Kwantitatieve Proteomics behulp Reductieve dimethylering voor stabiele isotopen Labeling

Summary

Stabiele isotoop labeling van peptiden door reductieve dimethylering (Redi etikettering) is een snelle, goedkope strategie voor nauwkeurige massa-spectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomics. Hier laten we een robuuste werkwijze voor de bereiding en analyse van eiwitmengsels met de Redi aanpak die kan worden toegepast op vrijwel elk type monster.

Abstract

Stabiele isotopen van peptiden door reductieve dimethylering (Redi labeling) is een methode om nauwkeurig kwantificeren eiwitexpressie verschillen tussen monsters met behulp van massaspectrometrie. Redi etikettering wordt uitgevoerd met behulp van gewone (licht) of gedeutereerde (zware) vormen van formaldehyde en natriumcyaanboriumhydride twee methylgroepen toevoegen aan elke vrije amine. Hier laten we zien een robuust protocol voor Redi etikettering en kwantitatieve vergelijking van complexe eiwitmengsels. Eiwitmonsters ter vergelijking worden gedigesteerd in peptiden gelabeld ofwel lichte of zware methyl markeringen, gemengd en samen geanalyseerd met LC-MS/MS dragen. Relatieve dichtheden eiwit gekwantificeerd door vergelijking van de ionenchromatogram piekoppervlakten van zware en lichte gemerkte versies van de samenstellende peptide geëxtraheerd uit de volledige MS-spectra. De hier beschreven methode is inclusief monstervoorbereiding met reversed phase vaste-fase-extractie, on-column Redi etikettering van peptiden, peptide fractionering door basische pH reversed-fase (BPRP) chromatografie, en StageTip peptide zuivering. We bespreken de voordelen en beperkingen van Redi etikettering met betrekking tot andere methoden voor een stabiele isotoop oprichting. We belichten nieuwe toepassingen met Redi labeling als een snelle, goedkope en nauwkeurige methode om eiwit abondantie vergelijken in bijna elk soort monster.

Introduction

Het meten van de concentratie verschillen van veel eiwitten tussen complexe monsters is een centrale uitdaging in proteomics. In toenemende mate wordt dit gedaan door het merken van eiwitten in elk monster met verschillende isotopische labels combineren van de monsters en met massaspectrometrie om concentratieverschillen kwantificeren. Verschillende methoden bestaan ​​voor stabiele isotopische labeling van eiwitten en peptiden. ¹⁵ N etikettering ¹ en ² SILAC voeren isotopische labels metabolisch in vivo, terwijl iCAT ^3, iTRAQ ⁴ en vermindering dimethylering ⁵ commentaar stabiele isotoop labels na eiwitextractie en vertering. Onder deze methoden, is reductieve dimethylering (Redi etikettering) aan populariteit wint als een goedkope en reproduceerbare methode om eiwitconcentratie verschillen in bijna elk type monster te kwantificeren.

Redi etikettering omvat peptiden reageren met formaldehyde om een ​​Schiff base, dat vervolgens wordt gereduceerd vormendoor cyanoboorhydride. Deze reactie dimethylates vrije aminogroepen op N-uiteinden en lysinezijketens en monomethylates N-terminale prolines. De hier beschreven protocol methyleert peptiden in monster 1 met een "lichte" label met reagentia met waterstofatomen in hun natuurlijke isotopische distributie en monster 2 met een "zware" label met gedeutereerd formaldehyde en dride (figuur 1). Elke digemethyleerd aminogroep op een peptide resulteert in een massaverschil van 6,0377 Da tussen lichte en zware vormen, die wordt gebruikt om onderscheid te maken tussen de twee vormen met een massaspectrometer. In het bijzonder, zijn ten opzichte van peptide abundanties gekwantificeerd als de verhouding van MS1 ​​gewonnen ionenchromatogram gebieden (MS1 piekoppervlakte ratio) van lichte en zware uitvoering voor elk peptide ionenpaar. De relatieve abundantie van een eiwit wordt berekend als de mediaan MS1 ​​piekoppervlak verhouding tussen alle peptiden in het proteïne. In dit rapport beschrijven we een robuust protocol voor gedraging Redi markeringsexperimenten door LC-MS/MS dat omgekeerde fase peptide vaste fase extractie op-kolom Redi etikettering peptide fractionering door basische pH omgekeerde fase (BPRP) chromatografie en zuivering van peptide mengsels met StageTips (figuur 2) omvat . We bespreken de voordelen en beperkingen van het gebruik van Redi etikettering voor kwantitatieve proteomics.

Protocol

OPMERKING: Deze methode werd eerder beschreven ^12.

1. Eiwitisolatie

Bereid 1 mg cellulair eiwit door het lyseren van cellen, bij voorkeur door fysische werkwijzen zoals Franse pers, kralen slaan of sonicatie. Vermijd-lysozym-gemedieerde cellysis omdat het enzym massaspectrometrie metingen zullen beschamen.

2. TCA precipitatie van de eiwitten

Voeg 1 volume trichloorazijnzuur (TCA) aan 4 delen eiwit en chill op ijs gedurende 10 minuten om eiwitten neer te slaan. Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in 1 ml ijskoude aceton en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en keer de buis op de bank om de pellet gedurende 15 minuten drogen. WINKEL eiwit pellets bij -80 ° C.

3. Denaturatiesectie Eiwitten en verminderen zwavelbruggen

Renaar ~ 2 mg / ml in 500 pl denaturatie en vermindering buffer (hetzij 4 M ureum of 3% SDS in 50 mM HEPES pH 8,5, 5 mM DTT) schorten eiwitten. Eventueel omvatten een proteaseremmer in de buffer. Incubeer eiwitten gedurende 30 min bij 56 ° C, gevolgd door 10 min bij kamertemperatuur.

4. Aklylate Gratis sulfohydrylgroepen onomkeerbaar Disrupt disulfidenbinding Vorming

Bereid verse 0,3 M iodoacetamide in water. LET OP! Iodoacetamide is zeer giftig. Voeg 25 gl 0,3 M joodaceetamide (15 mM eindconcentratie) 500 pi eiwit en incubeer gedurende 20 min in het donker bij kamertemperatuur. Quench iodoacetamide door het toevoegen van 10 pi van 300 mM DTT (5 mM DTT uiteindelijke concentratie). Slaan gealkyleerde eiwitten bij -80 ° C.

5. Eiwitvertering

TCA precipiteren eiwitten (zoals beschreven in stap 2) en resuspendeer in 1 ml 50 mM HEPES (pH 8,2), 1 M ureum. Bereid een voorraad oplossing van Lysyl endoproteinase (Lys-C) in water bij een concentratie van 2 ug / ul en voeg 5 ul aan de eiwitoplossing. Incubeer het mengsel gedurende 16 uur bij kamertemperatuur geroerd. Controleer de uiteindelijke Lys-C concentratie 10 ng / ul en het eiwit naar LysC verhouding (w / w) 1/50 tot 1/200. Resuspendeer 20 ug sequentie rang trypsine in 40 ui 50 mM azijnzuur, 5 pi (10 pg trypsine) de Lys-C digest, en incubeer gedurende 6 uur bij 37 ° C. Gebruik dezelfde protease concentratie en protease-to-eiwit verhouding voor Lys-C als voor trypsine.

6. Reversed-phase Peptide Extractie

1. Zuur peptiden door toevoeging van trifluorazijnzuur (TFA) tot een eindconcentratie van 0,5% (pH ≈ 2). Bevestig een C18-kolom aan een extractie spruitstuk. Gebruik de hoogst mogelijke debiet voor alle stappen behalve laden en elutie van de peptiden.
2. Natte kolom met 6 ml acetonitril (ACN). Waskolom met 6 ml 80% ACN 0,1% TFA, vervolgens evenwicht met 6 ml 0,1% TFA. Sta niet toe dat dekolom droog komt te staan ​​tussen de stappen.
3. Stop vacuümdruk en 500 ug laden van peptiden op de kolom met een stroomsnelheid van ongeveer 1 ml / min. Zodra peptiden gebonden aan de kolom, herstart vacuüm en was met 6 ml 0,1% TFA, vervolgens met 3 ml citroenzuur buffer (0,09 M citroenzuur, 0,23 M Na ₂ HPO _4, pH 5,5).
   Opmerking: met peptide bedragen codeerbaar maar de C18 bindingscapaciteit moet ten minste tweemaal hoger dan de peptide hoeveelheid monster verlies te voorkomen.

7. On-column Peptide Labeling door Reductieve dimethylering (Redi Labeling)

Voer deze stap onder een chemische kap als waterstof cyanide vrijkomt bij lage concentratie tijdens de etikettering proces.

1. Bereid 12 ml van "lichte" en "zware" Redi buffers om peptide vrije amines methyleren. Licht Redi buffer bestaat uit 0.8% formaldehyde en 0,12 M natriumcyaanboorhydride dragen waterstofatomen in their natuurlijke isotopische distributies in citroenzuur buffer. Zware Redi buffer bestaat uit 0,8% gedeutereerd formaldehyde en 0,12 M gedeutereerd natriumcyaanboorhydride in citroenzuur buffer.
2. Kolom bevattende peptiden Incubeer door 10 ml hetzij lichte of zware Redi buffer om de peptide bevattende kolommen stroomsnelheid van 1 ml / min en herhaal volledige etikettering te waarborgen. Was de kolom met 6 ml 0,1% TFA en vervolgens met 1 ml 0,5% azijnzuur.
3. Stop vacuüm en elueer gemerkte peptiden eerst met 1 ml 40% ACN, 0,5% azijnzuur, vervolgens met 1 ml 80% ACN, 0,5% azijnzuur met een stroomsnelheid van ongeveer 0,5 ml / min. Indien gewenst, het meten van de etikettering efficiëntie van individuele monsters met behulp van massaspectrometrie voor het mengen zware en lichte monsters (zie "Representatieve resultaten"). Meng 01:01 zwaar en licht gemerkt peptide monsters worden gekwantificeerd met behulp van massaspectrometrie.

8. Aparte peptidenmengsel door Basic pH Reversed Phase (BPRP) Chromatography

Eenvoudig pH omgekeerde fase (BPRP) chromatografie om het peptidemengsel te scheiden in verschillende fracties, die onafhankelijk geanalyseerd door LC-MS/MS aan proteoom bereik vergroten.

1. Het peptidemengsel te fractioneren op een kolom C18-HPLC door toepassing van een gradiënt van toenemende ACN concentratie in 10 mM ammoniumbicarbonaat (pH 8). Begin met 5% (v / v) ACN gedurende 5 min, toenemen tot 35% ACN in 60 minuten en vervolgens tot 90% ACN in 1 minuut. Bewaar de 90% ACN gedurende 4 min voor het verminderen van de ACN tot 5% opnieuw equilibreren de kolom 9 minuten. Verzamel 96 fracties van gelijk volume in een 96-well plaat (A1 tot H12). Bewaken van de fractionering met behulp van een UV-detector bij 220 nm terwijl peptiden elueren uit de kolom (10-70 min voor de hier beschreven voorwaarden).
2. Combineer fracties uit putten A1, C1, E1 en G1 (fractie A1), uit bronnen B1, D1, F1 en H1 (fractie B1), uit bronnen A2, C2, E2, G2 (fractie A2) en derhalve voor de overige fracties. Verwijder de solvent gebruik van een vacuüm centrifuge. Resuspendeer peptiden uit fracties A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 en B12 in 130 ui 1 M urea/0.5% TFA en zuiveren met StageTips zoals beschreven in stap 9. Store fracties B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11 en A12 bij -20 º C.

9. Zuiver Peptiden door stop en go Extraction (StageTips)

Bereid C18-StageTip ⁷ microkolommen door de verpakking 200 ul pipet tips met twee C18 schijven met een inwendige diameter (ID) van 1,07 mm. Zet Stage Tips in Eppendorf buizen. Gebruik een microcentrifuge om tips wassen met 130 pl methanol, vervolgens 130 ul 80% ACN, 0,5% azijnzuur. Equilibreer StageTips met 130 ul 0,1% TFA. Transfer peptidemengsel te StageTips en wassen met 130 ul 0,1% TFA, vervolgens 40 ul 0,1% TFA, vervolgens 40 pi 0,5% azijnzuur. Elueer peptiden eerst met 20 ul 40% ACN, 0,5% azijnzuur, vervolgens 20 ul 80% ACN, 0,5% azijnzuur. Combineer eluaten eennd droog door vacuümfiltratie.

10. Microcapillaire LC-MS/MS

1. Los peptiden in 1-5 ul 5% mierenzuur, 5% ACN tot een concentratie van ongeveer 1 ug / ul. Oplossing ~ 1 ug peptiden op een 100 urn x 20 cm C18-omgekeerde fase HPLC kolom met een gradiënt van 6-22% ACN in 0,125% mierenzuur aangebracht op 75 of 100 minuten bij een stroomsnelheid van ~ 300 nl / min.
2. Identificeer peptiden met behulp van een LTQ Orbitrap Velos ¹² of soortgelijke vloeistofchromatografie-massaspectrometrie platform met een massaspectrometer leveren van hoge resolutie en hoge nauwkeurigheid massa. Bedien de massaspectrometer in data-afhankelijke modus met een volledige MS scan (resolutie van 60.000) verworven in de Orbitrap analyzer. Genereer lineaire ion trap MS / MS-spectra voor de 20 meest voorkomende ionen gedetecteerd in de volledige MS spectrum. Stel Automatic Gain Control (AGC) targets tot 1 x 10 ⁶ voor de volledige MS en 2000 voor MS / MS. Stel een maximum ion accumulatie tijden tot 1000 msecvoor MS en 150 msec voor MS / MS. Uitsluiten gefragmenteerd peptide precursorionen van verdere selectie van MS / MS voor 20-60 sec.

11. MS / MS Data Acquisition

Identificeer peptiden door vergelijking van MS / MS spectra RAW een theoretische database een algoritme zoals SEQUEST ⁸ met behulp van deze parameters (tabel 1).

Tabel 1. Peptide Database Zoekparameters.

Algemene parameters	volledig tryptische digestie met maximaal 2 gemiste splitsingen
	25 ppm precursorion tolerantie
	1.0 Da fragmention tolerantie
Statische Wijzigingen	57,02146 Da op cysteïne, carboxyamidomethylation
	28,03130 Da op lysine en peptide N-terminus, licht dimethylering label
Dynamische Wijzigingen	15,99491 Da op methionine, oxidatie
	6,03766 Da op lysine en peptide N-terminus, zware dimethylering label

1. Filter peptiden een 1% fout ontdekt waardering met een methode als het doel-decoy ⁹ aanpak vanuit een database van open reading frames in de huidige en omgekeerde oriëntaties.

12. Peptide Kwantificering

Bereken het gebied van zware en lichte paren van MS1 gewonnen ion chromatogrammen (MS1 piekgebieden) en peptide signaal-ruisverhouding (S / N) verhouding ^10. Omvatten peptide paren alleen wanneer hun gemiddelde signaal-noise, groter dan vijf. Kwantificeer de relatieve abundantie van een peptide in de twee monsters als de verhouding tussen MS1 ​​piekoppervlakten van zware en lichte versie van hetzelfde peptide (MS1 piekoppervlakte-verhouding). Berekenen relatieve abundanties eiwit als de mediaan MS1 ​​piekoppervlak verhouding voor alle peptiden in het proteïne.

Results

We evalueerden de nauwkeurigheid, precisie en reproduceerbaarheid van Redi labeling met Saccharomyces cerevisiae en Clostridium phytofermentans gehele cellysaten. We hebben eerst gekwantificeerd de Redi etikettering efficiëntie van een mix van C. phytofermentans eiwitlysaten uit cellulose (zware gelabeld, H) en glucose (licht label, L) culturen. Wanneer gefilterd om een ​​1% peptide valse ontdekking tarief, dit monster bevatte 11.194 unieke peptide sequenties met een 98% Redi etikettering effi...

Discussion

Een aantal punten maken stabiele isotoop labeling van peptiden met behulp van reductieve dimethylering (Redi etikettering) een aantrekkelijke methode voor kwantitatieve proteomics: goedkoop etikettering reagens (reagentia kost minder dan $ 1 per monster), snelle reactiesnelheid (~ 10 min), de afwezigheid van nevenproducten, hoge reproduceerbaarheid (figuren 3, 4), stabiele reactieproducten, mogelijkheid om een protease te gebruiken en hoge ionisatie-efficiëntie van gelabelde peptiden. Chemische labeling...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trichloorazijnzuur	Sigma-Aldrich	T9159	eiwitprecipitatie
Aceton	Sigma-Aldrich	650501	eiwitprecipitatie
Natriumdodecylsulfaat	Sigma-Aldrich	71736	denatureren, eiwit reduceren
Natriumhydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	denatureren, eiwit reduceren
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43816	denatureren, reduceren, eiwit alkyleren
Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail	Roche	4693124001	denatureren, eiwit reduceren
Iodoaceetamide	Sigma-Aldrich	I6125	eiwit alkyleren
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	opnieuw suspenderen, extraheren, eiwit labelen
Calciumchloride	Sigma-Aldrich	C5670	eiwit opnieuw suspenderen
Lysyl Endoprotease	Wako Chemicals	129-02541	eiwitopsplitsing
Sequencing grade trypsine	Promega	V5111	eiwitopsplitsing
Azijnzuur	Sigma-Aldrich	320099	eiwitopsplitsing
Trifluorazijnzuur	Sigma-Aldrich	299537	Omgekeerde fase peptide extractie
tC18 Sep-Pak C18 cartridges	Waters	WAT054960	Omgekeerde fase peptide extractie
Extractie manifold	Waters	WAT200609	Omgekeerde fase peptide extractie
Acetonitriel	Sigma-Aldrich	14261	diversen
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	“licht” peptide labelen
Cyanoboorhydride	Sigma-Aldrich	71435	“licht” peptide labelen
Gedeutereerd formaldehyde	Sigma-Aldrich	492620	“zwaar” peptide labelen
Natriumcyanoborhydride	CDN isotopes	D-1797	“zwaar” peptide labelen
MES	Sigma-Aldrich	M3671	peptide labelen
C18-HPLC kolom (4,6 x 250 mm, 5 µm deeltjegrootte)	Agilent	770450-902	Omgekeerde fase chromatografie bij basis pH
Mierenzuur	Sigma-Aldrich	399388	diversen
C18 Empore Disks	3M	14-386-3	STAGE tips
Methanol	Sigma-Aldrich	494437	STAGE tips