Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Capture Compound Massaspectrometrie - een krachtig hulpmiddel om het identificeren van nieuwe c-di-GMP effectoreiwitten

11.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51404

⸱

29 maart 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum of the University of Basel, 2Proteomics Core Facility, Biozentrum of the University of Basel

In dit artikel

Samenvatting

De alomtegenwoordige tweede boodschapper c-di-GMP controleert de groei en het gedrag van veel bacteriën. We hebben een nieuwe Capture Compound Mass Spectrometry-gebaseerde technologie ontwikkeld om c-di-GMP-bindende eiwitten biochemisch te identificeren en te karakteriseren in vrijwel elke bacteriesoort.

Samenvatting

Aanzienlijke vooruitgang is geboekt in het afgelopen decennium in de richting van de identificatie en karakterisering van enzymen die betrokken zijn bij de synthese (diguanylate cyclases) en afbraak (fosfodiesterasen) van de tweede boodschapper c-di-GMP. Daarentegen weinig informatie beschikbaar is over de moleculaire mechanismen en cellulaire componenten waardoor deze signalering molecuul regelt een breed scala van cellulaire processen. De meeste van de bekende effector-eiwitten behoren tot de familie Pilz of zijn gedegenereerd diguanylate cyclases of fosfodiesterases die op katalyse hebben gegeven en effector functie hebben aangenomen. Dus, om beter de cellulaire c-di-GMP netwerk definiëren diverse bacteriën experimentele vereist om nieuwe effectoren die betrouwbaar silico voorspellingen niet identificeren en te valideren.

We hebben onlangs een nieuwe Capture Compound massaspectrometrie (CCMS) gebaseerde technologie als een krachtig instrument om ontwikkeldbiochemisch identificeren en karakteriseren van c-di-GMP-bindende eiwitten. Deze techniek is eerder gerapporteerd voor diverse organismen 1 is. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van het protocol dat we gebruiken om dergelijke signaleringscomponenten sonde. Als voorbeeld, gebruiken we Pseudomonas aeruginosa, een opportunistisch pathogeen, waarbij c-di-GMP speelt een cruciale rol in virulentie en biofilm controle. CCMS geïdentificeerd 74% (38/51) van de bekende of voorspelde elementen van de C-di-GMP netwerk. Deze studie legt de CCMS procedure in detail, en stelt het als een krachtige en veelzijdige tool om nieuwe componenten betrokken bij kleine molecule signalering te identificeren.

Inleiding

c-di-GMP is een belangrijke tweede messenger gebruikt door de meeste bacteriën diverse aspecten van hun groei en gedrag beheersen. Bijvoorbeeld, c-di-GMP reguleert celcyclus, motiliteit en de expressie van exopolysacchariden en oppervlak adhesinen 2-4. Door de coördinatie van dergelijke werkwijzen c-di-GMP bevordert biofilmvorming, een proces dat is geassocieerd met chronische infecties van verschillende pathogene bacteriën 5. c-di-GMP wordt gesynthetiseerd door enzymen genaamd diguanylate cyclases (DGCs) dat een katalytische GGDEF domein 4 haven. Sommige DGCs bezitten een remmende site die naar beneden regelt de cyclase activiteit op c-di-GMP bindend. De afbraak van c-di-GMP wordt gekatalyseerd door twee verschillende klassen van fosfodiësterases (PDE) herbergen ofwel een katalytische EAL of HD-GYP domein 6,7.

De meeste bekende effector eiwitten die direct binden c-di-GMP behoren tot één van drie klassen van eiwitten: katalytischebondgenoot inactief GGDEF of EAL domeinen en Pilz domeinen, kleine moleculaire schakelaars die vormveranderingen op c-di-GMP bindend 8 ondergaan. DGCs, PDE's en Pilz eiwitten zijn goed gekarakteriseerd en hun domeinen kunnen worden voorspeld in silico relatief veilig. Een bijzonder belang is nu gericht op de identificatie van nieuwe klassen van c-di-GMP effectoren. Sommige c-di-GMP effectoren met verschillende bindingsmotieven werden onlangs zoals beschreven als de CRP / Achterwaarts- eiwit familie Bcam1349 in Burkholderia cenocepacia of de transcriptionele regulator FleQ in P. aeruginosa 9,10. Bovendien werden c-di-GMP-specifieke riboswitches recent geïdentificeerd en naar genexpressie in een C-di-GMP-afhankelijke wijze 11. De c-di-GMP binding motieven van verschillende effectoren worden alleen slecht geconserveerd maken bioinformatic voorspellingen van dergelijke eiwitten moeilijk. Om dit probleem, een biochemische werkwijze, die is gebaseerd op het gebruik van een c-di-GMP spe ontwikkelden wefieke Capture Compound in combinatie met massaspectrometrie 1,12,13.

We hebben onlangs een nieuw ontworpen driewaardig c-di-GMP invangverbinding (CDG-CC figuur 1) 1. Deze chemische steiger bestaat uit: 1) een C-di-GMP eenheid gebruikt als aas voor c-di-GMP vangen bindende eiwitten, 2) een UV-licht activeerbare reactieve groep gebruikt verknopen de CDG-CC de gebonden eiwitten en 3) een biotine aan de gevangen eiwitten met streptavidine beklede magnetische korrels isoleren. De CDG-CC kan worden gebruikt om direct en specifiek vangen c-di-GMP effectoren van complex mengsel van macromoleculen zoals cellysaten. Invangverbinding gebaseerde chemische proteomics benaderingen zijn eerder gerapporteerd toepasbaar is op een groot aantal organismen, bijvoorbeeld Caulobacter crescentus, Salmonella enterica serovar typhimurium en P. aeruginosa 1,14.

In deze methodologische paper,Wij bieden een diepgaande beschrijving van het CCMS procedure met behulp van extracten van P. aeruginosa als voorbeeld. Deze studie stelt CCMS als een krachtige en veelzijdige tool om biochemisch nieuwe componenten betrokken bij kleine molecule signalering te identificeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Lysate Voorbereiding

  1. Groeien P. aeruginosa cellen in LB aan de gewenste OD.
    LET OP: Voor de begeleiding: gebruik ≈ 100 ml cultuur / monster voor stationaire fase culturen en ≈ 500 ml cultur / monster voor logfase culturen (OD 600 nm = 0,5).
  2. Pellet door centrifugatie gedurende 20 min bij 5000 x g.
  3. Hersuspendeer 0,5-1 g pellet in 1 ml lysis buffer (6,7 mM MES, 6,7 mM HEPES, 200 mM NaCl, 6,7 mM KAc, DDT 1 mM, pH 7,5) en voeg proteaseremmer (compleet mini, EDTA-vrij) alsook als DNasel.
  4. Lyse de cellen door 3 passages door een Franse druk cel, 20.000 psi (zie Materials List).
  5. Ultra-centrifuge het cellysaat bij 100.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C.
  6. Sla het supernatant (ga naar stap 2).
  7. Was de pellet met 1x lysis buffer 1 ml op en neer te pipetteren.
  8. Ultracentrifuge bij 100.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C.
  9. Flash-bevriezen de pellet invloeibare stikstof en bewaar bij -20 ° C tot gebruik voor de vangst van membraaneiwitten (zie stap 3).

2. verwijdering van vrije c-di-GMP en andere nucleotiden (oplosbare fractie Only)

  1. Was een PD10 ontzoutingskolom (zie Materials List) met 10 ml koude lysisbuffer.
  2. Giet het supernatans (≈ 1 ml) op de PD10 om nucleotiden te verwijderen.
  3. Elueer met 4 ml koude lysisbuffer (500 ui treden).
  4. Selecteer de meest geconcentreerde fracties zoals bepaald door Bradford assay, en bundelen ze.

3. Pellet Resuspensie en Oplossen (membraanfractie Only)

  1. Resuspendeer de pellet in 500 tot 1000 pl 1x capture buffer (zonder detergens) (zie tabel 1).
    OPMERKING: De pellet is moeilijk te mengen. Het is aangeraden om eerst pipet op en neer met een pipet om ruwweg resuspendeer de pellet, dan naar een spuit 27 G gebruiken om goed te homogeniseren van de oplossing.
  2. Voeg 1% (w / v) n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM).
  3. Incubeer bij 4 ° C gedurende ten minste 2 uur (of O / N) op een roterend wiel.
  4. Ultracentrifuge bij 100.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C.
  5. Oogst van het bovenstaande.

4. Eiwit meting van de concentratie

  1. Meet de eiwitconcentratie van Bradford assay (door BCA assay voor de membraanfractie).
  2. Stel het totale eiwitconcentratie 10 mg / ml.

5. Capture

  1. Meng 300 ug eiwit met 1 mM BBP, GTP, ATP, CTP, en 20 gl 5x capture buffer (100 mM HEPES, 250 mM KAc, 50 mM MgAc, 5% glycerol, pH 7,5) (Tabel 1). Stel het reactievolume van 100 ul met H2O
    Opmerking: het totale volume omvat het volume van de CDG-CC en C-di-GMP bij de controle concurrentie (zie stap 5.3 en Tabel 2).
    Opmerking: Alle experimenten werden uitgevoerd in 200 &# 181; l 12-tube PCR-strips (Thermo Scientific).
    LET OP: voor het membraan fractie, zorg ervoor om altijd de DDM concentratie boven de kritische micel concentratie (0,01% w / v) totdat het eiwit solubilisatiestap in 8 M ureum (Stap 7.1).
  2. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 min op een roterend wiel.
  3. Voeg 10 uM CDG-CC (eindconcentratie).
    OPMERKING: onder controle zonder CDG-CC (aangeduid als "bead control"), en een controle aangevuld met 1 mM c-di-GMP ("competitie control") (zie tabel 2).
    OPMERKING: de CDG-CC concentratie kan worden ingesteld van 1 tot 10 uM.
  4. Incubeer bij 4 ° C gedurende ten minste 2 uur (O / N voor de membraanfractie) op een roterend wiel in het donker.
  5. Na een korte centrifuge, verknopen door activering van de reactieve eenheid van de CDG-CC met UV-licht gedurende 4 minuten, met behulp van een CaproBox (zie Materials List, λ = 310 nm, Bestralingssterkte ≥10 mW / cm², afstand van de bron = 2 cm). OPMERKING: verwijder het deksel van de stroken voorafgaande verknoping.
  6. Voeg 25 ul 5x wasbuffer (5 M NaCl, 250 mM Tris, pH 7,5) en 50 pi goed geresuspendeerde streptavidine magnetische korrels, zacht homogeniseren.
  7. Incubeer bij 4 ° C gedurende 1 uur op een roterend wiel.

6. Wassen Stappen

LET OP: (Magnet: zie Materials List). Begin met een capture van de magnetische korrels in de PCR strip deksel, met de magneet. Vervang dan de PCR-strip door een nieuwe met daarin de volgende wasbeurt oplossing. Verwijder de magneet en resuspendeer de kralen en incubeer 2 minuten. Spin down en plaats het deksel door een frisse deksel.

  1. Wassen stappen (oplosbare fractie alleen)
    1. Spoel 6 keer in 200 gl 1 x wasbuffer.
    2. Was eenmaal met 200 ui HPLC kwaliteit H2O
    3. Spoel 6 keer in 200 pl 80% acetonitril.
    4. Was 2 keer in 200 pl HPLC kwaliteit H2O
  2. Wassen stappen (membrane fractie alleen)
    1. Was 5 keer in 200 gl 1 x wasbuffer + 0,1% DDM.
    2. Was 2 keer in 200 gl 1 x wasbuffer + 0,05% DDM.
    3. Was eenmaal met 200 ui 1 x wasbuffer + 0,025% DDM.
    4. Was eenmaal in 200 ul 1x wassen buffer + 0,0125% DDM.
    5. Was 3 maal in 200 ul 100 mM ABC (ammoniumbicarbonaat, NH4 CO 3) + 2 M ureum.

7. MS Monstervoorbereiding

  1. Resuspendeer de kralen (direct in het deksel) in 20 pi 100 mM ABC (100 mM ABC + 8 M ureum voor de membraanfractie) en zetten in 1,5 ml buizen.
  2. Alleen membraanfractie: incuberen bij 60 ° C gedurende 5 minuten schudden bij 500 rpm.
  3. Voeg 0,5 gl 200 mM TCEP (tris (2-carboxyethyl) fosfine) en incubeer bij 60 ° C gedurende 1 uur schudden bij 500 rpm. Afkoelen tot 25 ° C.
  4. Voeg 0,5 ul van vers bereide 400 mM joodacetamide en incubeer bij 25 ° C gedurende 30 min schudden van eenT 500 rpm en in het donker.
  5. Voeg 0,5 gl 0,5 M N-acetyl-cysteïne en incubeer bij 25 ° C gedurende 10 minuten schudden bij 500 rpm.
  6. Membraanfractie slechts: voeg 1 pl Lys-C en incubeer bij 37 ° C, O / N.
  7. Voeg 2 ug trypsine en incubeer O / N bij 37 ° C, onder schudden bij 500 rpm (wrap in Parafilm om uitdroging te voorkomen).
    OPMERKING: de monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C in dit stadium.
    OPMERKING: membraanfractie alleen: voeg 100 mM ABC aan de ureumconcentratie op <2 M te passen voor toevoeging van trypsine.
  8. Kort spin down de buizen en het verzamelen van kralen met de magneet.
  9. Breng de bovenstaande in een nieuwe 1,5 ml buis (herhaal deze stap over als kralen worden gelaten).
  10. Voeg 5 ul 5% TFA (trifluorazijnzuur) + 1 gl 2 M HCl (15 pl 5% TFA + 5 gl 2 M HCl gedurende de membraanfractie).
  11. Voorwaarde C18 MicroSpin kolommen (The Nest Group, MA, USA) met 150 ul acetonitril (spin 20 sec bij 2.400 tpm).
  12. Equitrillen de C18 kolommen 2 maal met 150 ui 0,1% TFA (spin 20 sec, 2400 rpm).
  13. Laad het monster en spin 2 min, 2000 rpm.
  14. Laad de doorstroming op de kolom en herhaal de draaiende stap (2 min, 2000 rpm).
  15. Was 3 maal met 150 ui 0,1% TFA, 5% azijnzuurnitril (20 sec, 2400 rpm).
  16. Neem een ​​nieuwe buis en elueer tweemaal met 150 pl 0,1% TFA, 50% acetonitril (2 min, 2000 rpm).
  17. Droog de peptiden in een speed-vac.
  18. Resuspendeer in 40 ui 98% H2O, 2% acetonitril, 0,15% mierenzuur.
  19. Sonicaat 20 sec (pulscyclus 0.5, amplitude 100%; zie Materials List) en spin down 5 sec, 12.000 rpm (tafelcentrifuge). Vortex 10 sec, en spin down 5 sec, 12.000 rpm. Transfer in een HPLC flesje voor LC-MS / MS analyse.
  20. Invriezen bij -20 ° C.
    OPMERKING: de monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C in dit stadium.

8. LC-MS / MS-analyse

  1. Voer een nano-LC (nano-LC-systemen) equipped met een RP-HPLC-kolom (75 urn x 37 cm) gepakt met C18 hars (Magic C18 AQ 3 urn) met een lineaire gradiënt van 95% oplosmiddel A (0,15% mierenzuur, 2% acetonitril) en 5% solvent B ( 98% acetonitril, 0,15% mierenzuur) tot 35% oplosmiddel B over 60 minuten bij een stroomsnelheid van 0,2 ul / min.
  2. Analyseer de peptiden met LC-MS / MS (dubbeldrukschakelaar LTQ-Orbitrap Velos massaspectrometer verbonden met een electrospray ionenbron).
    OPMERKING: De data acquisitie actief was een hoge resolutie MS scannen in de FT van de massa spectrometer met een resolutie van 60.000 FWHM gevolgd door MS / MS scans in de lineaire ionenval van de 20 meest intense ionen te verkrijgen. Om de efficiëntie van MS / MS pogingen te verhogen, werd de geladen toestand screening modus ingeschakeld toegewezen te sluiten en alleen laadt ionen. Collusie geïnduceerde dissociatie werd geactiveerd als de voorloper overschreden 100 ion telt. De dynamische duur uitsluiting werd ingesteld op 30 sec. De ion-accumulatie tijd was ingesteld op 300 msec (MS) en 50msec (MS / MS).

9. Database Zoeken

  1. Download de P. aeruginosa NCBI-databank via de NCBI homepage ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
  2. Omzetten van de MS ruwe spectra in mascotte generieke bestanden (MGF) met behulp van de MassMatrix conversie-tool ( http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py ).
  3. Zoek door deze mgf bestand met behulp van MASCOT versie 2.3 ten opzichte van de P. aeruginosa NCBI-database met daarin vooruit en achteruit-decoy eiwit inzendingen.
  4. Voer een in silico trypsinedigestie na lysine en arginine (tenzij gevolgd door proline) tolereren twee gemiste breuklijnen in volledig tryptische peptiden.
  5. Stel de database aan naar geoxideerd methionines (15,99491 Da) als variabele wijzigingen en carboxyamidomethylation (57,021464 Da) van cysteïne residuen als vaste modificatie mogelijk te maken. Voor MASCOT zoekt onsing hoge-resolutie scans, stel de voorloper massa tolerantie tot 15 ppm en stel het fragment massa tolerantie tot 0,6 Da. Tenslotte stelt het eiwit FDR tot 1%.
  6. Importeer de Mascot zoekopdrachten van P. aeruginosa CCMS experimenten in Steiger (Proteomesoftware, versie 3), de parameters aan een eiwit FDR dicht bij 1% te verkrijgen, en haal de totale spectrale telt.
  7. Voor de representatieve resultaten in dit document, gebruikten we een gepaarde T-test om te vergelijken het experiment met de controle concurrentie, en alleen beschouwd hits met een p-waarde van minder dan 0,1, en ​​een spectrale telling verhouding boven de 2 (experimenteren spectrale tellingen / competition controle spectrale tellingen).
  8. Gegevens kunnen worden geëxporteerd in een spreadsheet-software voor verdere analyse.

10.-Label gratis Kwantificering

  1. Importeer de raw-bestanden in Progenesis LC-MS-software (niet-lineaire dynamica, Versie 4.0).
  2. Voeren LC-MS uitlijning en functie detectie in gebreke settiNGS.
  3. De gegevens in MGF-formaat te exporteren uit Progenesis LC-MS.
  4. Zoeken in de MS / MS spectra met behulp van de MASCOT tegen de NCBI P. aeruginosa database met daarin vooruit en achteruit-decoy eiwit inzendingen.
  5. De database zoekresultaten in Progenesis LC-MS te importeren en in kaart de peptiden identificaties te MS1 functies.
  6. Voor de evaluatie van gegevens (berekening van betekenis niveaus, vouw-verandering ratio) de ProteinSQAnalysis script van SafeQuant werd gebruikt (drempel: q-waarde onder de 0,1, spectrale telling verhouding boven de 2).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om nieuwe C-di-GMP effectoren in P. identificeren aeruginosa we systematisch gebruikt CCMS om de oplosbare en membraan fracties van P. analyseren aeruginosa stam PAO1 uit een log-fase cultuur (OD 600 = 0,5). Hier samenvatten en bespreken we representatieve resultaten van deze vissen expeditie. Vier onafhankelijke biologische replica's werden gebruikt. Voor elk experiment twee CDG-CC concentraties werden gebruikt (5 uM en 10 uM). Sonderen van specificiteit werden experim...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Speciale aandacht moet worden genomen op verschillende stappen van het protocol. De eiwitconcentratie is een kritische parameter met een concentratie van 10 mg / ml moeilijk te bereiken wanneer de cellen worden gekweekt onder specifieke kweekomstandigheden (bijvoorbeeld biofilms of kleine kolonie varianten). Aldus zullen pellet resuspensie worden uitgevoerd in een klein volume lysisbuffer. Proteïne concentraties worden verlaagd tot 8 mg / ml. Vergeleken met de werkwijze gepubliceerd door Nesper et al. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We bedanken Alberto Reinders voor zijn werk aan het optimaliseren van de CCMS-condities voor P. aeruginosa. We bedanken ook Pablo Manfredi voor de annotatie van de P. aeruginosa-eiwitten. Dit werk werd ondersteund door de Swiss National Science Foundation (SNF) Sinergia-subsidie CRSII3_127433.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
caproBoxcaprotec bioanalytics1-5010-001 (220 V)UV-lampen gekoppeld aan een koelblok voor 96-platen, voor de fotoactivering
caproMagcaprotec bioanalyticsinbegrepen in het CCMS Starter KitVoor eenvoudig hanteren van magnetische deeltjes zonder pipetteren
c-di-GMP caproKitcaprotec bioanalyticsop aanvraagDe kit bevat het c-di-GMP-capturing compound, c-di-GMP (voor de concurrentiecontrole), met streptavidin bedekte magnetische kralen, capture buffer en wasbuffer
Disposable PD-10 Desalting ColumnsGE Healthcare17-0851-01 
12-tube PCR stripsThermo ScientificAB-1114
UIS250v sonicator met VialTweeterHielscher ultrasound technologieUIS250v en VialTweeter
Miniatuur French Pressure CellThermo Electron CorporationFA-003

Referenties

  1. Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
  2. Hengge, R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Nature reviews. Microbiology. 7, 263-273 (2009).
  3. Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. You've come a long way: c-di-GMP signaling. Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).
  4. Schirmer, T., Jenal, U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling. Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).
  5. Furukawa, S., Kuchma, S., O'Toole, G. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
  6. Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP. J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).
  7. Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles. J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).
  8. Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout. J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).
  9. Fazli, M., et al. The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia. Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).
  10. Hickman, J. W., Harwood, C. S. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor. Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).
  11. Sudarsan, N., et al. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP. Science. 321, 411-413 (2008).
  12. Lenz, T., et al. Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS). J Vis Exp. , (2010).
  13. Köster, H., et al. Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions. Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).
  14. Düvel, J., et al. A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).
  15. Christen, B., et al. Allosteric control of cyclic di-GMP signaling. J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).
  16. Balasubramanian, D., Mathee, K. Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa. Human genomics. 3, 349-361 (2009).
  17. Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).
  18. Baraquet, C., Harwood, C. S. Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).
  19. Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
  20. Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).
  21. DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands. Nuclear receptor signaling. 10, e002(2012).
  22. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59, 301-315 (2013).
  23. Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).
  24. Qi, Y., et al. Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change. J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

c di GMP bindende eiwittenPseudomonas aeruginosalyse met French pressultracentrifugatiePD 10 ontzoutingskolomstreptavidine magnetische kralenUV crosslinkingmassaspectrometrie analysebacteri le signaleringsnetwerken
Capture Compound Massaspectrometrie - een krachtig hulpmiddel om het identificeren van nieuwe c-di-GMP effectoreiwitten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.