Een gewijzigde methode voor Heterotope Mouse Hart transplantatie

Samenvatting

Er wordt een techniek gedemonstreerd voor de microchirurgische procedure voor heterotope transplantatie van harten bij muizen, inclusief vereenvoudigde methoden voor donoroogst en anastomose van de bloedvaten van de ontvanger.

Samenvatting

Muizen worden vaak gebruikt als harttransplantatie donoren en ontvangers in studies van transplantatie-immunologie vanwege het brede scala van transgene muizen en reagentia beschikbaar. Een moeilijkheid wordt gepresenteerd als gevolg van de geringe omvang van het dier en de aanzienlijke technische uitdagingen van de microchirurgie betrokken bij harttransplantatie. In het bijzonder kan een hoge mate van technisch falen vroeg na transplantatie gevolg van de ontvanger dood en postoperatieve complicaties zoals verlamming of niet kloppend hart. Hier wordt de volledige techniek voor heterotope harttransplantatie muis aangetoond met oogsten van de donor hart en de daaropvolgende implantatie in een ontvanger muis. Het donorhart wordt geoogst onmiddellijk na in situ perfusie met koud gehepariniseerde zoutoplossing en doorsnijding van de omhooggaande aorta en longslagader. De ontvanger operatie omvat bereiding van het abdominale aorta en inferior vena cava (IVC), gevolgd doorend-to-side anastomose van de donor aorta van de ontvanger aorta met een draaiende 10-0 microsuture en soortgelijke anastomose van de donor longslagader de ontvanger IVC. Na de operatie wordt het dier geïnjecteerd met 0,6 ml fysiologische zoutoplossing subcutaan en om te herstellen op een 37 ° C verwarming pad. De resultaten van 227 muis harttransplantaties samengevat, met een slagingspercentage van 48 uur van 86,8%. Van de mislukkingen 13,2% binnen 48 uur, 5 (2.2%) ervaren verlamming, 10 (4,4%) hadden een niet-kloppend hart als gevolg van ischemische schade en / of trombose te enten, terwijl 15 (6.6%) stierven binnen 48 uur .

Inleiding

Diermodellen van orgaantransplantatie kan waardevolle informatie verschaffen voor het verbeteren van de behandeling van klinische transplantatie patiënten. Muismodellen zijn vooral nuttig voor het bestuderen van het afweermechanisme van afstoting van getransplanteerde organen of aanvaarding vanwege de brede waaier van genetisch gemodificeerde muizen en reagentia specifiek voor muizen die niet beschikbaar zijn voor andere dierlijke modellen ^1-3 zijn. Een uitdaging met muismodellen van de transplantatie is de geringe omvang van de donoren en ontvangers die aanzienlijke technische vaardigheid om bevredigende resultaten te bereiken vereist.

Een techniek werd voor het eerst beschreven voor heterotopische transplantatie van harten in ratten ⁴ die later werd aangepast voor muis harttransplantatie door Corry et al. ^5. Deze techniek betrokken bereiden van de ontvanger voorafgaand aan de donor bedrijf en geen perfusie van het donorhart, die beide waarschijnlijk overleving van het getransplanteerde hart of t compromishij ontvanger. De procedure is op grote schaal gebruikt als oorspronkelijk beschreven de mechanismen van transplantaat afstoting en tolerantie ^6-8 onderzoeken. Anderen hebben de oorspronkelijke rat harttransplantatie procedure van Ono en Lindsey voor harttransplantaties in muizen ^9,10 aangepast. Meer recent werd een techniek gepubliceerd muis harttransplantatie dat enkele problemen bij de werkwijze Corry et al. ¹¹ overwonnen. Het protocol hier beschreven omvat onze modificaties, gebaseerd op de methode van Mottram et al. ^12, die omvat: in situ perfusie met koud gehepariniseerde zoutoplossing onmiddellijk na thoracotomie en uitvoeren van de donor operatie vóór de ontvanger operatie ontvanger operatie te minimaliseren. Daarnaast maken we gebruik van kleine atraumatic vaartuig klemmen in plaats van 6-0 zijden dassen. Hoewel vaartuig klemmen hebben het nadeel van het nemen van meer ruimte ze makkelijker te controleren dan banden, die niet te strak of los moet wordenen zijn minder eenvoudig te verwijderen dan klemmen. Onze werkwijze gebruikt een lopende hechting voor verblijf anastomose, hoewel de initiële stadia leren alternatief is het verblijf hechtingen aan de proximale en distale hoeken om gelijkheid van hechtingen garanderen en zo doorgankelijkheid van de anastomose.

Protocol

Voor aanvang van de experimenten, te verkrijgen toestemming van Animal Care Ethische Commissie de betrokken instelling voor de geplande experimenten. Handhaven muizen in de overeenstemming met de eisen van uw instelling. Het volgende protocol is goedgekeurd door de Universiteit van Sydney en Royal Prince Alfred Hospital commissies.

Voor aanvang van de operatie, moeten alle instrumenten grondig worden gereinigd en gesteriliseerd door onderdompeling in 80% ethanol. Sommige instellingen bepalen autoclaaf maar dit fijne microchirurgische instrumenten kan schade op de lange termijn. Waar mogelijk gebruik steriel wegwerpmateriaal.

1. Anesthesie

1. Verdoven muis met isofluraan in een afgesloten container plaatsen dan in rugligging op een operationele boord, snel verbinding verdoving neuskegel. Test toereikendheid van de anesthesie door te knijpen de achterste voet te verzekeren dat er geen reflex.
2. Scheer de huid met een chirurgisch mes ensteriliseren met 80% ethanol. Daarnaast kunnen 2% chloorhexidine in 70% isopropylalcohol gebruikt voor huid sterilisatie. Tijdens de inductie van de anesthesie de isofluraan concentratie van 3%, maar beperken deze tot 1-1,5% voor onderhoud. Maak kleine aanpassingen aan deze concentratie aan regelmatige ademhaling en hartslag te behouden. Handhaaf de temperatuur van het dier op een verwarmingselement.

2. Donoroperatie

1. Maak een thoracotomie naar het hart en vaten bloot door het snijden van de borst door beide zijden van de ribbenkast van de rib rand tot aan de oksel, gevolgd door een dwarse snede op het niveau van de xiphisternum een ​​borstwand flap te vormen. Til deze klep omhoog naast het hoofd en speld het aan de operationele bestuur. Scheur hartzakje naar het hart en vaten bloot.
2. Til de onderste holle ader met een tang in de ene hand en met de andere Injecteer 1 ml koud gehepariniseerde zoutoplossing proximaal van hart door de IVC, zet dan een kleine slagader klem op het IVC aan preventiet stroom van perfusieoplossing terug door de naald gat.
3. Met behulp van gaas en een wattenstaafje, trekken het hart naar beneden om de opgaande aorta en de longslagader bloot. Pass een blad van een paar microscissors door het kanaal (dwarse sinus) posterieur van de bundel aorta en longslagader en snijd de aorta en longslagader samen zoveel distaal mogelijk voldoende lengte te hebben voor anastomose.
4. Stropdas en verdeel de IVC, rechter superieure vena cava (SVC), links SVC en longvenen behulp 6-0 zijden draad. Bind het IVC en rechts SVC afzonderlijk plaats dan een enkele draad posterior naar het hart naar links SVC samen omringen met pulmonale aderen en bind het. Oogst het hart van de donor site door distale snijden van de schepen aan de banden, dan opslaan in koude steriele zoutoplossing bij 4 ° C tot transplantatie. Dit resulteert in de dood van de donor door verbloeding.

3. Ontvanger Operation

1. Verdoven van deontvanger zoals hierboven beschreven (paragraaf 1). Scheren zorgvuldig buik om irritatie te voorkomen, maak dan een laparotomie door incisie van schaambeen naar xiphisternum en trek met behulp van paperclips gebogen om retractors vormen. Wikkel de darm in warme steriele zoutoplossing gedrenkt gaas en trekken naar de rechterbovenhoek van de buik.
2. Om de infra-renale aorta en IVC bloot, bevrijden de gebundelde segmenten van de aorta en IVC uit de linker nierslagader en ader aan de iliacale bifurcatie door ze te delen van de lumbale vaartuigen met een cauterisatie-apparaat. Zorg ervoor dat de cauterisatie is op de juiste temperatuur en gebruikt voor voldoende tijd om de uiteinden vat verdelen en af ​​te dichten.
3. Breng een kleine atraumatische klemmen vaartuig naar de aorta en IVC segmenten distaal en proximaal. Een incisie in de voorwand van de aorta door eerst een gat prikken met een 30 G naald; knip een incisie verticaal met microscissors de grootte van de donor aorta passen. Spoel de aorta lumen met gehepariniseerde zoutoplossing om elke bl verwijderenood stolsels.
4. Breng het donorhart aan de ontvanger plaats bedekt met gaas gedrenkt in koude zoutoplossing en plaats aan de rechterkant van de buik. Zorg ervoor dat de donor aorta is gepositioneerd naast de insnijding op de ontvanger aorta en de donor longslagader gepositioneerd naast de ontvanger IVC.
5. Anastomose de donor aorta end-to-side de ontvanger aorta met actief 10-0 nylon hechtingen vanaf het proximale hoek en hechten aan de linkerzijde eerste tot aan de distale hoek, in welk stadium de dier wordt 180 ° gedraaid. Beweeg het donorhart aan de linkerkant van de buik naar de rechterkant van de aorta bloot en blijven hechten door de rechterkant van de aorta van het distale uiteinde naar het proximale uiteinde. Voor het sluiten van de aorta-anastomose, voorzichtig spoelen het lumen met gehepariniseerde zoutoplossing aan een stolsel en lucht te verwijderen.
6. Anastomose de donor pulmonale arterie (PA) end-to-side met de ontvanger IVC. Maak een insnijding vertisch met microscissors in de voorwand van de IVC op een locatie overeenkomstig de slagader anastomose. Anastomose de donor PA ontvanger IVC actief 10-0 nylon hechtingen vanaf het distale uiteinde van de linker wand in het lumen van de IVC. Na het bereiken van het proximale uiteinde, verder hechtingen langs de rechter zijwand tot aan het distale einde aan de anastomose voltooien. Voor het sluiten van de anastomose, voorzichtig spoelen het lumen om eventuele stolsels en lucht te verwijderen.
7. Voor het vrijgeven van het schip klemmen, plaats stukjes Gelfoam rond de anastomose sites, en druk zachtjes met een katoenen applicator totdat hemostase is bereikt. Ten tijde van revascularisatie, laat het distale klem, gevolgd door de proximale klem.
8. Na revascularisatie, gelden warme zoutoplossing bij 37 ° C om de graft extern om het herstel te helpen. De ent begint meestal fibrillatie onmiddellijk en keert spontaan naar sinusritme binnen een paar minuten. Injecteer 0,6 ml warmzoutoplossing subcutaan hydratatie van de ontvanger behouden. Injecteer subcutaan buprenorfine analgesie vóór de operatie te
9. Sluit de abdominale wond met een 5-0 absorbeerbare lopende hechtdraad voor zowel de lagen. Begin met het invullen van de binnenste laag en verder langs de huid.

4. Herstel en Graft Monitoring

1. Injecteer ampicilline voor profylaxe van infectie en plaats de ontvanger op een verwarmingselement bij 37 ° C gedurende herstel. De meeste dieren herstellen snel en worden meestal drinken en eten vaak binnen 3 uur. Als de muis toont tekenen van nood, aandachtig onderzoeken om oorzaak te bepalen. Als er geen duidelijke oorzaak, de behandeling met buprenorfine en de voet volgen. Een dierenarts te raadplegen als de symptomen ernstig of aanhoudend zijn meer dan 8 uur en overwegen euthanasie. Indien nodig, geef voortdurende 12 uurlijkse injecties van buprenorfine tot de symptomen verdwijnen. Als de muis toont tekenen van nood na 8 uur, geven voortgezette 12hourly injecties van buprenorfine tot ze op te lossen. Raadpleeg de dierenarts als de symptomen blijven voor meer dan 48 uur en euthanaseren indien nodig.
2. Monitor graft hartslag door directe abdominale palpatie en noteer de sterkte beat als + + + + voor een gezonde transplantaat + zwakke maatslag door geavanceerde afwijzing en - als niet kloppend door afstoting van het transplantaat te voltooien. Monitor muizen dagelijks gedurende de eerste 10 dagen, vervolgens 3x per week gedurende de duur van het experiment.

Resultaten

Na een eerste training periode werden 227 gevallen van muis heterotope harttransplantatie in onze groep geanalyseerd. Het succes binnen de eerste 24 uur werd 90,3% en na 48 uur was 86,8%. Van de 30 (13,2%) storingen binnen 48 uur, 5 (2.2%) ervaren verlamming en moesten ze worden gedood, 10 (4,4%) hadden een niet-kloppend hart als gevolg van graft ischemie letsel en / of trombose, terwijl 15 (6.6%) stierven binnen 48 uur. Sommige experimentele transplantaat overleving zijn in tabel 1 met verschillende co...

Discussie

Muis harttransplantatie is een uitdagende microchirurgische methode die aanzienlijke chirurgische vaardigheid onder de knie vereist. De meest uitdagende aspect is de kleine diameter van de schepen. Bovendien moet de ontvanger werkingstijd en bloeden beperken. De techniek voor muizen harttransplantatie werd eerst beschreven door Corry et al.. in 1973 en vervolgens door Mottram et al. ^12. Onze wijzigingen omvatten de volgende punten. Ten eerste, onmiddellijke perfusie van het donorhart met kou...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Operatiemicroscoop	Leica, Heerbrugg, Zwitserland	M651	10-25X vergroting
Verdovingsapparaat	Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australië	Vett3	In staat om een mengsel van isofluraange en zuurstof in lucht af te geven
Operatiebord	Hardware winkel of kantoor leverancier		Dicht kurk of kunststof dat in staat is om spelden te houden
Heparine zoutoplossing (5 U/ml, 4 °C)	Pfizer, VS	FW25	In 1 ml spuit met 23 G naald op ijs
Normale zoutoplossing (37 °C)	AstraZeneca Pty Ltd, Australië	4538	In 1 ml spuit met 23 G naald op warm kussen
Hechtdraad 10- nylon, 5-0 Vicryl	Ethicon, Inc. NJ, VS	2870G/J421H
Buprenorfine (0,05 mg/kg in 0,1 ml zoutoplossing)	Reckitt Benckiser, Sydney, Australië		In 1 ml spuit met 23 G naald op ijs
Ampicilline (5 mg/kg in 0,1 ml zoutoplossing)	Aspen, Sydney, Australië		In 1 ml spuit met 23 G naald op ijs
Gel Foam	Pharmacia & Upjohn Co. VS	801289304	In kleine stukjes gesneden
Hoogtemperatuur brandwondapparaat	Medtronic, VS	8444000
Verwarmingskussen/Right Temp	Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790
Microchirurgie instrumenten:	Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.,
Micronaaldhaakjes	Shanghai, China	WT2020
Microschaartjes	"          "	WT1020
Microtang (rechte punt)	"          "	WA3010
Microtang (gebogen punt)	"          "	WA3020
Microklippers (1 paar)	"          "	W40350
Microvatjesongetraumatische klippers (1 paar)	"          "	W40130/W40150