Bio-layer interferometrie voor het meten van kinetiek van eiwit-eiwit interacties en Allosteric Ligand Effects

Samenvatting

De protocollen beschrijven hier kinetische analyses van eiwit-eiwit interacties met Bio-layer interferometrie. F type ATP synthase, dat betrokken is bij de cellulaire energiemetabolisme, kan worden geremd door de ε subeenheid in bacteriën. We hebben Bio-layer interferometrie aangepast aan interacties van de katalytische complex studeren met remmende C-terminale domein ε's.

Samenvatting

We beschrijven het gebruik van Bio-layer Interferometrie remmende subeenheid interacties van ε studie met het katalytische complex van Escherichia coli ATP synthase. Bacteriële type F ATP synthase is het doelwit van een nieuwe, door de FDA goedgekeurde antibioticum-resistente tuberculose te bestrijden. Inzicht bacterie-specifieke auto-remming van ATP synthase door het C-terminale domein van subeenheid ε kan een nieuw middel om het enzym ontdekking van antibacteriële geneesmiddelen doelwit. De C-terminale domein van ε ondergaat een dramatische conformatieverandering wanneer het enzym overgangen tussen de actieve en inactieve toestanden en katalytische plaatse liganden beïnvloeden welke conformaties ε is overheersend. De test meet kinetiek van de binding ε / dissociatie met de katalytische complex en indirect mealen de verschuiving van enzym gebonden ε en naar de schijnbaar nondissociable remmende conformatie. De Bio-laag Interferometrie signaal niet overgevoelig voor oplossing samenstelling, dus het kan ook gebruikt worden om allosterische effecten van katalytische-ter liganden op ε de conformatieveranderingen volgen.

Inleiding

Eiwit-eiwit interacties zijn belangrijk voor vele biologische processen en labelvrije optische methoden zoals Surface Plasmon Resonance (SPR) gebruikt in vitro kinetiek van binding en dissociatie ¹ bestuderen. De meeste labelvrije methoden immobiliseren een biomolecuul op een sensor oppervlak en gebruiken een optisch signaal om een bindende partner te detecteren uit de oplossing als het associeert met de geïmmobiliseerde biomolecuul ^1. Terwijl SPR is een zeer gevoelige methode is gevoelig voor storingen als gevolg van veranderingen in de brekingsindex van de oplossing stroomt via sensor ^2. Hoewel niet zo gevoelig als SPR, Bio-layer interferometrie (BLI) wordt minder beïnvloed door veranderingen in de samenstelling van de steekproef ^1,3. BLI gebruikt glasvezel biosensoren dat een merkgebonden biocompatibele coating aan het uiteinde hebben. Het systeem hier gebruikte (Octet-RED96) bevat acht spectrofotometers. Wit licht wordt doorgesluisd naar een rij van sondes die bewegen op een robotarm. Lichtdetectors are opgepikt door de sondes en verplaatst naar een 96-wells plaat met monsters. Een van de doelmoleculen is geïmmobiliseerd op het oppervlak biosensor. Vervolgens sensoren worden verplaatst naar putjes die de bindingspartner in oplossing. BLI bewaakt associatie van de bindende partner met het geïmmobiliseerde molecuul, en vervolgens controleert dissociatie na het verplaatsen van de sensoren om oplossing zonder de bindende partner. Binding van moleculen aan de biosensor oppervlak leidt tot veranderingen in optische interferentie tussen lichtgolven die naar de spectrofotometers reflecteren vanuit een binnenoppervlak en de externe interface tussen sensor en oplossing. Deze veranderingen in storing kan worden gekwantificeerd en gebruikt om kinetische tarieven van de binding en dissociatie, zoals samengevat in de animatie van figuur 1 te bepalen.

We hebben BLI toegepast interacties tussen de katalytische complex van bacterieel ATP synthase en de ε subeenheid, die automatisch remmen het enzym te meten. ATP synthase is een membraan ingebedde roterende nanomotor die synthese en hydrolyse van ATP ⁴ katalyseert. De katalytische complex (F ₁₎ kunnen worden geïsoleerd in een oplosbare vorm die werkt als een ATPase. Subeenheid ε twee domeinen: het N-terminale domein (NBD) is noodzakelijk voor een goede montage en functionele koppeling van het enzym, maar niet direct met de katalytische subeenheden, het C-eindstandige domein (CTD) kan het enzym remmen door interactie met meerdere katalytische subeenheden ^5,6. Deze ε regulatie is specifiek voor bacteriële ATP synthases en wordt niet waargenomen in de mitochondriale homoloog. ATP synthase heeft zich ontpopt als een doelwit voor antibacteriële geneesmiddelen, zoals blijkt uit de recente goedkeuring van de FDA bedaquiline om resistente tuberculose ⁷ behandelen. Zo richten ε's remmende rol voor drug discovery kon antibiotica die niet de mitochondriale ATP synthase hoeft te remmen opleveren. Met de geïsoleerde katalytische complex _(F1), εwordt een scheidbaar subeenheid. Echter, met ε gebonden aan V _1, de εCTD kan een dramatisch conformatieverandering ondergaan, gedeeltelijk ingevoegd in de centrale holte van het enzym en die een remmende toestand die waarschijnlijk direct ^6,8 dissociëren. We maken gebruik van BLI om kinetiek van F ₁ / ε binding en dissociatie te meten, en indirect, allosteric effecten van katalytische-ter-liganden op conformatie ε te onderzoeken.

In ons systeem, ε gekozen voor immobilisatie op het sensoroppervlak aangezien BLI-signaal (zoals SPR) gevoelig is voor de massa van de moleculen binden aan het oppervlak. De ε subeenheid kleine (~ 15 kDa) ten opzichte van de belangrijkste _F1 complex (~ 347 kDa). Zo zal een grotere BLI signaal het gevolg zijn van binding van F ₁ aan geïmmobiliseerd ε. Om toezicht te houden F ₁ dissociatie, die kan erg traag, moet ε sterk worden geïmmobiliseerd. Dus kozen we biotinyleren, En immobiliseren van met streptavidine beklede biosensoren. Eiwitten kunnen worden gebiotinyleerd door (i) willekeurige modificatie van oppervlakte lysines ^9, (ii) reactie van een unieke natieve of gemodificeerde cysteine ​​met een biotine-maleïmide reagens ¹⁰ of (iii) toevoeging van een genetisch bepaalde biotine-acceptor peptide dat enzymatisch gebiotinyleerd tijdens in vivo expressie van het gelabeld eiwit ^11. In ons systeem wordt ε gebiotinyleerd met de methode (iii) ^8. Zodra-biotine gelabeld ε wordt geïmmobiliseerd op streptavidine sensoren, kan BLI meten van de binding en dissociatie van F ₁ die is uitgeput van de subunit ε (F ₁ (-ε)). Voor de hier beschreven experimenten, waren voorafgaande testen gedaan om redelijke hoeveelheden van het gebiotinyleerde eiwit vast te immobiliseren op de sensoren. Dit kan variëren, afhankelijk van het molecuulgewicht van het eiwit en zijn bindingspartner, maar het doel is om een ​​minimale hoeveelheid geïmmobiliseerd proteïne t bepalenpet verschaft (i) voldoende signaal-ruis voor binding kinetiek met een lage concentratie van de bindingspartner (hierna K _D) en (ii) een minimale verstoring van bindingskinetiek met bijna verzadigende concentratie van de bindingspartner. Ook kan stoichiometrie van biotinylering variëren (maar vermijd> 1 mol biotine / mol eiwit), zodat aanvankelijke test kan nodig zijn voor elke nieuwe partij gebiotinyleerd proteïne te bevestigen dat een consistente BLI verkregen kan worden bij immobilisatie op streptavidine-beklede sensoren.

Protocol

1. Programmering van het instrument voor BLI Assay

Zet het instrument tenminste een uur gepresenteerd om de lamp is opgewarmd, dat noodzakelijk is om ruis te minimaliseren en drift optische signaal gedurende het experiment. Stel de gewenste temperatuur via het tabblad instrument om het monster plaat voorverwarmen door de houder. Stel vervolgens de experimentele benadering in de Data Acquisition software. Selecteer "Nieuwe Kinetics Experiment" in het tabblad Experiment Wizard. Dit biedt een menu met tabbladen met alle stappen die moeten worden gedefinieerd.

1.1. Plaat Definitie

Definieer de kolommen worden gebruikt op de 96-well plaat sample. Kolommen toewijzen aan buffer, geïmmobiliseerd eiwit of bindende partner bevatten. Voor elke vereniging goed, voer de concentratie van binding partner te gebruiken. Opmerking: de plaat definitie figuur 2 heeft opties voor verschillende assays.

1.2. Assay Definitie

NHOUD "> begrenzen alle stappen die nodig zijn voor de test. namelijk (i) Baseline (diverse), (ii) laden, (iii) Associatie en (iv) Dissociatie van bindingspartner. Dan, zoals hieronder beschreven, te verbinden individuele assay stappen kolommen van putten op het monster plaat door het selecteren van de test stap en vervolgens dubbelklikken op de betreffende kolom. Dit programma de sensoren worden verplaatst van de ene kolom van putten naar de volgende tijdens de test.

1. Baseline
   Begin met een korte basislijn stap (≥ 60 sec), met sensoren in assaybuffer (figuur 2, kolom 1), initiële BLI signalen vast in de 96-well plaat.
2. Loading (immobiliseren van het gebiotinyleerde eiwit op de sensoren)
   Sensoren toewijzen aan putjes die het gebiotinyleerde eiwit (Figuur 2, kolom 2) bevat. Gebruik de drempel functie om een ​​vooraf bepaald niveau van binding (zie Inleiding) te bereiken. Stel de optie drempel zodat alle sensoren beweging zal zijnd naar de volgende kolom van putten wanneer een van de sensoren de drempel bereikt.
3. Baseline
   Inclusief een basislijn stap in buffer (fig. 2, kolom 3, meestal> 5 min) om geïmmobiliseerde gebiotinyleerde eiwitten weg te wassen van de sensoren en nieuwe, stabiele basislijn signalen vast. Voor basis binding / dissociatie bepalingen (zoals in figuur 3), omvat een extra stap basislijn (60 sec) met sensoren Arai buffer (figuur 2, kolom 4) vóór stap Association.
4. Association (de bindingspartner aan het geïmmobiliseerde eiwit)
   Voor een eenvoudige binding / dissociatie assay (zoals in figuur 3), selecteert een reeks concentraties van bindingspartner worden gebruikt voor verschillende sensoren / putjes (Figuur 2, kolom 5). Stel de staptijd zodat ten minste een verzadigende concentratie van de bindingspartner evenwicht moeten benaderen bindingssignaal. Voor eenassay allosterische effecten van kleine liganden op dissociatie van het eiwit-eiwit complex (zoals in figuur 5) te testen, selecteert een hoge concentratie bindingspartner (~ 10-voudig boven het geschatte _Kd) voor gebruik in alle associatie putjes.
5. Dissociatie (van de bindende partner)
   Voor een eenvoudige binding / dissociatie assay alleen (zoals in figuur 3), wijzen de sensoren terug naar kolom 4 (figuur 2), dezelfde buffer putjes als voor de extra basislijn vóór Association. Voor een test om allosterische effecten van kleine liganden testen, maar wijzen sensoren om naar kolom 6 (figuur 2), waarbij elk putje kan buffer plus verschillende allosterische liganden bevatten.

1.3. Sensor Assignment

Schrijf de plaats in de sensor lade die voorbevochtigd sensoren bevatten voor de test. Identificeer alle lege posities aangezien dit experiment zal fail als er geen sensoren opgepikt.

1.4. Beoordeling Experiment

Visualiseer alle geplande stappen om te controleren op fouten en ga terug om ze te corrigeren.

1.5. Run Experiment

Voer benodigde gegevens, inclusief locatie van gegevensbestanden. Voer de gewenste temperatuur voor het experiment. Als de sensors nog prewetting vereist, schakelt u de optie uit te stellen begint het experiment. Tot slot, zodra alle monstervoorbereiding is voltooid (stap 2) en zowel het monster plaat en de sensor lade zijn in het instrument geladen, klikt u op de toets Go om de test uit te voeren.

2. Monstervoorbereiding

1. Bereid een geschikte testbuffer. Buffer gebruikt voor experimenten getoond in figuren 3 en 5: 20 mM MOPS (3 - (N-morfolino) propaansulfonzuur), Tris (Tris (hydroxymethyl) amino-methaan) (toegevoegd om de pH op 8,0), 50 mM KCl. Inclusief BSA (runderserumalbumine, vetzuurvrij, 0,5mg / ml eind) in de buffer voor alle assaystappen en verdunningen van het gebiotinyleerde eiwit of bindingspartner niet-specifieke binding van eiwitten aan de sensoren minimaliseren.
2. Verdun het gebiotinyleerde eiwit (ε) in assaybuffer tot een geschikte concentratie (zie inleiding).
3. Bereid verdunningen van de bindende partner (F ₁ (-ε)) in assaybuffer (zie bespreking voor reeks concentraties te gebruiken).
4. Voorbevochtigd de met streptavidine beklede sensors minstens 10 minuten om hun beschermende sucrose coating verwijderen. Verwijder het rek-sensor bevattende de lade sensor en plaats een 96-wells plaat in de bodem van de lade schuiven een hoek van de plaat in het oriëntatie inkeping op de lade. Voor de kolom sensoren te gebruiken, voeg 200 pl testbuffer per well in die kolom van de 96-well plaat. Zet de rek van sensoren om de bak in de juiste oriëntatie (met tabs slots).
5. Zoals toegekend tijdens de programmering in stap 1, vul putten of de monsterplaat met testbuffer of geschikte eiwit verdunningen, zoals in figuur 2. Voorkomen dat er luchtbellen, ze ruis in het optische signaal kan veroorzaken. Een of meer referentie putten die (i) gebiotinyleerd eiwit of (ii) bindingspartner weglaten.
6. Open de deur van het apparaat en plaats de lade sensor op het podium (links), met lipjes van de lade geplaatst in de sleuven van het podium. Plaats het monster plaat in de plaathouder (rechts), zorg ervoor dat de plaat zit vlak en in de juiste richting, zoals aangegeven op de plaat houder. Sluit de deur en start de test van de data-acquisitie programma (stap 1.5).

3. Data Processing

1. Nadat de test is uitgevoerd, opent u de data-analyse software en laad de map met de gegevens. Klik op het tabblad "Processing" naar een stapsgewijze Processing menu (links) en de ruwe kinetische gegevens te zien, met elke sensor (AH) toegewezen aan een andere kleur (zieFiguur 3).
2. Onder "Data Selection", klik op de "Sensor Selectie" knop. Op de "monsterplaat Map", wijst de putjes 1 of 2-sensoren (G, H in bepalingsbuffer van figuur 3) als referentie putjes. Op de verwerking menu, vink het vakje "aftrekken" en selecteer "Reference Wells" naar referentie-signaal (enkel of gemiddeld) af te trekken van het signaal om de andere sensor.
3. Lijn alle sporen naar Y = 0 met behulp van de "Align Y-as" stap. Selecteer "Baseline" als de uitlijning stap (dit is de laatste basislijn vóór de Vereniging stap). Voor "Time Range", voer de laatste 10 seconden van dat uitgangswaarde (dwz 50-60 seconden voor een 60-sec basislijn, zoals in figuur 3).
4. Vink het vakje "Inter-stap Correction" om het signaal van verschuivingen tussen de vereniging en dissociatie stappen te minimaliseren. Selecteer af te stemmen op Baseline of dissociatie.
5. Selecteer Savitzky-Golay filtreren functie in de meeste gevallen en klik op "Process Data!" doorgaan. Visueel te inspecterende laatste verwerkte gegevens (onderste rechter paneel). Met assays bedoeld voor wereldwijde data-analyse (zoals in figuur 4), indien signaal sporen tonen een significante verschuiving tussen Vereniging en dissociatie stappen, veranderen de selectie van dissociatie of Baseline voor de "Inter-stap Correction" en opnieuw verwerken van de gegevens voordat u verder gaat met gegevens analyse.

4. Data Analysis

Klik op het tabblad "Analyse" in Data-analyse te beginnen. Opmerking: het voorbeeld onderstaande stappen voor globale analyse van veelvoudige binding / dissociatie curves (zoals in figuur 3).

1. Voor "Step te analyseren", kies Association en dissociatie. Voor "model", selecteert 01:01. Opmerking: andere beperkte opties zijn beschikbaar.
2. Voor "Montage", kies Global (Full). Voor "Group By" te selecteren kleur (zoals op de grafiek). Selecteer "R _max ontkoppeld Door Sensor" onafhankelijke montage van R _max staan ​​(maximale signaal respons op het verzadigen binding van de partner het geïmmobiliseerde eiwit). Let op: we doen dit voor de meeste assays, zoals sensoren enigszins variëren in de hoeveelheid eiwit geïmmobiliseerd (zie figuur 3, laden).
3. Op de getoonde tafel, zorg ervoor dat alle sensor sporen te analyseren hebben dezelfde kleur, dus ze zullen worden geanalyseerd als een wereldwijde set. Indien nodig, selecteert u een of meer sensoren sporen weg te laten uit de wereldwijde montage: onder de kolom "Inclusief", klik met de rechtermuisknop op de gewenste sensor positie en selecteer "Uitsluiten Wells".
4. Klik op "Fit Curves!" de lineaire regressieanalyse starten. Onderzoek de fitting resultaten, die (i) overlay van regressiecurves met sensorgegevens sporen (zoals in figuur 4), (ii) percelen fitting residuen en (iii) een tabel met bepaalde parameterwaarden (snelheidsconstanten _Rmax bevatten K _D) en statistieken (standaardfouten voor parameters, Chi-kwadraat, ^R2).
5. Onder "Data Export", sparen fitting resultaten door te klikken op "Table Exporteren naar. Csv bestand". Voor graphing of verdere analyse van de gegevens / uitgerust bochten met andere software, klikt u op "Exporteren Fitting Results" om de gegevens van elke sensor en voorzien curve in een tekstbestand opslaan.

Resultaten

Real time binding en dissociatie BLI kinetiek in figuur 3. Dit experiment werd uitgevoerd met testbuffer tezamen en dissociatie. Dit experiment werd gestart met een 10 minuten basislijn stap omdat de sensoren was voorbevochtigd slechts kort. Vervolgens werd gebiotinyleerd ε geladen op de sensoren. Geen detecteerbare dissociatie van ε trad in alle overige stappen gezien vanaf de referentiecurve (G) die geen bindende partner toegevoegd. Een tweede referentie sensor (H) miste geïmmobiliseerd eiwit en toond...

Discussie

Thans beschikbare instrumenten voor BLI toelaten belangrijke doorvoer en flexibiliteit in assays voor biomoleculaire interacties. Verschillende monsters oplossing wordt overgebracht in putjes van een zwarte microtiterplaat en een stel evenwijdige BLI sensoren geprogrammeerd heen en weer schakelen tussen kolommen van putten op de plaat. De monsters worden geroerd door orbitaal schudden gedurende de test. Het systeem hier gebruikt heeft 8 sensoren en gebruikt een 96-well plaat monster, maar een ander systeem gebruikt 16 s...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Octet-RED96	Pall/FortéBio	30-5048
Bovine Serum Albumin	Sigma	A6003-10G	Vrij van vetzuren
Biosensor/Streptavidin	Pall/FortéBio	18-5019	Schaal van 96 sensoren
Microtiterplaat	Greiner Bio-one	655209	Zwart, Polypropyleen
Data Acquisitie software	Pall/FortéBio	Versie 6.4	Nieuwere versies beschikbaar
Data Analyse software	Pall/FortéBio	Versie 6.4	Nieuwere versies beschikbaar