Kwantitatieve Proteomics behulp Reductieve dimethylering voor stabiele isotopen Labeling

Summary

Stabiele isotoop labeling van peptiden door reductieve dimethylering (Redi etikettering) is een snelle, goedkope strategie voor nauwkeurige massa-spectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomics. Hier laten we een robuuste werkwijze voor de bereiding en analyse van eiwitmengsels met de Redi aanpak die kan worden toegepast op vrijwel elk type monster.

Abstract

Stabiele isotopen van peptiden door reductieve dimethylering (Redi labeling) is een methode om nauwkeurig kwantificeren eiwitexpressie verschillen tussen monsters met behulp van massaspectrometrie. Redi etikettering wordt uitgevoerd met behulp van gewone (licht) of gedeutereerde (zware) vormen van formaldehyde en natriumcyaanboriumhydride twee methylgroepen toevoegen aan elke vrije amine. Hier laten we zien een robuust protocol voor Redi etikettering en kwantitatieve vergelijking van complexe eiwitmengsels. Eiwitmonsters ter vergelijking worden gedigesteerd in peptiden gelabeld ofwel lichte of zware methyl markeringen, gemengd en samen geanalyseerd met LC-MS/MS dragen. Relatieve dichtheden eiwit gekwantificeerd door vergelijking van de ionenchromatogram piekoppervlakten van zware en lichte gemerkte versies van de samenstellende peptide geëxtraheerd uit de volledige MS-spectra. De hier beschreven methode is inclusief monstervoorbereiding met reversed phase vaste-fase-extractie, on-column Redi etikettering van peptiden, peptide fractionering door basische pH reversed-fase (BPRP) chromatografie, en StageTip peptide zuivering. We bespreken de voordelen en beperkingen van Redi etikettering met betrekking tot andere methoden voor een stabiele isotoop oprichting. We belichten nieuwe toepassingen met Redi labeling als een snelle, goedkope en nauwkeurige methode om eiwit abondantie vergelijken in bijna elk soort monster.

Introduction

Het meten van de concentratie verschillen van veel eiwitten tussen complexe monsters is een centrale uitdaging in proteomics. In toenemende mate wordt dit gedaan door het merken van eiwitten in elk monster met verschillende isotopische labels combineren van de monsters en met massaspectrometrie om concentratieverschillen kwantificeren. Verschillende methoden bestaan ​​voor stabiele isotopische labeling van eiwitten en peptiden. ¹⁵ N etikettering ¹ en ² SILAC voeren isotopische labels metabolisch in vivo, terwijl iCAT ^3, iTRAQ ⁴ en vermindering dimethylering ⁵ commentaar stabiele isotoop labels....

Protocol

OPMERKING: Deze methode werd eerder beschreven ^12.

1. Eiwitisolatie

Bereid 1 mg cellulair eiwit door het lyseren van cellen, bij voorkeur door fysische werkwijzen zoals Franse pers, kralen slaan of sonicatie. Vermijd-lysozym-gemedieerde cellysis omdat het enzym massaspectrometrie metingen zullen beschamen.

2. TCA precipitatie van de eiwitten

Voeg 1 volume trichloorazijnzuur (TCA) aan 4 delen eiwit en chill op ijs gedurende 10 minuten om eiwitten neer te slaan. Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en verwijder het supernatant. ....

Results

We evalueerden de nauwkeurigheid, precisie en reproduceerbaarheid van Redi labeling met Saccharomyces cerevisiae en Clostridium phytofermentans gehele cellysaten. We hebben eerst gekwantificeerd de Redi etikettering efficiëntie van een mix van C. phytofermentans eiwitlysaten uit cellulose (zware gelabeld, H) en glucose (licht label, L) culturen. Wanneer gefilterd om een ​​1% peptide valse ontdekking tarief, dit monster bevatte 11.194 unieke peptide sequenties met een 98% Redi etikettering effi.......

Discussion

Een aantal punten maken stabiele isotoop labeling van peptiden met behulp van reductieve dimethylering (Redi etikettering) een aantrekkelijke methode voor kwantitatieve proteomics: goedkoop etikettering reagens (reagentia kost minder dan $ 1 per monster), snelle reactiesnelheid (~ 10 min), de afwezigheid van nevenproducten, hoge reproduceerbaarheid (figuren 3, 4), stabiele reactieproducten, mogelijkheid om een protease te gebruiken en hoge ionisatie-efficiëntie van gelabelde peptiden. Chemische labeling.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	protein precipitation
Acetone	Sigma-Aldrich	650501	protein precipitation
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	71736	denature, reduce protein
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	denature, reduce protein
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43816	denature, reduce, alkylate protein
Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail	Roche	4693124001	denature, reduce protein
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125	alkylate protein
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	resuspend, extract, label protein
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	resuspend protein
Lysyl Endoprotease	Wako Chemicals	129-02541	protein digestion
Sequencing grade trypsin	Promega	V5111	protein digestion
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099	protein digestion
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	299537	Reversed-phase peptide extraction
tC18 Sep-Pak C18 cartridges	Waters	WAT054960	Reversed-phase peptide extraction
Extraction manifold	Waters	WAT200609	Reversed-phase peptide extraction
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	14261	various
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	“light” peptide labeling
Cyanoborohydride	Sigma-Aldrich	71435	“light” peptide labeling
Deuterated formaldehyde	Sigma-Aldrich	492620	“heavy” peptide labeling
Sodium cyanoborodeuteride	CDN isotopes	D-1797	“heavy” peptide labeling
MES	Sigma-Aldrich	M3671	peptide labeling
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size)	Agilent	770450-902	basic pH reversed-phase chromatography
Formic acid	Sigma-Aldrich	399388	various
C18 Empore Disks	3M	14-386-3	STAGE tips
Methanol	Sigma-Aldrich	494437	STAGE tips