Methoden worden beschreven voor dunne-laag chromatografie (TLC) scheiding van plantenextracten en contact bioautografie antibacteriële metabolieten te identificeren. De methoden worden toegepast op de screening van rode klaver fenolen remmen hyper-ammoniak-producerende bacteriën (HAB) thuishoren in de runder pens.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Thin-layer Chromatographic (TLC) Scheidingen en Bioassays van plantenextracten te identificeren antimicrobiële verbindingen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een gemeenschappelijke scherm plantaardige antimicrobiële verbindingen bestaat uit het scheiden plantaardige extracten van papier of dunne-laag chromatografie (TLC of PC), waardoor de chromatogrammen microbiële suspensies (bijv. schimmels of bacteriën in bouillon of agar), waarbij tijd voor de microben groeien een vochtige omgeving, en visualiseren zones zonder microbiële groei. De doeltreffendheid van deze screening methode bekend als bioautografie, afhankelijk van de kwaliteit van de chromatografische scheiding en de zorgvuldigheid microbiële kweekomstandigheden. Dit artikel beschrijft standaardprotocollen voor TLC en contact bioautografie met een nieuwe toepassing om-zuur gistende bacteriën aminozuren. Het extract wordt afgescheiden in flexibele (aluminium omlijsting) silica TLC-platen en banden gevisualiseerd onder ultraviolet (UV) licht. Zones zijn uitgesneden en gedurende de voorkant omlaag op agar geënt met de test micro-organisme. Remmende banden worden gevisualiseerd door kleuring van de agar plaats met tetrazolium rood. De methode wordt toegepast op de scheiding van rode klaver (Trifolium pratense cv. Kenland) fenolen en hun screening op activiteit tegen Clostridium sticklandii, een hyper-ammoniak producerende bacterie (HAB) die is afkomstig uit de runder pens. De TLC methoden toepassen op vele soorten plantenextracten en andere bacteriesoorten (aëroob of anaëroob), evenals schimmels, kan worden gebruikt als testorganismen als cultuuromstandigheden worden aangepast aan de groeivereisten van de soort passen.
Inleiding
Testen op antimicrobiële verbindingen in planten vereist het scheiden van de componenten van een plantenextract, blootstellen test micro-organisme die delen, en het bepalen of groei van het micro-organisme wordt geremd door een van de verbindingen. Scheidingen door papier of dunne-laag chromatografie (TLC of PC) zijn handig omdat veel verbindingen kunnen worden gescheiden op een vlak oppervlak. Scheiding is gebaseerd op polariteit met sommige verbindingen binden stevig aan het adsorptiemiddel (cellulose bij pc, en een verscheidenheid van adsorptiemiddelen bij TLC) en het migreren van minder dan anderen 1. Figuur 1 geeft een voorbeeld van d....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van Plant Extract
- Zie Kagan en Flythe 10 voor de extractie van fenolische verbindingen van Trifolium pratense cv. Kenland.
- Om andere verbindingen te extraheren in andere planten, controleer dan de fytochemische analyse literatuur voor planten-of metaboliet-specifieke extractie methoden (velen zijn beschreven), of kijk naar protocollen zoals die van Khurram et al.. 7,8 die veel verbindingen te isoleren met een brede waaier van polariteiten.
2. Bereiding van dunne-laagplaten
- Schoon TLC platen meer door in een of meer polair, neutraal oplosmiddel, ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Vertegenwoordiger silica TLC scheidingen van rode klaver (Trifolium pratense cv. Kenland) extracten, het bevat fenolische verbindingen, zijn weergegeven in figuur 2. Scheiding van rode klaver extract in ethylacetaat-hexaan (9:1, v / v), meer dan 8,5 cm, resulteerde in vijf banden, een onvolledig gescheiden van de oorsprong (Figuur 2A). Echter, Figuur 2B toont aan dat ongeveer tweemaal zoveel banden werden onthuld wanneer een ander monster van rode klaver extrac.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het scheiden van een extract in deelverzamelingen van verbindingen en het testen van de subsets door contact bioautografie. De methode is vrij gelijkaardig aan degene die door Chomnawang et al.. 15 voor het screenen op plantenmetabolieten remmende to-gonorroe-veroorzakende bacteriën. Het type bioautografie gebruikt om het scherm voor antimicrobiële plantaardige stoffen hangt af van vele factoren, waaronder de test micro-organisme, het laboratorium s.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Vermelding van handelsnamen of commerciële producten in het artikel is uitsluitend ten behoeve van het verstrekken van specifieke informatie en impliceert niet aanbeveling of goedkeuring door de USDA. De auteurs verklaren geen concurrerende financieel belang.
Dankbetuigingen
Wij danken wijlen Dr Norm Taylor, Dept Plant and Soil Science aan de Universiteit van Kentucky, voor het mogelijk maken om de monsters van zijn rode klaver percelen voor deze studie. Dit project werd gefinancierd door het Amerikaanse ministerie van Landbouw.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Silica F254 TLC-platen, aluminium-ondersteund, dikte 0,2 mm, 20 cm x 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | Deze platen zijn bedekt met silica die een indicator bevat die fluoresceert bij 254 nm. Verbindingen die absorberen bij die golflengte, verschijnen donker op een fluorescerend groen achtergrond. Alternatieve bronnen omvatten Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Andere adsorbentia dan silica kunnen nodig zijn. Platen met plastic achterkant kunnen geschikt zijn, afhankelijk van de te gebruiken oplosmiddelen. |
| Scherpe, zware schaar | elke naaibenodigdhedenwinkel | vergelijkbaar met Fiskars 175800-1002 | Voor het snijden van TLC-platen. Een papiersnijder met een scherp mes kan ook worden gebruikt. Adem geen silicastof in. |
| Droogoven bij 100 °C (mechanische convectie) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC-kamer | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternatieve bronnen: Aldrich. Pyrex bekers of conserveringspotten kunnen worden gebruikt voor kleine platen (bijv. 5 cm x 10 cm). Bedek met aluminiumfolie (potdeksels kunnen materiaal bevatten dat kan worden geëxtraheerd door oplosmiddeldampen). |
| 50 µl-spuit met platte naaldpunt | Hamilton | 80965 | Voor het laden van hoeveelheden standaard of monster die groter zijn dan 5-10 µl. Alternatieve bronnen zijn gelijkwaardig. |
| Micropipetten | Drummond | 2-000-001 | Voor het laden van kleine hoeveelheden standaarden of monsters. Alternatieve bronnen: VWR. Ook kunnen Pasteur-pipetten met een butaanbrander worden uitgerekt tot een dunnere diameter. |
| Filterpapier (#1-kwaliteit) | Whatman | 1001 917 | Dient als kamerwrik. Andere kwaliteiten filterpapier zijn OK. Deze maat kan worden bijgesneden voor de kamers die platen van 20 cm x 20 cm bevatten. |
| Kolventang | Fisher Scientific | 15-186 | Voor het in en uit een grote TLC-kamer zetten van platen. Alternatieve bronnen: VWR |
| Pincet met platte rand | Fisher Scientific | 10-275 | Voor het in en uit een kleine kamer zetten van platen. Alternatieve bronnen: VWR |
| Kleine draagbare UV-lamp met 4 W of 6 W-lampen voor kort- en langgolf UV-lichtverlichting (respectievelijk 254 en 365 nm) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternatieve bronnen: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Beeldkast voor gebruik met hand-UV-lamp | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-actieve banden zijn gemakkelijker omcirkeld als platen hierin kunnen worden geplaatst. Alternatieve bronnen: Spectronics Corporation. |
| Fotodocumentatiesysteem met overhead UV-lamp en zichtbare lamp | Kodak | Gel Logic 200 | Alternatieve bronnen: Ultraviolet Products (www.uvp.com). Zie protocol voor zelfgemaakte alternatief. |
| Anaërobe kamer, type A, vinyl | Coy | 7150000 | Deze kamer is geschikt voor anaërobe bacteriën, zoals Clostridium sticklandii, zoals beschreven. Echter, groeiomstandigheden moeten worden aangepast aan het organisme dat in de test wordt gebruikt. Een bioveiligheidskast en andere voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen als pathogene organismen worden gebruikt. Alternatieve bronnen: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, anderen |
| Tetrazolium rood | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternatieve bronnen: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingrediënten voor HAB-media | |||
| Pyridoxamine · 2HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | Voor dit en voor alle andere reagentia in deze tabel zijn alternatieve bronnen gelijkwaardig. |
| Riboflavine | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Calcium D-Pantothenaat | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Lipoic Zuur | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoëzuur | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Foliumzuur | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotine | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamine | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| IJzersulfaat · 7H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Zinksulfaat · 7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganchloride · 4H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Borzuur | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Kobaltchloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Koperchloride · 2H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nikkelchloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Natriummolybdaat · 2H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Trypticase (pancreatische digest van caseïne) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Kaliumfosfaat monobasisch watervrij | Thermo Fisher | P284 | |
| Natriumcarbonaat & | |||
Referenties
- Stahl, E., Ashworth, M. R. F. Thin-layer chromatography. , Springer. (1969).
- Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.
- Homans, A. L., Fuchs, A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
