Thin-layer Chromatographic (TLC) Scheidingen en Bioassays van plantenextracten te identificeren antimicrobiële verbindingen

Samenvatting

Methoden worden beschreven voor dunne-laag chromatografie (TLC) scheiding van plantenextracten en contact bioautografie antibacteriële metabolieten te identificeren. De methoden worden toegepast op de screening van rode klaver fenolen remmen hyper-ammoniak-producerende bacteriën (HAB) thuishoren in de runder pens.

Samenvatting

Een gemeenschappelijke scherm plantaardige antimicrobiële verbindingen bestaat uit het scheiden plantaardige extracten van papier of dunne-laag chromatografie (TLC of PC), waardoor de chromatogrammen microbiële suspensies (bijv. schimmels of bacteriën in bouillon of agar), waarbij tijd voor de microben groeien een vochtige omgeving, en visualiseren zones zonder microbiële groei. De doeltreffendheid van deze screening methode bekend als bioautografie, afhankelijk van de kwaliteit van de chromatografische scheiding en de zorgvuldigheid microbiële kweekomstandigheden. Dit artikel beschrijft standaardprotocollen voor TLC en contact bioautografie met een nieuwe toepassing om-zuur gistende bacteriën aminozuren. Het extract wordt afgescheiden in flexibele (aluminium omlijsting) silica TLC-platen en banden gevisualiseerd onder ultraviolet (UV) licht. Zones zijn uitgesneden en gedurende de voorkant omlaag op agar geënt met de test micro-organisme. Remmende banden worden gevisualiseerd door kleuring van de agar plaats met tetrazolium rood. De methode wordt toegepast op de scheiding van rode klaver (Trifolium pratense cv. Kenland) fenolen en hun screening op activiteit tegen Clostridium sticklandii, een hyper-ammoniak producerende bacterie (HAB) die is afkomstig uit de runder pens. De TLC methoden toepassen op vele soorten plantenextracten en andere bacteriesoorten (aëroob of anaëroob), evenals schimmels, kan worden gebruikt als testorganismen als cultuuromstandigheden worden aangepast aan de groeivereisten van de soort passen.

Inleiding

Testen op antimicrobiële verbindingen in planten vereist het scheiden van de componenten van een plantenextract, blootstellen test micro-organisme die delen, en het bepalen of groei van het micro-organisme wordt geremd door een van de verbindingen. Scheidingen door papier of dunne-laag chromatografie (TLC of PC) zijn handig omdat veel verbindingen kunnen worden gescheiden op een vlak oppervlak. Scheiding is gebaseerd op polariteit met sommige verbindingen binden stevig aan het adsorptiemiddel (cellulose bij pc, en een verscheidenheid van adsorptiemiddelen bij TLC) en het migreren van minder dan anderen ^1. Figuur 1 geeft een voorbeeld van de relatieve posities van polaire en niet-polaire fenolen na scheiding op een silica TLC-plaat.

Figuur 1. Diagram verdelingen van verbindingen met verschillende polariteit na scheiding op een silica dunne-laagchromatografie (TLC) plaat. Fenolverbindingen rode klaver (Trifolium pratense L.) dienen als voorbeeld. Polaire verbindingen, zoals clovamide, een sterke affiniteit voor een polair adsorptiemiddel zoals silica en blijft bij de oorsprong (OR), terwijl minder polaire verbindingen, zoals de drie isoflavonen bij vloeistoffront (SF), verdeling gemakkelijker in de oplosmiddelen (die minder polair dan silica tenzij water, zuren, basen of zijn opgenomen) en migreren verder de plaat.

Na afscheiding van een extract op een TLC-plaat kunnen micro-organismen in worden blootgesteld aan verbindingen op de plaat, waardoor sneller de identificatie van de actieve componenten van een extract ^2. Als een schimmel of bacteriële kweek wordt blootgesteld aan het chromatogram zal microbiële groei overal optreden behalve dan gebieden met groei-inhibitory verbindingen. Remmingszones dan kan worden gevisualiseerd door het observeren van het contrast tussen myceliumgroei en de groei gebieden als fungi zijn aangebracht ³ of door besproeien met verbindingen die van kleur veranderen wanneer verminderd of gehydrolyseerd door levende cellen ^4. Hoewel het gebruik van papier of dunne-laag chromatogrammen antimicrobiële assays eerst werd op ⁵ antibiotica en fungiciden ^3,6 worden plantenextracten nu regelmatig onderzocht op antimicrobiële samenstellingen met deze werkwijze vaak aangeduid als bioautografie. De hierin beschreven protocollen toepassing bioautografie dunne-laag chromatogrammen. TLC wordt veel gebruikt omdat het relatief snel en kan worden uitgevoerd op verschillende adsorptiemiddelen (bijvoorbeeld silica, zetmeel, aluminiumoxide), alsmede het verschaffen van goede resolutie en gevoeligheid ^1.

Plantenextracten kunnen worden voorbereid TLC op vele manieren. Voorkomende methodes zijn extraheren plantmateriaal in alcohol-watermengsel zoals 80% ethanol ^7,8, eventueel met toevoeging van zuur of base ^9. Na een extractie dergelijke oplosmiddelen, die wat water bevatten en eventueel zure of basische moet extracten worden geconcentreerd zodat ze kunnen worden toegepast op TLC platen in een minimaal volume. De concentratie van alcohol-water extracten worden bereikt door het verdelen van met water mengbare organische oplosmiddelen ⁸ of een mengsel van dergelijke oplosmiddelen, zoals ethylacetaat-ethylether (1:1, v / v) ^10,11. Verschillende plantmetabolieten worden geëxtraheerd in verschillende organische oplosmiddelen, afhankelijk van de polariteit. Om plantaardige organische zuren of basen worden geëxtraheerd in organische oplosmiddelen in dit stadium kan de pH van een alcohol-water extract worden verhoogd of verlaagd met een in water oplosbare zuur of base aan gedissocieerde analyten zetten in hun nondissociated vormen, die vervolgens oplosbaar in neutraal organische oplosmiddelen ^9. De organische fase kan dan worden evaporated onder verminderde druk of onder stikstof en op de gewenste volume TLC. De pH van het extract waarschijnlijk dodelijk bioassay microorganismen door de verdeling van analyten in neutrale oplosmiddelen, kleine eindvolume en indampen van het extract op de TLC plaat vóór scheiding zijn.

Zowel schimmels en bacteriën werkzaam zijn als proef micro-organismen in bioautografie van plantenextracten ^2. Sporen van sommige schimmels, zoals Cladosporium cucumerinum ontkiemen op TLC-platen (met uitzondering van gebieden met remmende verbindingen) of gesproeid op platen in een voedingsoplossing en geïncubeerd in een vochtige omgeving voor meerdere dagen ^3. De donkere mycelium van C. cucumerinum op non-inhibitive zones zorgt voor een scherp contrast met zones vrij van myceliumgroei. Hoewel bacteriën zijn toegepast op dunnelaagchromatografie (TLC) platen op dezelfde wijze ^4,12, zijn bacteriën ook uitgegoten over TLCplaat oppervlakken in agar overlays ^13,14. Gist zoals Candida albicans, kunnen worden toegepast agar overlays en ^14. Als alternatief TLC-platen kan worden gezicht naar beneden geplaatst op agar geënt met bacteriën ^10,15 of gist ^8, een methode die bekend staat als contact bioautografie ^2.

We beschrijven een methode voor contact bioautografie om te screenen op antimicrobiële fenolen uit rode klaver (Trifolium pratense cv. Kenland). De test micro-organisme Clostridium sticklandii, een pens hyper-ammoniak producerende bacterie (HAB) en obligaat anaërobe. Hoewel de scheidingen die niet alle componenten van het extract lossen, vergemakkelijken ze de identificatie van gebieden van antimicrobiële activiteit, waardoor het verkleinen van de pool van mogelijke antimicrobiële verbindingen. Het protocol maakt gebruik van standaardprocedures voor TLC ^1. Het protocol beschrijft ook een aantal van de technieken die nodig zijn voor het kweken obligate anaeroben voor een dergelijke test, een gebruik van contact bioautografie ¹⁵ en een visualisatie methode met een tetrazoliumzout, die levende cellen ^2,4 vlekken.

Protocol

1. Voorbereiding van Plant Extract

1. Zie Kagan en Flythe ¹⁰ voor de extractie van fenolische verbindingen van Trifolium pratense cv. Kenland.
2. Om andere verbindingen te extraheren in andere planten, controleer dan de fytochemische analyse literatuur voor planten-of metaboliet-specifieke extractie methoden (velen zijn beschreven), of kijk naar protocollen zoals die van Khurram et al.. ^7,8 die veel verbindingen te isoleren met een brede waaier van polariteiten.

2. Bereiding van dunne-laagplaten

1. Schoon TLC platen meer door in een of meer polair, neutraal oplosmiddel, teneinde geadsorbeerde verontreinigingen weg van de zone van ontwikkeling bewegen.
   1. In een zuurkast bereiden genoeg gebruikte oplosmiddel (bijv. 15-100 ml ethylacetaat-methanol 02:01, v / v) aan de onderzijde van de TLC ontwikkelkamer, en de onderrand van een TLC-plaat als set dekken binnen de kamer.
   2. Gebruik commerverkrijgbare glazen TLC ontwikkelen van camera's (verschillende maten verkrijgbaar, met een deksel) of-folie bedekt Pyrex bekers of weckpotten.
   3. Gebruik een schaar om aluminium-of kunststof-backed (flexibele) silicagel platen, die zijn er in verschillende maten (20 cm x 20 cm en kleiner), de beschikbare ontwikkelkamer pasvorm. (Let op: silica kan longschade veroorzaken bij inademing Werk in een zuurkast, en handvat TLC platen met handschoenen om te voorkomen dat de huid olie op het silica..)
   4. Plaats de platen in de kamer, met de toppen leunend tegen de wanden. De platen moeten elkaar niet raken. Bedek de kamer en laat het oplosmiddel hoger op de plaat door capillaire werking.
   5. Als oplosmiddel de bovenkant van de platen heeft bereikt, verwijderen platen uit kamer en schik in een staande positie in de zuurkast tot oplosmiddel verdampt is.
   6. Controleer of onzuiverheden in de buurt van de bovenkant van de TLC-plaat zijn gemigreerd op zoek naar een gele band onder zichtbaarlicht, of een fluorescerende band onder ultraviolet (UV) licht (zie de "onzuiverheid front" of als in figuur 2B). Als de meerderheid van de plaat heeft nog steeds een gelige tint, herhaal het reinigingsproces.
   7. Na het verwijderen van TLC-platen uit de kamer, gooi het oplosmiddel. Laat restoplosmiddel volledig verdampt voordat u de kamer voor protocol 2.
   8. Om restvocht die invloed migratie van verbindingen op silica ¹⁶ verwijderen prop de platen rechtop in een droogoven bij 100 ° C (10-15 min bij 20 cm x 20 cm plaat en 5 min bij 7 cm x 10 cm platen ).
   9. Bij 100 ° C droogoven niet beschikbaar, warmte platen gedurende langere tijd bij lagere temperaturen (bijvoorbeeld 40 minuten bij 60 ° C).
   10. Nadat de platen droog, laat ze afkoelen tot kamertemperatuur voordat het laden.

3. Voorbereiding van de ontwikkeling van Chambers voor Extract scheiding

1. Knip met een schaar een stuk filtreerpapier iets onder kamer hoogte, en ongeveer de helft van de kamer perimeter in de breedte snijden. Dit document dient als een lont te stellen oplosmiddel de kamerwand en verzadigen de kamer met dampen van oplosmiddelen, waardoor het verbeteren van de reproduceerbaarheid van scheidingen ^1.
2. In een zuurkast, meng oplosmiddelen (ethylacetaat-methanol 4:1, v / v, voor deze studie). Giet oplosmiddel mengsel in de kamer en dekken. Wacht tot de hele lont is nat met oplosmiddel, wat aangeeft kamer verzadiging, om platen in de kamer te zetten.

4. Laden en Ontwikkeling van TLC platen

1. Lichtjes markeren de oorsprong met potlood. Als de TLC-plaat adsorbens is zacht en gemakkelijk beschadigd raken, maken merken randen. Verbindingen moet boven het oppervlak van de ontwikkelvloeistof als platen in de TLC kamer worden geplaatst.
2. Los uittreksels voldoende organisch oplosmiddel (in casu methanol) om een ​​geconcentreerde oplossing in plaats van een troebele hebbensuspensie.
3. Load monsters en standaarden als smalle banden met een microliter injectiespuit of capillaire micropipetten, waardoor een 1 cm rand aan de zijkanten van de plaat. Laat de banden om te drogen (waaieren de plaat of u het in een zuurkast helpt).
4. Als een grotere concentratie van het monster op een bord, "overspot" is nodig door het laden monsters weer op de droge banden.
5. Met een pincet of tang, de gemonteerde plaat (s) in de verzadigde TLC kamer. De platen moeten niet de lont aan, aangezien hij op contactpunten oplosmiddel kan leveren aan de platen, waardoor het pad van verbinding migratie veranderen. Bedek kamer en laat platen te ontwikkelen.

5. Voorbereiding van de plaatjes voor Bioassay

1. Verwijder de plaat (s) van TLC tank voordat het oplosmiddel voor de bovenkant van de plaat is gekomen, en markeer de hoogte van het oplosmiddel voorzijde met een potlood. Laat plaat droog in zuurkast.
   1. Ontwikkel resterende TLC platen in dezelfde TLC kamer die is generally bruikbaar voor een hele dag als gesloten gehouden. Remake oplosmiddelenmengsel voor TLC kamer als de hoeveelheid oplosmiddel in de kamer daalt met name.
2. Na platen zijn droog, visualiseren banden onder zichtbaar of UV-licht, en af ​​te bakenen banden met potlood. Een weergave kamer met een draagbare UV-lamp is geschikt, vooral wanneer de lamp verbindingen detecteren zowel 254 nm (korte golf UV) en 365 nm (lange-golf UV).
   NB: Op dit punt of na de volgende stap kunt platen worden verpakt in plastic folie, bedekt met een folie, en opgeslagen bij -20 ° C. Maximale opslagcapaciteit is afhankelijk van samengestelde stabiliteit. Omdat silica is niet neutraal, kunnen sommige verbindingen terwijl degraderen op de TLC-plaat.
3. Fotograferen of tekenen platen.
   1. Gebruik een gel photodocumentation systeem als een uitgerust met overhead UV en / of zichtbaar licht beschikbaar is.
   2. Als er geen commerciële photodocumentation systeem beschikbaar is, foto platen binnenkant van een doos bekleed met donker papier of doek, wiTh Een camera op een statief en een draagbare UV-licht vastgeklemd zit op een ring staan ^​​17. Bij het ​​fotograferen van platen die geen fluorescentie-indicator hebben, gebruik dan een blauw licht filter over de lens van de camera om band uiterlijk ¹⁷ te verbeteren.
4. Om te helpen bij het ​​karakteriseren van bands, berekenen retentiefactor _(Rf) waarden door het meten van afstanden afleggen verbinding en oplosmiddel voor, en het verdelen van de eerstgenoemde aan de laatstgenoemde (Figuur 2A).

6. Bacteriële Cultuur en Assay

1. Bereiden en te enten media onder anaërobe omstandigheden. De cultuur die in dit geval was Clostridium sticklandii stam SR, die werd verkregen uit de kweek collectie van James B. Russell, Cornell University, Ithaca, NY.
   1. Zie Flythe en Kagan ¹³ en de lijst met materialen voor een beschrijving van HAB media.
2. Groeien de cultuur tot exponentiële of stationaire fase. Gebruik steriele anaërobe techniques bij het werken met anaërobe micro-organismen.
3. Injecteer de (1% v / v) in gesmolten agar nadat de temperatuur van de agar (0,75% w / v) is gedaald tot minder dan 60 ° C. Meng voorzichtig en onmiddellijk brengen in een anaerobe kamer (95% CO ₂ -5% H ₂ atmosfeer voor HAB media) te gieten.
4. Giet het mengsel in 15 mm x 100 mm kunststof petrischaaltjes, en laat stollen.
5. Knip met een schaar de TLC-plaat in zones met band (s) van belang. Leg bands gezicht naar beneden op agar-platen, het markeren van banden op de plaat steun voor het bijhouden van de oorspronkelijke oriëntatie op TLC plaat te houden. Leg een ongebruikte TLC strook op een agar plaat als controle.
6. Incubeer agarplaten, agar naar beneden, in de anaërobe kamer (24 uur, 39 ° C).

7. Visualisatie van een bioassay Agar Plates

1. Met een pincet, verwijder bands uit agar-platen, terwijl ze in de anaërobe kamer.
2. Voeg 1% (w / v) tetrazolium rood, bereid in water, druppelsgewijs op de oppervlakken van de agarplaten. Laat de kleur ontwikkelen gedurende ten minste 20 minuten, of totdat de controle-plaat wordt helemaal rood, voordat u bij de anaërobe kamer. De anaërobe bacteriën beginnen levensvatbaarheid verliezen onmiddellijk na verwijdering uit de anaërobe kamer, maar de kleur is stabiel gedurende meer dan 24 uur.
3. Fotograferen onder zichtbaar licht.

Resultaten

Vertegenwoordiger silica TLC scheidingen van rode klaver (Trifolium pratense cv. Kenland) extracten, het bevat fenolische verbindingen, zijn weergegeven in figuur 2. Scheiding van rode klaver extract in ethylacetaat-hexaan (9:1, v / v), meer dan 8,5 cm, resulteerde in vijf banden, een onvolledig gescheiden van de oorsprong (Figuur 2A). Echter, Figuur 2B toont aan dat ongeveer tweemaal zoveel banden werden onthuld wanneer een ander monster van rode klaver extrac...

Discussie

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het scheiden van een extract in deelverzamelingen van verbindingen en het testen van de subsets door contact bioautografie. De methode is vrij gelijkaardig aan degene die door Chomnawang et al.. ¹⁵ voor het screenen op plantenmetabolieten remmende to-gonorroe-veroorzakende bacteriën. Het type bioautografie gebruikt om het scherm voor antimicrobiële plantaardige stoffen hangt af van vele factoren, waaronder de test micro-organisme, het laboratorium s...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Silica F254 TLC-platen, aluminium-ondersteund, dikte 0,2 mm, 20 cm x 20 cm	EMD Chemicals	5554/7	Deze platen zijn bedekt met silica die een indicator bevat die fluoresceert bij 254 nm.  Verbindingen die absorberen bij die golflengte, verschijnen donker op een fluorescerend groen achtergrond.  Alternatieve bronnen omvatten Analtech, Selecto Scientific, Fluka.  Andere adsorbentia dan silica kunnen nodig zijn.  Platen met plastic achterkant kunnen geschikt zijn, afhankelijk van de te gebruiken oplosmiddelen.
Scherpe, zware schaar	elke naaibenodigdhedenwinkel	vergelijkbaar met Fiskars 175800-1002	Voor het snijden van TLC-platen.  Een papiersnijder met een scherp mes kan ook worden gebruikt.  Adem geen silicastof in.
Droogoven bij 100 °C (mechanische convectie)	Thermo Scientific	PR305225M	Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)
TLC-kamer	Kimble Chase	416180-0000	Alternatieve bronnen:  Aldrich. Pyrex bekers of conserveringspotten kunnen worden gebruikt voor kleine platen (bijv. 5 cm x 10 cm).  Bedek met aluminiumfolie (potdeksels kunnen materiaal bevatten dat kan worden geëxtraheerd door oplosmiddeldampen).
50 µl-spuit met platte naaldpunt	Hamilton	80965	Voor het laden van hoeveelheden standaard of monster die groter zijn dan 5-10 µl.  Alternatieve bronnen zijn gelijkwaardig.
Micropipetten	Drummond	2-000-001	Voor het laden van kleine hoeveelheden standaarden of monsters.  Alternatieve bronnen:  VWR.  Ook kunnen Pasteur-pipetten met een butaanbrander worden uitgerekt tot een dunnere diameter.
Filterpapier (#1-kwaliteit)	Whatman	1001 917	Dient als kamerwrik.  Andere kwaliteiten filterpapier zijn OK.  Deze maat kan worden bijgesneden voor de kamers die platen van 20 cm x 20 cm bevatten.
Kolventang	Fisher Scientific	15-186	Voor het in en uit een grote TLC-kamer zetten van platen.  Alternatieve bronnen: VWR
Pincet met platte rand	Fisher Scientific	10-275	Voor het in en uit een kleine kamer zetten van platen. Alternatieve bronnen: VWR
Kleine draagbare UV-lamp met 4 W of 6 W-lampen voor kort- en langgolf UV-lichtverlichting (respectievelijk 254 en 365 nm)	Ultraviolet Products	95-0271-01	Alternatieve bronnen: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)
Beeldkast voor gebruik met hand-UV-lamp	Ultraviolet Products	Chromato-Vue C-10E	UV-actieve banden zijn gemakkelijker omcirkeld als platen hierin kunnen worden geplaatst.  Alternatieve bronnen: Spectronics Corporation.
Fotodocumentatiesysteem met overhead UV-lamp en zichtbare lamp	Kodak	Gel Logic 200	Alternatieve bronnen: Ultraviolet Products (www.uvp.com).  Zie protocol voor zelfgemaakte alternatief.
Anaërobe kamer, type A, vinyl	Coy	7150000	Deze kamer is geschikt voor anaërobe bacteriën, zoals Clostridium sticklandii, zoals beschreven.  Echter, groeiomstandigheden moeten worden aangepast aan het organisme dat in de test wordt gebruikt.  Een bioveiligheidskast en andere voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen als pathogene organismen worden gebruikt. Alternatieve bronnen: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, anderen
Tetrazolium rood	Sigma-Aldrich	T8877	Alternatieve bronnen: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar
Ingrediënten voor HAB-media
Pyridoxamine · 2HCl	Sigma-Aldrich	P9380	Voor dit en voor alle andere reagentia in deze tabel zijn alternatieve bronnen gelijkwaardig.
Riboflavine	Sigma-Aldrich	R4500
Thiamine HCl	Sigma-Aldrich	T3902
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N3376
Calcium D-Pantothenaat	Sigma-Aldrich	C8731
Lipoic Zuur	Sigma-Aldrich	T5625
p-Aminobenzoëzuur	Sigma-Aldrich	A9878
Foliumzuur	Sigma-Aldrich	F8798
Biotine	Sigma-Aldrich	B4639
Cobalamine	Sigma-Aldrich	C3607
Pyridoxal HCl	Sigma-Aldrich	P9130
Pyridoxine	Sigma-Aldrich	P5669
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
IJzersulfaat · 7H2O	Sigma-Aldrich	F8263
Zinksulfaat · 7H2O	Sigma-Aldrich	Z0251
Manganchloride · 4H2O	Sigma-Aldrich	M8054
Borzuur	Sigma-Aldrich	B6768
Kobaltchloride · 6H2O	Sigma-Aldrich	C8661
Koperchloride · 2H2O	Sigma-Aldrich	459097
Nikkelchloride · 6H2O	Sigma-Aldrich	203866
Natriummolybdaat · 2H2O	Sigma-Aldrich	331058
Trypticase (pancreatische digest van caseïne)	Thermo Fisher	B11921
Kaliumfosfaat monobasisch watervrij	Thermo Fisher	P284
Natriumcarbonaat &