Imaging Ontruimde Intact Biological Systems op cellulair niveau door 3DISCO

Samenvatting

Om beelden met hoge resolutie te verkrijgen van fluorescerend gelabelde cellen binnen grote weefsels, zouden de biologische monsters ideaal geïmagingd moeten worden zonder te snijden. 3DISCO is een eenvoudige weefselklaringsprocedure gebaseerd op sequentiële incubatie met organische oplosmiddelen. Na klaring worden de organen transparant, waardoor een volledige laserscan van het specimen mogelijk is.

Samenvatting

Weefselklaring en daaropvolgende beeldvorming van transparante organen is een krachtige methode om fluorescentiegelabelde cellen en moleculen in 3D, in intacte organen, te analyseren. In tegenstelling tot traditionele histologische methoden, waarbij het weefsel van belang wordt gesneden voor fluorescentiebeeldvorming, staat 3D-beeldvorming van opgehelderd weefsel de onderzoeker toe om gelabelde cellen en moleculen in het hele specimen te onderzoeken. Te dit doel moet optisch ondoorzichtig weefsel transparant gemaakt worden door de brekingsindices door het hele weefsel te matchen. Vervolgens kan het weefsel in één keer beeldvormd worden met behulp van laser-scanningmicroscopen om een compleet hoog-resolutie 3D-beeld van het specimen te verkrijgen. Een groeiende lijst van weefselklaringprotocollen inclusief 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2 en SeeDB biedt nieuwe manieren voor onderzoekers om hun weefsel van belang als geheel te beeldvormen. Onder hen is 3DISCO een zeer reproduceerbare en eenvoudige methode, die verschillende typen weefsels kan klaren en kan gebruikt worden met diverse microscopietechnieken. Dit protocol beschrijft deze eenvoudige procedure en presenteert de verschillende toepassingen ervan. Het bespreekt ook de beperkingen en mogelijke moeilijkheden en hoe deze te overwinnen.

Inleiding

Het histologisch onderzoek van biologisch weefsel is een fundamentele benadering in het begrijpen van de aard van moleculen / cellen in hun natuurlijke context. Idealiter hoge-resolutie beeldvorming van het gehele orgaan het meest informatief en gewenst. Omdat licht heeft een beperkte indringdiepte, door verstrooiing ^1, vaste organen worden doorgesneden om hoge-resolutie microscopische beeldvorming uitvoeren. Vandaar dat de meeste van de histologie studies uitgevoerd op enkele weefselsecties die slechts een klein deel van het orgel. In sommige studies, bijvoorbeeld die welke gericht zijn op te sporen uit neuronale verbindingen in de hersenen of het ruggenmerg, alle coupes van de doelorganen worden verzameld en afgebeeld voor een 3D-reconstructie. Echter, weefsel snijden en de daaropvolgende beeldvorming van individuele secties heeft verschillende beperkingen. Hiertoe behoren tijdrovend en leidt tot een onvolledige 3D reconstructie van het weefsel door mechanische vervormingen en moeilijkeies in de uitlijning van de resulterende beelden.

Onlangs heeft clearing en imaging intacte transparante organen ontwikkeld als een afdoende oplossing voor deze tekortkoming ^2,3. Na clearing, wordt het gehele orgaan verleende transparant waardoor de beeldvorming licht te reizen end-to-end (figuur 1) naar een hoge-resolutie afbeeldingen van de unsectioned orgel te produceren met behulp van een laser scanning microscoop, zoals een multi-foton of licht-sheet microscoop ( Figuur 2). Verschillende onderzoeksgroepen hebben nieuw weefsel clearing protocollen ontwikkeld om te kunnen op de foto om hun weefsel van belang voor verschillende doeleinden. Deze omvatten organisch oplosmiddel ^2-5, water ^6,7 en elektroforese gebaseerde ⁸ clearing protocollen. Onder hen, 3-dimensionale beeldvorming oplosmiddel verwijderd organen of 3DISCO een protocol goed toepasbaar op een verscheidenheid van biologische monsters waaronder centrale zenuwstelsel (CZS) organen, immuunorganen en vaste tumoren. In Addition, kan het worden gecombineerd met verschillende microscopische technieken zoals licht vel fluorescentie microscopie (LSFM), multi foton en confocale laser scanning microscopie. 3DISCO is gebaseerd op het wissen van gemakkelijk beschikbare en goedkope reagentia zoals tetrahydrofuran (THF) en dibenzylether (DBE) ^4. Het gehele protocol kan zo kort 3-4 uur duren. Zo 3DISCO is een robuuste en snelle techniek in vergelijking met traditionele histologische methoden die weken kan duren tot maanden in beslag ^9.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met IACUC (Institutional Animal Care en gebruik Comite) regelgeving op muizen ~ 3-5 maanden oud. De auteur verklaart geen concurrerende financiële belangen.

1. Animal perfusie en het prepareren van weefsels

Timing: 30-60 min per muis + post-fixatie (een paar uur 's nachts).

1. Weeg het dier en verdoven met behulp van ketamine (80-200 mg / kg) en xylazine (7-20 mg / kg) of 2,5% avertin (0,5 ml/25 g lichaamsgewicht IP).
2. Wacht een paar minuten voor anesthesie om volledige kracht.
3. Knijp de neus en de staart van het dier om ervoor te zorgen dat het dier volledig verdoofd.
4. Perfuseren het dier eerst bij kamertemperatuur met 0,1 M fosfaatbuffer (PB) of 0,1 M fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) gedurende 5-10 minuten totdat het bloed volledig verwijderd uit het weefsel.
5. Schakel de perfusie naar fixeeroplossing: 4% PFA in 0,1 M PB (of 0,1 M PBS) en blijven perfusiemet 4% PFA gedurende 30-40 minuten bij een snelheid van 3 ml / min.
6. Ontleden het orgel / s van belang zorgvuldig zonder deze te beschadigen, bijvoorbeeld, te beschadigen en knijpen het weefsel dat wordt ontleed.
7. Verwijder het extra weefsel rondom de organen (bindweefsel, hersenvliezen of dura materie) in een petrischaal gevuld met PBS.
8. Post-fix de organen in 4% PFA voor een paar uur of overnacht bij 4 ° C. Vermijd lange post-fixatie omdat PFA het signaal kan blussen of verhoog de ​​autofluorecense overuren ¹⁰ vooral voor GFP kanaal (dat is een minder probleem in rood en verrood kanalen).
9. Was de organen 2-3x met PBS bij RT net voor aanvang van de clearing procedure.

2. Tissue Clearing

Timing: 2-3 uur voor kleine organen en 1-4 dagen voor de grote organen.

Opmerkingen: De fluorescerende etikettering van de weefsels door transgenexpressie, virale transfectie, kleurstof tracing of antilichaam etikettering moet worden afgerond voor het opruimen. Alle weefsel clearing stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. De clearing oplossingen THF, DBE, BABB (1 deel benzylalcohol en 2 deel benzylbenzoaat) en dichloormethaan zijn giftig en inademing (gedrag experimenten in goed geventileerde zuurkast) en direct contact met de huid moet worden vermeden (gebruik van nitril).

1. Bereid 50% (vol / vol), 70% en 80% THF verdunningen in gedestilleerd water in aparte glazen flessen als volgt: Voor 50% THF, bijvoorbeeld, meng 25 ml THF en 25 ml gedestilleerd water in een glazen fles met een volume van groter dan 50 ml.
2. Meng oplossingen door zachtjes schudden van de fles voor een 1-2 minuten.
3. Label de glazen fles duidelijk.
4. Sluit het flessen en houden de werkende oplossingen in een donkere kast. Voor de beste resultaten, niet dezelfde werkende oplossingen langer dan 1-2 weken te gebruiken. Daarom, om de clearing oplossingen als de kleinste beschikbare volume te kunnen gebruiken verse voorraad reagentia.
5. Vul de glazen flacons (bijv. 2-3 ml) met de eerste clearing oplossing, 50% THF, en de overdracht van de organen van PBS in glazen flesjes aan clearing beginnen.
6. Stevig de glazen flacons sluiten met hun deksels en gebruik een rotator (bijv. een wiel roerder) voor het roeren.
7. Gebruik aluminiumfolie te bedekken en houden de glazen flesjes in het donker. Start de rotator de monsters in glazen flesjes voor de aangegeven tijd (Tabel 1) roeren met constante snelheid (~ 30 rpm).
8. Verwijder de clearing oplossing en voeg de volgende in het protocol als de tijd in tabel 1 wordt voltooid.
9. Verzamel de clearing afval in glas afvalcontainers die worden bewaard in een kap.
   Herhaal de vorige stap voor elk clearing oplossing in het protocol tot het einde. Gebruik een nieuwe pasteur pipet wanneer een nieuwe clearing oplossing toegevoegd (bijvoorbeeld het veranderen van THF tot DBE).
10. Bij de laatste zuivering stap met BABB of DBE, kan de incubatietijd worden verlengd of shortened totdat de monsters worden volledig transparant in zichtbaar licht (of geel / transparant als het een zeer groot weefsel zoals hersenen).
11. Houd de ontruimde organen in de laatste zuivering oplossing te allen tijde onder de beeldvormende stappen.

3. Voorbereiding Ontruimde Organs for Imaging

Timing: 5-15 minuten.

Opmerking: Afbeelding van de ontruimde organen zodra een complete clearing wordt bereikt. Hiertoe volgt u de volgende stappen uit om de monsters voor licht-sheet microscopie (bijv. Ultramicroscopy) of confocale / multi-foton microscopie beeldvorming te bereiden.

Opmerking: Ontruimde organen zullen hun fluorescentie kracht verliezen na verloop van tijd (vooral fluorescerende eiwitten bijvoorbeeld GFP; antilichaamidentificatie beter bestand is tegen en kan zelfs een beter resultaat met een langere incubatie). Voor de beeldvorming, kan verschillende fluorescentie microscopie technieken worden gebruikt zolang correcte afhandeling van de organen in de clearing oplossing wordt bereikt.

1. Voor lichte vel microscopie
   1. Plaats of adequaat te monteren het monster.
   2. Bevestig de ontruimde orgel door het handmatig draaien van de schroef van de monsterhouder ^4.
   3. Dompel het monster in de beeldvorming kamer (bij voorkeur van glas) van thelight vel microscoop die gevuld is met BABB of DBE, welke werd gebruikt bij de laatste zuivering stap.
2. Voor multi foton / confocale microscopie
   1. Monteer het monster op een imaging dia (of een imaging kamer) met de laatste imaging-oplossing te kunnen afbeelding met een multi foton of confocale microscopie, die doorgaans gebruikt olie of water ondergedompeld doelstellingen.
   2. Gebruik tandheelkundige cement om een ​​kader rond het weefsel te maken.
   3. Vul het bad met BABB of DBE net voor tandheelkundig cement wordt volledig stijf.
      Opmerking: De tandheelkundige cement stolt snel; oefenen een paar keer om bekend mee voordat u de werkelijke monsters te krijgen.
   4. Onmiddellijk plaatsende ontruimde monster in het midden van het zwembad en dek deze af met een deksel glas.
   5. Drukt u op de dekking van glas tot deze volledig is afgesloten door tandheelkundige cement en raakt aan het oppervlak van de ontruimde orgel, waardoor het bereiken van de maximale diepte beeldvorming door confocale / multi-foton microscopie.
      Opmerkingen: Dit zorgt ervoor dat er geen clearing oplossing tijdens de beeldvorming wordt gemorst. Vermijd dompelen de beeldvormende lens direct in clearing oplossing, die de lens kan schaden, tenzij het is bestand tegen BABB / DBE of heeft een beschermkap.

4. Imaging Ontruimde Organen

Timing: 15-45 minuten.

1. Verzamel een z-scan die de volledige gewist weefsel (als de gebruikte lens maakt) tegen de beste resolutie die de microscoop kan leveren.
2. Zoom in op de regio van belang zijn voor hogere resolutie beelden te verzamelen.

Onderzoek van de gegevens met de Software Amira 5.

1. Laad de afbeelding series om software Amira met ResolveRT module.
2. Voer de juiste voxel maten in het venster en druk op OK "Afbeelding Read Parameter".
3. Selecteer de "Multi Planer View" sub-applicatie. Maak dan gebruik van de "dikte" schuif om de optimale drempel voor de grijswaarden kiest, het aanpassen van de 2D-en 3D-waarden.
4. Visualiseer het monster door te bladeren door de schijfjes in verschillende 2D oriëntaties en het gebruik van gewas-corner module in 3D-weergave.
   Opmerking: Een gedetailleerde handleiding voor probleemoplossing van het protocol is te vinden in Ertürk et al. ^4.

Resultaten

Neuronen zijn zeer gepolariseerde cellen met extreem lange morfologie. Hun functie is afhankelijk van de verbindingen die zij vormen met elkaar en met andere weefsels. Vandaar, in kaart brengen van de structurele organisatie van de neuronen is uiterst belangrijk om te begrijpen hoe ze functioneren in gezondheid en ziekte. Echter, het traceren van zulke enorme neuronale verbindingen in het hele zenuwstelsel-onlangs uitgeroepen connectomics ¹¹ - nog steeds een van de moeilijkste uitdagingen in de neurowetenschappen. Daartoe hebben beide ^EU-12 en de VS ¹³ grote projecten gestart om de menselijke hersenen in kaart.

Terwijl 3DISCO kan worden toegepast op verschillende organen, is het bijzonder nuttig voor lange neuronale verbindingen in het ruggenmerg en de hersenen traceren. Bijvoorbeeld met behulp Ultramicroscopy scans van grote gewist ruggenmergsegmenten, de axonale verbindingen worden in centimeters bij knaagdieren ruggenmerg (gevolgdFiguur 2). Op soortgelijke wijze kan het gehele gewist hersenen van muizen (Figuur 3a) en de hippocampus (figuur 3b) worden afgebeeld neuronale verbindingen in de hersenen te volgen.

Bij confocale of meer foton microscopie gebruikt op gewist organen, kan de beeldresolutie aanzienlijk worden verbeterd, vooral in z-dimensie. Bijvoorbeeld, multi foton beeldvorming van ontruimd ruggenmerg van GFP-M lijn muizen (figuur 4a) realiseert een naadloze beeld gedurende de gehele diepte (~ 1,5-2 mm) van het ruggenmerg. Confocale microkopie op de geruimde ruggenmerg levert verbeterde resolutie op dezelfde wijze (figuren 4b en c). Multi foton microscopie beeldvorming van ontruimde hersenen levert zeer hoge-resolutie afbeeldingen om fijne details van neuronale structuren waaronder dendritische stekels (figuur 5) te visualiseren. De monsters voor 3DISCO kan op verschillende manieren waaronder transgenexpressie worden geëtiketteerd viral transfectie, kleurstof tracing en antilichaam labeling. Zo is het mogelijk om het gehele vaatstelsel van de hersenen (Figuren 6a en b) en ruggenmerg (figuren 6c en d) middels lectine geconjugeerde fluorescerende tracers ^4, die kan worden gebruikt om de bloed-hersen-barrière te bestuderen (BBB label ) in gezondheid en ziekte.

Zowel microglia en astrocyten zijn zeer betrokken bij de pathologie van neurodegeneratieve aandoeningen, waaronder ziekten van Alzheimer en traumatische verwondingen ^14,15. Met 3DISCO, hun dichtheid en verdeling in het ruggenmerg (Figuur 7) of de hersenen bestudeerd.

Niet-neuronale weefsels kunnen ook worden afgebeeld. Zo kan Clara cellen in de gehele knaagdieren longen worden immunologisch met antilichamen en afgebeeld zonder snijden op een enkele cel (figuur 8). Ook is het mogelijk om te wissen en imago cellen bvalfa-cellen in de pancreas unsectioned weefsel (Figuur 9).

Figuur 1. 3DISCO weefsel clearing maakt unsectioned weefsels transparant voor deep tissue imaging. Uncleared (a) en gewist (b) ruggenmerg weefsels zoals gezien door zichtbaar licht. Na clearing, deep tissue-laser scanning microscopie mogelijk wordt. (C) Uncleared en gewist ruggenmerg weefsels werden afgebeeld door 2-foton microscopie. Schaalbalken a, b = 0,5 mm en met c = 100 urn.

Figuur 2. 3DISCO beeldvorming van het ruggenmerg tot axonale extensies volgen. De ontleed ruggenmerg van Thy-1 GFP transgene muis lijn (GFP-M) is verdeeld in kleinere stukken (~4 mm). Na clearing volgende protocol voor kleine weefsels (Tabel 1) de transparante ruggenmergen werden gevisualiseerd met behulp Ultramicroscopy. 3D-reconstructies van een ~ 4 mm ruggenmerg segment in horizontale (a), coronale (b) en sagittaal beeld (c). (D) Representatieve getraceerd axonen (rood) wordt in grijswaarden transparant aanzicht. (E) Hoge vergroting Gezien het aangegeven gebied in (d). Schaalbalken a, b, c, d = 0,5 mm en e = 20 urn.

Figuur 3. 3DISCO beeldvorming van ontruimd hersenen en hippocampus. Voorbeelden van ontruimd hersenen en hippocampus van GFP-M muizen werden afgebeeld met een ultramicroscope. 3D visualisaties van de gehele hersenen (a) en hippocampus (b) aantonen van de neuronale networks in de afgebeelde transparante weefsels. Schaalbalken a = 2 mm en b = 20 urn.

Figuur 4. Weefsel clearing verbetert de resolutie wordt verkregen door multi-foton confocale microscopie. Transparante ruggenmergsegmenten van GFP-M muizen afgebeeld door meerdere foton (a) of confocale microscopie (b, c). Merk op dat substantieel opruimen verbetering van de resolutie en imaging diepte openbaren van de fijne structuur van axonen en dendrieten. Schaalbalken a = 100 urn en b, c = 20 urn.

Figuur 5. 3DISCO beeldvorming van vertakte stekels. Transparant hersenweefsel van GFP-M muizen afgebeeld door multi-foton. 3D visualisaties van gescande cortex regio gepresenteerd in vertische (a) en horizontale perspectieven (b). (C) ~ 50 micrometer projectie van de niveaus (a, b). (D) Hoge vergroting van het aangegeven gebied in (c) het aantonen van de fijne details van de neuronale structuren waaronder dendritische stekels (pijlpunten). Schaalbalken in = 50 urn, in b, c = 25 urn, bij d = 5 urn.

Figuur 6. 3DISCO van vasculatuur. Om de bloedvaten in het gehele organen label werd lectine-FITC kleurstof tijdens de perfusie (voor het wissen) beschreven ^16. Het is opmerkelijk om te vermelden dat we vonden dat staartader injectie van de tracer geeft beter signaal over cardiale perfusie van de tracer. Na het verzamelen van de vaste hersenen en ruggenmerg, werden ze opgeruimd en imaged door Ultramicroscopy. 3D visualisatie van de hele hersenen van muizen vaatstelsel in heatmap (a) en grijs-schaal (a). (B) 3D-visualisatie van het vaatstelsel van een muis ruggenmerg segment heatmap (c) en grijsschaal (d). De HeatMaps werden gegenereerd gebaseerd op de intensiteit van de lectine kleuring; blauw: lage intensiteit (achtergrond) en rood: hoge intensiteit (vaatstelsel). Schaalbalken a = 2 mm, b = 1 mm, en c, d = 250 urn.

Figuur 7. 3DISCO van gliacellen in ontruimde CZS-weefsel. Het ruggenmerg van transgene muizen die GFP in microglia TGH (CX3CR1-EGFP) of astrocyten TGN (hGFAP-ECFP) werden ontruimd en afgebeeld door multi-foton microscopie. 3D-rendering van microglia wordt getoond als oppervlakte volume visualisatie (a) en transparant ( b). (C) een optisch projectiesysteem (~ 50 urn) wordt aan de details van microglia tonen in het ruggenmerg. 3D-rendering van astrocyten wordt getoond als volume oppervlak visualisatie (a) en transparant (b). (F) een optisch projectiesysteem (~ 50 urn) wordt aan de details van de astrocyten in het ruggenmerg tonen. Schaalbalken a, b, d, e = 100 urn en met c, f = 50 urn.

Figuur 8. 3DISCO van een hele-mount long kwab met antilichaam kleuring van Claracellen. Voor het volledig gemonteerde antilichaam kleuring van longkwabben, 10 weken oude BALB / c vrouwtjesmuizen werden geperfuseerd door het rechter ventrikel met PBS teneinde verwijderen van bloed uit de longen. De longen werden vervolgens gevuld met 4% PFA en vaste O / N bij kamertemperatuur in fixatief ten minste drie keer het volume van ee weefsel. De volgende dag werden de longen kort gespoeld in PBS en rechter kwab werd in 5 ml 1% Triton X-100 in PBS Te permeabilisatie gedurende 48 uur of totdat het weefsel zinken. Alle kleuringen werden uitgevoerd in 0,2% Triton X-100 in PBS met 5% FBS en 2% BSA en spoelingen werden in 0,2% Triton X-100 in PBS. Kleuring met anti-CC10 werd gedurende 72 uur bij 4 ° C gevolgd door uitgebreid wassen gedurende ongeveer 6 uur. Fluorescentielabelling van het primaire antilichaam werd bereikt met anti-geit-Alexa Fluor 594 secundair antilichaam overnacht bij 4 ° C gevolgd door uitgebreid wassen 6 uur overnacht. De volgende dag werden gekleurd lobben geklaard door 50%, 70% en 80% THF gedurende 30 minuten elk, gevolgd door drie wassingen in 30 minuten 100% THF, gevolgd door 20 min in DCM, gevolgd door 30 min in DBE. Schaalbalken a en b = 1 mm en met c = 100 urn.

Figuur 9. 3DISCO van de alvleesklier. Na perfusie van muizen zoals hierboven beschreven in het protocol, de alvleesklier werd ontleed en opgeruimd met de korte protocol. De fluorescentie is afkomstig van ROSA26 LSL tdTomato recombinatie veroorzaakt door tamoxifen behandeling van muizen die een 200 kb BAC transgene verspreid over de endogene muis glucagon locus met CreERT2 ingevoegd in de ATG van glucagon. De pijlpunten markeren enkele fluorescent gelabelde alfa-cellen in de eilandjes. Schaalbalken a, b en c = 1 mm en met d = 500 urn.

Tabel 1. Tissue clearing protocollen voor verschillende weefsels. Voorbeelden van weefsel clearing protocollen voor verschillende weefsels. Merk op dat de clearing tijd voor elke stap kan worden verkort of verlengd als nodig is om de clearing prestaties te verbeteren. Het gewicht van de kleine weefsels benadering is ~ 20-100 mg en de hersenen is ~ 300-500 mg.TTP's :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze tabel bekijken.

Discussie

Tissue wismethodes doel om verstrooiing van imaging licht te verminderen door het afstemmen van de brekingsindex van de verschillende weefsellagen in de ontruimde organen. Hierdoor kan het beeldvormende licht diep in weefsels en het stimuleren van de gemerkte cellen / moleculen. Dit oud concept weefsel clearing ¹⁷ heeft opgedaan toenemende aandacht na de eerste geavanceerde toepassing van de techniek op intacte muishersenen door Dodt en collega ^2. Sindsdien is er een snel groeiende lijst van nieuwe clearing methoden, met inbegrip 3DISCO, SCA / e, ClearT2, helderheid en SeeDB ^3,4,7,18-20. In wezen, zij allen hebben tot doel de organen transparant voor deep tissue imaging maken door het behoud van de fluorescent label. Onder hen, 3DISCO onderscheidt zich als een van de meest eenvoudige en reproduceerbare methoden. Het relatief snel in vergelijking met andere hierboven genoemde wismethodes (1-5 dagen versus 2-3 weken voor volwassen hersenen, respectievelijk) ^21. Het is al succesvolledig toegepast op verschillende organen zoals de hersenen, ruggenmerg, lymfeknopen, milt, longen, solide tumoren, pancreas en borstklieren ^3,4,9. Daarnaast zijn diverse publicaties door onafhankelijke onderzoeksgroepen reeds deze methode gebruikt om het verkrijgen beeldvorming resulteert ^22,23. Toch kan verschillende weefsel clearing procedures voordelig zijn voor verschillende omstandigheden. Bijvoorbeeld, terwijl Sca / e en SeeDB gelden beste embryonale weefsels ^6,7, ze waterbasis wismethodes, die gemakkelijker te hanteren tijdens de beeldvorming zijn. In tegenstelling, DUIDELIJKHEID is een ingewikkelde en kostbare clearing methode. Maar het kan voordelig zijn in de context van antilichaam labeling, vooral in grote weefsels zoals hersenen ^8.

De meest kritische stap om de beste beeldresultaten van 3DISCO verkrijgen is weefsel etikettering, die wordt bereikt voordat het weefsel clearing. Het is essentieel om te beginnen met de sterkste fluorescentiesignaal mogelijk. Dit kan be bereikt op verschillende manieren, waaronder transgene expressie van fluorescerende eiwitten, opsporing door synthetische kleurstoffen, virale transfectie of antilichaam labeling. Het moet in gedachten worden gehouden dat elke clearing procedure het fluorescerende signaal van de weefsels zal verminderen. Dus, als het fluorescerende signaal niet sterk genoeg is in het begin - dat wil zeggen het is niet gemakkelijk opspoorbaar voor de clearing-beeldvorming van de ontruimde weefsels levert slechte resultaten.

Er zijn enkele beperkingen van opruimmethoden die wachten op verbeteringen. Een belangrijke beperking is dat aangezien opruimen reagentia veranderen de structuur van de organen verwijderd, kunnen ze niet worden gebruikt op levend weefsel. Daarom moeten experimenten zoals met fotoactiveerbare mEos2 ²⁴ worden uitgevoerd voordat de vaststelling en clearing. Na clearing, super-resolutie beeldvorming van het fluorescente signaal van lichte en fotostabiel eiwitten mogelijk wordt. Bovendien, omdat de clearing protocol vermindert deintensiteit van de fluorescerende eiwitten, kan het gewiste organen niet worden opgeslagen voor langere perioden. Het is belangrijk op te merken dat sommige organen moeilijker te wissen. Vooral als het ontlede organen behouden grote hoeveelheden bloedcellen (bijvoorbeeld milt, lever), die relatief moeilijk te beeld te wissen en. Het is ook relatief moeilijker om een ​​volledig verdwijnen van grote weefsels, zoals volwassen inproefdierhersenen bereiken. Dergelijke weefsels moet langere incubatietijden, waardoor, anderzijds, verminderen het fluorescentiesignaal. Bovendien ontwikkelen van microscopie methoden die kunnen het grote transparante organen tegelijk ook bij een hoge-resolutie een wacht moeten worden aangepakt. Een andere belangrijke beperking van de techniek weefsel labeling. Terwijl een sterk fluorescerend signaal via genetische of virus expressie is ideaal, kan niet elke cel of molecuul genetisch of viraal worden geëtiketteerd. Anderzijds, antilichaamidentificatie dikke weefsels geen eenvoudige procedure zelfs niet possible meestal. Het kan bijzondere permeabilisatie protocollen en lange incubatietijden nodig (enkele dagen tot enkele weken) ^3. Het is ook belangrijk om in gedachten te houden dat de weefsels krimpen ~ 20% in elke dimensie (gemeten voor ruggenmergweefsel) na het wissen voornamelijk als gevolg van uitdroging en delipidering. Deze krimp optreedt ratiometrically en moeten worden gecorrigeerd in kwantificering stappen. Zoals in de gepresenteerde resultaten, fluorescerend gemerkte structuren intact blijven, hetgeen de vermelding van eiwitintegriteit in de weefsels verwijderd. Door de hydrofobe aard van het uiteindelijke kwam weefsel kan niet verder gekleurd met antilichamen of ingesloten in water bevattende oplossingen bijvoorbeeld Focusclear-die wordt gebruikt ZUIVERHEID of 80% glycerol. Tenslotte is het een uitdaging om overweldigende groottes van beeldgegevens te analyseren. Wanneer bijvoorbeeld een gehele murine brein gescand op cellulair resolutie zou het zeer moeilijk op te sporen en te kwantificeren gewenste Structures (bijv. neuronale of glia netwerken) en vergelijk dan verschillende monsters op een geautomatiseerde manier. Samengevat, terwijl onderzoekers willen te weten komen nieuwe clearing methoden, de verschillende uitdagingen hierboven (moeilijkheid van clearing diverse weefsels, imaging met een hoge resolutie van grotere gebieden, en ingewikkelde data-analyse) moet worden verbeterd in parallel.

Concluderend recent ontwikkelde weefsel clearing technieken waaronder 3DISCO, elegant zien dat hoge-resolutie 3D beeldvorming van organen intact is nu mogelijk. Met behulp van deze werkwijzen kunnen wetenschappers anatomische informatie van cellen en moleculen bekomen in de intacte orgaan. Deze baanbrekende 3D-imaging studies op transparante organen inspireren een groeiend aantal onderzoekers om complexe anatomische en moleculaire organisatie van weefsels / organen in heide en ziekte ontcijferen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Thy-1 GFP (GFP-M) muis			Kan worden verkregen bij Jackson.
CX3CR1 GFP muis			Kan worden verkregen bij Littman lab bij NYU.
TgN(hGFAP-ECFP) muis			Kan worden verkregen bij Jackson.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Na2HPO4	Mallinckrodt	7917-16
NaH2PO4	Mallinckrodt	7892-04
2-2-2 Tribromoethanol	Sigma	T48402
2-Methyl-2-butanol	Sigma	152463	Wordt gebruikt om Avertin-oplossing te bereiden.
Saline	Braun
Tetrahydrofuran	Sigma	186562-12X100ML
Dichloromethaan	Sigma	270997-12X100ML
Dibenzylether	Sigma	Sigma, 108014-1KG
Benzylalcohol	Sigma	305197-100ML
Benzylbenzoaat	Sigma	B6630-250ML
Lectin FITC	Sigma	L0401-1MG
anti-CC10	Santa Cruz	SC-9772	0.388888889
Heparine	APP pharmaceuticals	504001	Wordt gebruikt bij perfusie.
Glazen vials	VWR	548-0554
Pincetten	FST	11251-10
Mini Rotator	VWR	100498-878
Aluminiumfolie	Fisherbrand	01-213-104
100 ml Media Opslagflessen	Kimax Media Flessen	EW-34523-00
Minipuls evolution perfusiepomp met MF4* medium flow pompkop	Gilson, Inc	F110701 en F117606
Microscoopglas	VWR	48311-703
FastWell	Grace Bio-Labs	FW20
Dekglas	Corning	2940-245
Glazen petrischaal	Corning Pyrex	3160-101
Tandcement	Lang Dental	1223PNK
Quantofix Peroxide Test Strips	Sigma	37206
Amira met RT resolve microscopiemodule	Visage Imaging	beeldanalysesoftware
Imaris	Bitplane imaging	beeldanalysesoftware
ImageJ	NIH	gratis software