat de steel blijft recht. Plaats de geperforeerde dop zodanig dat het uiteinde van de steel wordt gehouden door de kap. Draai niet aan de schroefdop. Soms meer dan een stam (van een enkele soort) kan embe zijndded in een enkele flacon; maar in dat specifieke geval geen gebruik maken van de dop. OPMERKING: Als de schroefdop is ingeschakeld, zal de stam krijgen twisted.
  5. Laat het flesje bij kamertemperatuur of bij 4 ° C gedurende 10-30 min, totdat het stolt.
  6. Verwijder de mal door het voorzichtig uit de buis te schuiven. Open de Parafilm. Duw de onderkant van deel B van de mal voorzichtig met duim om de gestolde agarose bevrijden van deel A op een glazen objectglaasje.
  7. Snij de agarose ingebed stam in drie ongeveer gelijke stukken van 1,2 cm. Knip het deel van de stengel die niet in de agarose en gooi deze weg.
    1. Bewaar deze stukken van agarose met de embedded stengels in luchtdichte 2 ml microcentrifugebuizen in een donkere doos bij 4 ° C tot gebruik sectie. Ook bewaart de buizen bij 4 ° C gedurende maximaal een week. OPMERKING: Opslag is mogelijk, maar de onderzoeker moet zich bewust zijn dat de ingebedde stengels zijn nog in leven en, afhankelijk van het experiment, Artefacten zou kunnen worden ingevoerd.

2. Stem Sectioning

  1. LET OP: Lees de vibratome zorgvuldig en volg alle veiligheidsinstructies.
  2. Zorg ervoor dat het monster schijf schoon en volledig droog (vrij van vaste of vloeibare). Maak de objectplaatje met een scheermesje om eventuele lijmresten van eerdere experimenten te verwijderen en wassen met water. Dan droog met een papieren handdoek. OPMERKING: Dit zal ervoor zorgen dat de lijm werkt goed en bindt aan de agarose specimen. Als deze stap niet goed wordt uitgevoerd, is het mogelijk dat het monster niet kan voldoen aan de schijf en zal later leiden tot het monster af de schijf valt tijdens het snijden.
    1. Gebruik zacht papier doekjes om eventueel vocht uit de agarose blok met de exemplaren te verwijderen.
    2. Breng een druppeltje weefselhechtmiddel op de objectplaatje. Streak uit de lijm het gebied in het midden van de plaat bedekken met de punt van de lijm fles. Snel plaatsde agarose blok zodat de specimens ofwel loodrecht op of parallel aan de plaat transversale en longitudinale doorsneden, respectievelijk. Laat de lijm het monster vast aan de objectplaatje bij kamertemperatuur of bij 4 ° C gedurende 10-30 minuten. OPMERKING: Dit is een tijd-gevoelige stap.
  3. Bevestig de objectplaatje op zijn plaats op de buffer lade of trog. Het blok / s agarose met de onderdelen dient tegelijk met het scheermesje. Vul het bufferbak met gedestilleerd water bij kamertemperatuur totdat de monsters volledig ondergedompeld.
  4. Snijd een scheermesje in de helft en dan snijd de uiteinden met een stevige schaar, zodat het blad vlak blijft. Bevestig de helft van de voorgesneden scheermesje op de meshouder.
    1. Stel de hoek op de meshouder tot 84 °, de snelheid tot 0,90 mm / sec (positie 8 op de vibratome) en de frequentie tot 50 Hz (positie 5 op de vibratome). Maak doorsneden van 100 urn dik. Gebruik continue modus. NOTE: Deze dikte is geselecteerd om te verzekeren dat het weefsel de verschillende zuur en base behandelingen gebruikt in sommige van de kleuringsprotocollen kan weerstaan. Stel het venster voor het snijden en laat 15-20 minuten op een continue wijze voor de vibratome sectie een agarose blok van ongeveer 1,2 cm.
  5. Verzamel de secties met een wegwerp plastic pipet tijdens het snijden in de buffer lade. Als alternatief kan de secties worden overgedragen van de buffer lade in een glazen beker en vervolgens naar een duidelijke Petri plaat. Transfer paar secties om de 2,0 ml microcentrifugebuizen. Opmerking: De monsters zijn verzameld uit een Petri schaal omdat het gemakkelijker is om de onderwerpen op een heldere achtergrond zien, en omdat de bufferbak kan worden klaar voor het volgende monster.
  6. De secties kunnen worden opgeslagen in een 50 ml buis of verzameld en opgeslagen in 1,5 tot 2 ml microcentrifuge buizen bij 4 ° C gedurende 30 tot 60 minuten. OPMERKING: Het opslaan van de secties voor langere perioden zullen resulteren in een slechte beeldkwaliteit.

3. Microscoop en Camera Setting for Imaging

  1. Pas de Koehler verlichting op de microscoop. Kies een doel. Focus op het model eerste. Breng de lichtintensiteit aan de helft of minder. Sluit het velddiafragma (FD) en diafragma (AP) of brengen de laagst mogelijke stand op die doelstelling.
    1. Hoe hoger de vergroting, hoe groter de ring zal zijn. Gebruik de condensor focalisatieknop om het veld iris zich zo sterk mogelijk te maken.
    2. Langzaam breng het beeld van het veld iris (zeshoekige kleine ring) naar het centrum via de condensor-centrering knoppen (pin-vormige schroeven rondom de condensor). Verhoog langzaam het membraan (FD), zodanig dat het veld iris de rand bereikt. Stoppen met het verhogen van de FD net na het veld iris de rand is verstreken.
    3. Verhoog langzaam het diafragma (AP) om het contrast aan te passen. Pas de lichtsterkte naar behoefte. OPMERKING: Koehler verlichting moet worden aangepast voor elke oOEL, elke experimentele dag. Noteer de nummers verkregen na correctie voor de dag. Deze nummers zullen worden hergebruikt elke keer dat de doelstellingen heen en weer worden geschakeld voor die bepaalde dag.
  2. Stel het diafragma, de intensiteit, belichtingstijd, gain, en filters zoals beschreven in Tabel 1. Deze informatie mag alleen worden gebruikt als een gids.
  3. Gebruik een hoge resolutie digitale camera met een groot formaat interline CCD-chip zonder mechanische sluiter om de fluorescentie beelden vast te leggen; en een hoge-resolutie, high-speed camera voor bright-field beelden.
  4. Verwerk de dia met standaardsoftware. Laad de software. Klik op "Acquire" en "Set camera / board 'en selecteer de camera te gebruiken. Klik op "OK." Klik op "Ophalen" gevolgd door "tabblad Kleur." Under "tab Color," kies "Bayer methode" gevolgd door "Gemiddeld vier." Voeg de voorgestelde versterking (rood, groen, blauw) weerm. Tabel 1. Selecteer het tabblad "Set opslaan" en klik op de map waar afbeeldingen moeten worden opgeslagen. Stel "Sluitertijd" van de suggesties in Tabel 1. Stel "Binning" op "1" en "Leef binning" op "1." Focus op het gebied van belang en klik op "Opslaan levend."
  5. De beelden op de camera software zijn in de "TIF" formaat. Analyseer de afbeeldingen voor orthopedie van de celtypen. Maken gebruik van standaard software voor downstreamgebruik van presentatie en publicatie.

4. Ultraviolet en bright-field imaging

  1. Gebruik een pipet 1 ml met pipet tip gesneden zodat de delen gemakkelijk kan worden gepipetteerd uit. Voorzichtig pipet secties in de punt en op een microscoopglaasje. Bedek de secties met een dekglas. Let op de secties onder UV-licht of bright-field verlichting.

5. Phloroglucinol-HCl (Wiesner) kleuring 12

  1. Los 0,3 g floroglucinol in 10 ml absolute ethanol met 3% phloroglucinol te bereiden. Meng een deel geconcentreerd HCl (37 N) twee volumes 3% floroglucinol in ethanol; deze oplossing floroglucinol-HCl (Ph-HCl) of Wiesner vlek. OPMERKING: Deze oplossing is vers gemaakt worden op de dag van de kleuring en kan niet worden opgeslagen, omdat de oplossing zal na verloop van tijd en de vlekken komen te vervallen. LET OP: HCl is zeer corrosief, dus heel voorzichtig tijdens het hanteren van de Ph-HCl vlek.
  2. Transfer stengeldelen een 2,0 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 ml van de Ph-HCl oplossing voor de buis met de secties en dop onmiddellijk omdat het HCl in de Ph-HCl vlek is zeer corrosief. Beweeg de buis om te verzekeren dat alle onderdelen zijn gekleurd. Een alternatief voor deze stap is het dopje open te houden zodat de Ph-HCl-oplossing op en neer kan worden gepipetteerd, bij voorkeur zonder de secgen. OPMERKING: Zorg dat u de onderdelen niet te pipet in de pipet tip, als deze die delen kunnen beschadigen.
    1. Gebruik een pipet 1 ml met de pipetpunt gesneden zodanig dat de delen gemakkelijk kunnen worden gepipetteerd zonder schade. Voorzichtig pipet secties in de punt en op een objectglaasje. Bedek de secties met dekglas. Let op de secties onder bright-field verlichting. OPMERKING: De Ph-HCl-oplossing droogt 5-10 minuten, waardoor een verslechtering van de specimens. Daarom is de beeldvorming moet worden voltooid binnen die periode.

6. MAULE kleuring 13,14

  1. Los 0,2 g kaliumpermanganaat in 40 ml gedestilleerd water tot een 0,5% kaliumpermanganaat oplossing te bereiden. Bewaren in een donkere fles bij kamertemperatuur gedurende maximaal 7 dagen.
    1. Bereid een 3,7% HCl-oplossing door toevoeging van 1 ml geconcentreerd HCl (37 N) 9 ml gedestilleerd water (01:10). Bereid een verse 3,7% HCl-oplossing op dedag van het experiment. Zorg ervoor dat de 37 N HCl stockoplossing wordt gebruikt is niet te oud. Geconcentreerd ammoniumhydroxide-oplossing (14,8 M) moeten worden bewaard bij 4 ° C te voorkomen dat de molariteit van de verzadigde oplossing van af.
  2. Transfer stengeldelen een 2,0 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 ml van de 0,5% kaliumpermanganaatoplossing de buis met de secties.
    1. Pipetteer de 0,5% kaliumpermanganaat-oplossing op en neer voorzichtig, bij voorkeur zonder de secties. Incubeer gedurende 2 minuten en herhaal het pipetteren. Laat de microcentrifugebuisje staan ​​totdat alle secties settelen. OPMERKING: Zorg dat u de onderdelen niet te pipet in de pipet tip als voor de afdelingen kan beschadigd raken. Het kan moeilijk zijn om de stengeldelen zien als de oplossing is donker, dus houd de buis met de hoofdstukken over reageerbuis rek en laat ze gedurende 2 minuten.
    2. Met behulp van een pipet 1 ml, trekken uit 700 pi van 0,5% kaliumpermanganaat oplossing.Voeg 700 ul van gedistilleerd water te spoelen kaliumpermanganaatoplossing. Herhaal dit 3-4x of tot de oplossing van water helder blijft.
    3. Gooi het water. Voeg snel 1 ml 3% HCl tot de diepbruine kleur van de secties wordt afgevoerd. Dit kan gebeuren binnen 3-5 min dan 2 wasbeurten van 5 minuten elk vereist. Pipet alle 3% HCl-oplossing en meteen doorgaan naar de volgende stap.
    4. Voeg 1 ml geconcentreerde ammonia. Gebruik een pipet 1 ml met de punt gesneden zodanig dat de delen gemakkelijk kunnen worden gepipetteerd zonder schade. Voorzichtig pipet secties in de punt en op een objectglaasje. Bedek de secties met een dekglaasje. Let op de secties onder bright-field verlichting. LET OP: Omdat ammonium hydroxide is uiterst corrosief, het vereist extra zorg en aandacht om te voorkomen dat corrosie van het stadium van de microscoop of de lens. OPMERKING: De ammoniumhydroxide dampen kan het dekglaasje mist, waardoor het moeilijk is om het monster te observeren. Wees daarom extra voorzichtig voor het toevoegen van het dekglaasje. De oplossing droogt in 5-10 minuten, zodat de beeldvorming moet worden voltooid binnen die periode.

7. Congo rood kleuring 11,15

  1. Los 0,5 g congo in 100 ml gedestilleerd water tot een 0,5% Congo rood te bereiden.
  2. Transfer stengeldelen een 2,0 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 ml van de 0,5% Congo rood-oplossing aan de buis. Pipet voorzichtig de 0,5% congo rode oplossing op en neer zonder verstoring van de secties. OPMERKING: Zorg dat u de secties in de pipet tip omdat dit de secties schade niet te pipet.
    1. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en herhaal het pipetteren. Breng vervolgens nog 3 min incubatie bij kamertemperatuur.
    2. Gebruik een pipet 1 ml te trekken uit 700 pi van 0,5% congo rode oplossing. Voeg 700 ul van gedistilleerd water te spoelen de congo rode oplossing. Herhaal het wassen 3-4x tot het sopis duidelijk.
    3. Gebruik een pipet 1 ml met de punt gesneden zodanig dat de onderdelen gemakkelijk kunnen worden gepipetteerd zonder schade. Voorzichtig pipet secties in de punt en op een objectglaasje, en bedek ze met een dekglaasje. Let op de monsters op de microscoop dia onder blauw licht excitatie met behulp van een filter met een bandpass van 560/40. OPMERKING: Raak de onderdelen in het water op te slaan voor lang voor de microscopische analyse, zoals het water de congo rode uitwasbaar zijn in 10-30 minuten.

8. Calcofluor Wit kleuring 9

  1. Los op 0,02 g van fluorescerende witmakers 28 (calcofluor wit M2R) in 10 ml gedestilleerd water tot een 0,2% stockoplossing te bereiden. De 0,2%-oplossing kan worden opgeslagen gedurende zes maanden in een donkere fles bij 4 ° C. Bereid een werkende oplossing van 0,02% door verdunning van de 0,2% stockoplossing 10x met gedestilleerd water.
  2. Transfer stengeldelen een 2,0 ml microcentrifugebuis. In de buis 1 ml van 0.02% calcofluor wit oplossing. Pipet voorzichtig de 0,02% calcofluor witte oplossing op en neer. OPMERKING: Zorg dat u de secties in de pipet tip omdat dit de secties schade niet te pipet.
    1. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en herhaal het pipetteren. Incubeer de sectie nog 3 min bij kamertemperatuur geroerd. OPMERKING: Laat de secties om zich te vestigen op de bodem van de buis om het gemakkelijker maken om pipet uit de oplossing zonder beschadiging van de secties.
    2. Gebruik een pipet 1 ml te trekken uit 700 ul van 0,02% calcofluor witte oplossing en voeg 700 ul van gedestilleerd water; wacht 5 min te spoelen de calcofluor witte oplossing. Herhaal het wassen 3-4x. Gebruik een pipet 1 ml met pipet tip cut op zodanige wijze dat de delen gemakkelijk kan worden gepipetteerd uit zonder schade.
    3. Voorzichtig pipet secties in de punt en op een objectglaasje en dek ze af met een dekglaasje. Let op de secties onder UV-licht.

9. Toluidine Blue O kleuring 16,17

  1. Los op 0,02 g toluïdineblauw O in gedestilleerd water tot 100 ml van een 0,02%-oplossing te bereiden. OPMERKING: De toluïdineblauw O oplossing kan worden bewaard gedurende twee weken in een donkere fles op kamertemperatuur.
  2. Transfer stengeldelen een 2,0 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 ml van 0.02% toluïdine blauw O oplossing aan de buis. Pipet voorzichtig de 0,02% toluïdineblauw O oplossing op en neer. Vervolgens incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en herhaal het pipetteren keer. OPMERKING: Zorg dat u de secties in de pipet tip omdat dit de secties schade niet te pipet. Laat de microcentrifugebuisje stilstaan ​​totdat de secties settelen. Dit kan moeilijk zijn om te zien, als de oplossing is donker, dus houd de buis met de hoofdstukken over reageerbuis rek en laat ze gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    1. Gebruik een pipet 1 ml te trekken uit 700 ul van 0,02% toluïdineblauw O oplossing. Voeg 700 ul van gedistilleerd water te spoelen de toluïdineblauw O solution. Herhaal dit 3-4x of tot het waswater oplossing helder is. Gebruik een pipet 1 ml met de pipetpunt gesneden zodanig dat de delen gemakkelijk kunnen worden gepipetteerd zonder ze te beschadigen.
    2. Voorzichtig pipet secties in de punt en op een objectglaasje en dek ze af met een dekglaasje. Let op de secties onder bright-field verlichting.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Stem Embedding en Snijden:
Het gebruik van de zelfgemaakte plastic mal insluiten stelen in 7% agarose bleek gemakkelijk (figuur 1). De twee delen (A en B; figuur 1) van de embedded flacon systeem maken het eenvoudig om gemakkelijk de steel ingebed in agarose als de agarose plakt niet aan de flacon onderdelen die inert zijn los, waardoor het systeem schoon. De flesjes kan meerdere keren worden hergebruikt jaar. Het gemak van het opslaan van de ingebedde stam maakt de volgende stap...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

A. thaliana stengeldelen worden veel gebruikt om de organisatie van de cellen in de secundaire celwand bestuderen en kwalitatief onderzoek van de verschillen tussen wildtype en transgene planten. De meest gebruikte technieken voor het snijden van de exemplaren zijn directe snijdend; of wanneer monsters zijn ingebed in agarose of fixeermiddel kan snijden worden gedaan met een vibratome of microtoom. In tegenstelling tot de hand snijden, de laatste twee mogelijk maken waardoor de kans op het produceren onnauwkeur...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen financiële belangen bekend te maken.

Dankbetuigingen

Wij zijn dankbaar voor Sabin Russell te bewerken hulp. Dit werk maakte deel uit van de DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org) ondersteund door het Amerikaanse ministerie van Energie, Office of Science, Bureau van biologische en milieu-onderzoek, door middel van contractonderzoek DE-AC02-05CH11231 tussen Lawrence Berkeley National Laboratory en het Amerikaanse ministerie van Energie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AgaroseEMDMERC2125CAS-nummer: 9012-36-6
PhloroglucinolSigmaP 35021,3,5-trihydroxybenzeen [CAS-nummer: 108-73-6]
ZoutzuurEMDHX0603-75CAS-nummer: 7647-01-0
AmmoniakEMDAX1303-6CAS-nummer: 1336-21-6
Toluidinblauw OSigmaT3260Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS-nummer 92-31-9] 
KaliumpermanganaatSigma223468CAS-nummer 7722-64-7 
Ethanol 190 proofKOPTECV1401CAS-nummer: 64-17-5
CongoroodSigma C6277Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaftaleen 1-sulfonaat) [CAS-nummer 573-58-0]
Fluorescente ophelderaar 28/ Calcofluor White StainSigmaF3543 4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbeen-2,2'-disulfonzuur [CAS-nummer 4404-43-7] 
VibratomeLeicaLeica Vibrating blade microtome VT1000Shttp://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
VeiligheidsscheermesjeAmerican Safety razor companyArtikelnr. 60-0139-0000 Roestvrijstalen scheermesje met dubbele snede (Personna Super)
Schroefdop microcentrifugebuisjes (2 ml)VWR16466-044
Microcentrifugebuisjes (0,6 ml)Axygen ScientificMCT-060-C
HandschoenBel-Art380000000SCIENCEWARE  Hot Hand Protector Mitt
WeefselkleefstofTed Pella Inc10033Bewaar bij 4 °C of 20 °C voor 3 maanden of langere opslag
MicrogolfovenPanasonicNN-SD762SPELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive 
Camera met CCD-chip zonder mechanische sluiter HamamatsuC4742-95
Hoge snelheid kleurencamera   QImagingMicroPublisher 5.0 RTV
Camerasoftware  Molecular DevicesMetaMorph versie 7.7.0.0
Beeldanalyse Adobe Photoshop CS4
Microdekglazen, vierkant, nr. 1VWR48366-06722 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Dekglasjes zijn corrosiebestendig en uniform dik en vlak. Nr. 1 dikte is 0,13 tot 0,17 mm.
Mat microscoopglaasjes, 1 mmVWR48312-00375 x 25 mm - 1 mm
Parafilm MAlcan packagingBRNDPM998
TX2 Filter kubusLeica11513851/11513885Filter gebruikt voor Congorood analyse met een band-pass van 560/40.

Referenties

  1. Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
  2. Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
  3. Humphreys, J. M., Chapple, C. Rewriting the lignin roadmap. Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).
  4. Adler, E. Lignin chemistry—past, present and future. Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).
  5. Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
  6. Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
  7. Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
  8. Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
  9. Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
  10. Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
  11. Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
  12. Liljegren, S. Phloroglucinol Stain for Lignin. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  13. Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).
  14. Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
  15. Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
  16. Yeung, E. A beginner's guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
  17. Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
  18. Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
  19. Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
  20. Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
  21. Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
  22. Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Doorsneden van plantenstengelsCongo roodkleuringCalcofluor witkleuringToluidineblauw O kleuringFluorol kleuringMALS kleuringPhloroglucinol kleuring
Histochemische kleuring van
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.