Lineage-herprogrammering van pericyte-afgeleide cellen van het volwassen menselijke hersenen in Induced Neuronen

Samenvatting

Targeting hersen-ingezeten cellen voor directe afstamming-herprogrammering biedt nieuwe perspectieven voor de hersenen reparatie. Hier beschrijven we een protocol hoe culturen verrijkt voor hersen-ingezeten pericytes van de menselijke hersenschors volwassen opstellen en deze om te zetten naar geïnduceerde neuronen door-retrovirus gemedieerde expressie van de transcriptiefactoren Sox2 en Ascl1.

Samenvatting

Directe lijn-herprogrammering van niet-neuronale cellen in geïnduceerde neuronen (INS) kan inzicht geven in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen neurogenese en maken nieuwe strategieën voor in vitro modellen of repareren van de zieke hersenen. Het identificeren van de hersenen-ingezeten niet-neuronale celtypes vatbaar voor directe omzetting in iNs zou kunnen stellen voor de lancering van een dergelijke aanpak in situ, dat wil zeggen binnen het beschadigde hersenweefsel. Hier beschrijven we een protocol ontwikkeld in de poging identificeren cellen afkomstig van de volwassen menselijke hersenen die dit uitgangspunt voldoen. Dit protocol omvat: (1) het kweken van menselijke cellen uit de cerebrale cortex, verkregen uit volwassen menselijke hersenen biopten; (2) het in vitro expansie (ongeveer ter 2-4 weken) en karakterisatie van de cultuur door immunocytochemie en flowcytometrie; (3) de verrijking door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) met anti-PDGF-receptor-β en anti-CD146 antilichamen;(4) de-retrovirus bemiddelde transductie met de neurogene transcriptiefactoren Sox2 en ascl1; (5) en tenslotte de karakterisering van de verkregen pericyte-afgeleide neuronen geïnduceerde (PdiNs) met immunocytochemie (14 dagen tot 8 weken na retrovirale transductie). In dit stadium kan iNs worden gesondeerd voor hun elektrische eigenschappen van patch-clamp opname. Dit protocol verschaft een reproduceerbare werkwijze voor de in vitro lijn omzetting van hersen-resident pericyten in functionele menselijke iNs.

Inleiding

In tegenstelling tot herprogrammering van somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), die op hun beurt zijn begiftigd met een overvloed aan differentiatie potentieel, directe herprogrammering beoogt rechte omzetting van een specifiek celtype in een ander. Met betrekking tot hun toepassing in de context van ziektemodel en potentiële cellen gebaseerde therapieën, zowel herprogrammering benaderingen hebben specifieke voor-en nadelen. Herprogrammeren in iPSCs (i) biedt een vrijwel oneindige bron van cellen; (Ii) maakt genetische manipulatie; (Iii) schenkt met een bijna onbeperkt differentiatie potentieel. Echter grote nadelen van iPSCs brengen het risico van tumorgeniciteit van de ongedifferentieerde cellen (teratomavorming in vivo) en de noodzaak voor ex vivo kweken en worden verplant als deze cellen worden gebruikt voor cellen gebaseerde therapieën. Omgekeerd is direct afstammings-herprogrammering beperkt door de lagere opbrengst van de gewenste cellendie rechtstreeks correleert met het aantal van de doelcellen van de uitgangspopulatie, maar bezit het voordeel dat-lijn geherprogrammeerd cellen blijken geen tumorigene risico vertonen op transplantatie ^1,2; bovendien kan direct herprogrammering ook worden bereikt in situ, dat wil zeggen binnen het orgaan waar deze cellen vereist zou zijn, waardoor de noodzaak van transplantatie voorkomen.

Met dit in het achterhoofd, heeft ons lab de mogelijkheid van-lijn herprogrammeren hersen-ingezeten cellen nagestreefd in iNs als nieuwe benadering in de richting van cel-gebaseerde therapieën van neurodegeneratieve ziekten. Brain gevestigde cellen die mogelijk kunnen worden beschouwd als cellulaire doelwitten voor afstammings-herprogrammering omvatten verschillende macroglia (astrocyten, NG2 cellen en oligodendrocyten), microglia, en microvaatje geassocieerde cellen (endotheelcellen en pericyten). Wij hebben uitgebreid bestudeerd in vitro potentie van astroglia herprogrammering van de cerebrale cortex van de vroege postnatale muizen ^3-5. Op zoek evenzo geschikte cel bronnen voor directe afstamming-herprogrammering in het volwassen menselijk brein, we tegenkwamen een celpopulatie die met succes kan worden geprogrammeerd in de ins en vertonen kenmerken van pericytes. Hier een protocol hoe deze cellen oogsten van volwassen menselijke hersenen biopsieën, uitbreiden en verrijken deze cellen in vitro, en tenslotte succes herprogrammeren een aanzienlijke fractie van deze in vitro geëxpandeerde cellen (in het traject van 25-30%) in beschrijven we INS. Herprogrammering kan door gelijktijdige retrovirus-gemedieerde co-expressie van twee transcriptiefactoren, Sox2 en ascl1. Deze PdiNs bleken het vermogen van repetitieve actiepotentiaal afvuren verwerven en synaptische als doelwitten dienen voor andere neuronen vermelding van hun vermogen integreren in neurale netwerken. Het protocol biedt een eenvoudige procedure voor de isolatie en geslacht omzetting van volwassen menselijke hersenen pericyten in iNs.

Protocol

1. Isolatie en kweken van volwassen menselijke hersencellen

Experimenten met menselijk weefsel moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante overheids-en institutionele regelingen met betrekking tot het gebruik van menselijk materiaal voor onderzoeksdoeleinden. Het huidige protocol is ontwikkeld in overeenstemming met de goedkeuring door de ethische commissie van de Medische Faculteit van de LMU München en schriftelijke toestemming van alle patiënten.

Dit protocol voor het bereiden van culturen van de volwassen mens hersenschors is vastgesteld met behulp van specimen van de patiënten van beide geslachten die lijden aan temporaalkwab epilepsie of andere diepgewortelde niet-traumatische, niet-maligne afwijkingen. De resultaten van de chirurgische kamer uitsluitend uit de toegangsgeul naar de hersenen laesie en daarom weefsel wordt als gezond beschouwd. De leeftijd van de patiënten was 19-70 jaar.

1. Bereid groeimedium door toevoeging van warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum(FCS) naar DMEM hoog glucose met GlutaMAX tot een uiteindelijke concentratie van 20% FCS te verkrijgen. Voeg 5 ml penicilline / streptomycine in totaal 500 ml groeimedium. Voer deze en alle volgende stappen die steriele kweekomstandigheden in een passende laminaire stroming kap.
2. Houd het menselijk brein biopsie volwassen verkregen uit de operatiekamer in Hanks 'gebalanceerde zoutoplossing met _CaCl2 en _MgCl2 (HBSS) medium dat HEPES (10 mM eindconcentratie) op ijs tot verwerking. Start verwerking zo spoedig mogelijk.
3. Om de dissociatie te beginnen in enkele cellen, breng het weefsel in een 65 mm petrischaal en gehakt in kleine stukjes door twee steriele eenmalig gebruik scalpels. Voor enzymatische digestie gebruiken 3-6 ml TrypLE in een 15 ml conische buis en incubeer gedurende 15-30 min bij 37 ° C in een waterbad.
4. Voeg 1 volume voorverwarmd groeimedium dissociatie vergemakkelijken en voorzichtig vermaal de oplossing die weefselstukken en neer door eersteen 5 ml wegwerp pipet, gevolgd door een glazen Pasteur pipet tot homogenisering van de celsuspensie. Typisch enkele resterende stukken weefsel, voornamelijk bestaande uit witte stof in de suspensie blijven.
5. Spin neer op 157 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer de pellet in de juiste hoeveelheid groeimedium (10 ml per ongecoat T75 kolf). Gebruik een T75 kolf gedurende een biopsie van 5-10 mm in grootte en extrapolatie van deze bij grotere exemplaren.
6. Plaats cellen in een 37 ° C incubator met 5% _CO2 en 5% _O2.
7. Vervang de helft van het medium elke 3-4 dagen tot cellen confluentie hebben bereikt. Dit duurt meestal tot twee weken (aangeduid als doorgang 0 [P0]).

2. In vitro Uitbreiding en karakterisering van de volwassen menselijke hersencellen

1. In vitro expansie:
   1. Zuig het kweekmedium en was met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), op kamertemperatuur gehouden temperature, voor het toevoegen van 3 ml TrypLE.
   2. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5-10 min tot de meeste cellen losgemaakt. Tik voorzichtig de kolven om opheffing van de cellen te vergemakkelijken; na toevoeging van 3 volumes kweekmedium, overdracht van de cellen in een 15 ml conische buis en spin neer bij 157 xg gedurende 5 minuten en suspendeer de cellen in de juiste hoeveelheid groeimedium.
   3. Passage de cellen bij een verhouding van 1:03 voor optimale opbrengst van nieuwe T75 celkweek flessen.
      Let op: Wij hebben deze cellen gepasseerd totdat P5 zonder enig teken van verminderde efficiëntie herprogrammering. Terwijl op P0 de cultuur bevat een aanzienlijke fractie van endotheelcellen (zoals beoordeeld door CD34 expressie), op latere passages hun aantal verwaarloosbaar.
2. Karakterisering van volwassen menselijk brein culturen:
   1. Immunocytochemie:
      1. Voor de karakterisering van de cellen, zaden ~ 60.000 cellen op poly-D-lysine-gecoate glazen dekglaasjes in 500 ul vers groei medium in 24-well weefselkweekplaten en incubeer bij 37 ° C met 5% _CO2 en 5% _O2.
      2. Voor immunocytochemische analyse van de gekweekte humane hersencellen verwijdert het medium en was 3x met 1 ml PBS.
      3. Fix cellen door toevoeging van 500 ui 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
      4. Breng de glazen dekglaasjes in een geschikte kleuring bevochtigde kamer en blok met 80 pl PBS dat 3% runderserumalbumine (BSA) en 0,5% Triton X-100 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
      5. Voeg primaire antilichamen verdund in dezelfde oplossing (voor verdunningsfactoren zie tabel specifieke reagentia en apparatuur) en incubeer overnacht bij 4 ° C of 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
         Opmerking: Een aanzienlijk variëren maar fractie van de cellen in deze fase kweken zijn immunoreactief voor bloedplaatjes afkomstige groeifactor receptor β (PDGFRß), cluster van differentiatie 146 (CD146), NG2 chondroïtinesulfaat proteoglycan, en gladde spier actine (SMA), dwz markers kenmerkend microvaatje-geassocieerde pericyten. Slechts een minderheid (<1%) drukken de astroglial markers gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) en S100β. Bovendien, in dit stadium de kweek zonder enige cellen die de neuronale merker βIII-tubuline moet zijn. Gebruik meerdere primaire antilichaam combinaties voor co-etikettering van verschillende markers. Verdere bevestiging van de expressie van gliale, neuronale, endotheliale en pericyte markers kan worden verkregen door reverse transcriptie en kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (niet beschreven in dit protocol).
      6. Na incubatie met de primaire antilichamen Was driemaal met 1 ml PBS en voeg de bijbehorende secundaire antilichamen (in de geschikte verdunningen) de kleuroplossing en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. Was de cellen 3x met PBS. Indien nodig voor montage onder kleuring met DAPI gedurende 5 minuten bij kamertemperatuurtemperatuur.
      7. Gebruik antifading montage medium en analyseren van de dekglaasjes met een epifluorescentiemicroscoop of een confocale microscoop.
   2. Flowcytometrie:
      1. Voor de analyse van het oppervlaktewater marker expressie met behulp van flowcytometrie, groeien cellen tot confluentie in ongecoate T25 of T75 celkweekkolven.
      2. Trek cellen door TrypLE als hiervoor en resuspendeer beschreven kleuroplossing bestaande uit PBS + 0,5% BSA. Per kleurreactie, resuspendeer 100.000-200.000 cellen in 100 ul kleuroplossing. Bereid enkele vlekken reacties per antilichaam gebruikt (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, respectieve isotypecontrole antilichamen).
      3. Add fluorochroom-geconjugeerde antilichamen tegen elk kleuroplossing (verdunningen zie tabel specifieke reagentia en apparatuur) direct in de celsuspensie en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 min in het donker.
      4. Was de cellen drie keer met 500 pi PBS en spin down tussen elkewasstap bij 157 xg gedurende 5 minuten.
      5. Resuspendeer de cel pellet in 0,5-1 ml kleuroplossing en overdracht cellen door een cel zeef (70 micrometer) aan FACS buizen. Bescherm het monster van blootstelling aan licht.
      6. Vortex monsters voorafgaande aan het plaatsen van hen in de FACS instrument.
      7. Om de levende cellen te analyseren en uit te sluiten puin en celaggregaten, gate voor FSC-A en SSC-A. Cel duplets zijn speciaal uit gated door FSC-A en FSC-W. Om de juiste gating voorwaarden voor celoppervlak markeringen poorten met isotype-gematchte controle-antilichaam geconjugeerd aan de respectieve fluorochroom bepalen. Vervolgens bepalen de hoeveelheid antilichaam gebonden cellen.

3. Verrijking voor pericyte-afgeleide cellen door Fluorescentie Activated Cell Sorting

1. Zuiver het pericyte celpopulatie (geresuspendeerd in groeimedium) voor transductie via FACS sortering met een 70 urn mondstuk. Gebruik CD34-APC in combinatie met CD140b-PE en CD146-FITC te selecteren voor pericytes. Sort voor CD34-negatieve, CD140b-en CD146-positieve cellen.
2. Verzamel de gesorteerde cellen in groeimedium en plaat op poly-D-lysine-gecoate glazen dekglaasjes in 24-well weefselkweekplaten en incubeer bij 37 ° C met 5% _CO2 en 5% _O2.
3. 48 uur na het sorteren vervangen het medium met vers groeimedium en uitvoeren transductie zoals beschreven in protocol 4.

4. Retrovirale transductie van pericyte-afgeleide cellen en herprogrammeren in Induced Neuronen

Opmerking: Raadpleeg de lokale richtlijnen voor biologische veiligheid bij het hanteren van retrovirale deeltjes. In Duitsland is het gebruik van de retrovirussen hier werkzaam vereisen bioveiligheidsniveau 2. Voor de productie van retrovirale deeltjes verwijzen naar protocol ^6. Voor retrovirale constructen gebruikt voor herprogrammering, zie Karow et al.. (2012). Retrovirussen waren pseudogetypeerde met VSV-G (vesiculaire stomatitis virus-glycoproteïne) ^5. Voor de productie wordt verwezen naar Gavrilescu et al. ^6.

1. 24 uur voorafgaand aan retrovirale transductie zaad ~ 60.000 cellen op poly-D-lysine-gecoate glazen dekglaasjes in 500 ul vers groeimedium in 24-well weefselkweekplaten en incubeer bij 37 ° C met 5% _CO2 en 5% _O2 .
2. De volgende dag, vervang het groeimedium met 500 ul vers, voorverwarmd groeimedium en voeg 1 pl van de respectievelijke geconcentreerde supernatanten die retrovirale deeltjes (pCAG-IRES-DsRed voor de controle, vooral tijdens vaststelling van het protocol in het lab), pCAG-ascl1 -IRES-DsRed, pCAG-Sox2-IRES-GFP.
3. Een dag later, verwijder het medium dat de virusdeeltjes uit de cellen en voeg 1 ml vers, voorverwarmd B27-differentiatiemedium, bestaande uit 49 ml DMEM hoog glucose met GlutaMAX en 1 ml B27 serumvrij supplement. Handhaaf de cellen in kweek bij 37 ° C in 5% _CO2 en 5% O ₂ 4-8 weken zonder dat het medium repetitieve mediumveranderingen schadelijk worden als INS rijpen.

5. Karakterisering van Induced Neuronen door Immunocytochemie

1. Om de cellulaire identiteit van de getransduceerde cellen te bepalen, in het bijzonder aan de verwerving van een neuronaal fenotype aan te tonen, uit te voeren immuuncytochemie tegen neuronale antigenen zoals BIII-tubuline, MAP2 en NeuN (voor antilichamen en hun respectievelijke verdunningen, zie tabel specifieke reagentia en apparatuur, volgt u dezelfde procedure als aangegeven in 2.2.1).
2. Voor het verbeteren van de rijping van PdiNs, co-cultuur van deze cellen met neuronen afgeleid van E14 muis cerebrale cortex. Daartoe ontleden de cerebrale cortex en dissociëren het weefsel mechanisch met een vuur gepolijste glazen Pasteur pipet. Voeg 10,000-50,000 muizen neuronen aan culturen van-pericyte afgeleide cellen 2-3 weken na transductie met Sox2-en ascl1-codering retroviruses en verder kweken. Getransduceerde cellen kunnen worden onderscheiden van muizen neuronen hun reporter (GFP en DsRed) expressie, hetzij levend epifluorescentie of na immunocytochemie voor GFP en DsRed.
3. Om de vorming van synapsen beoordelen op PdiNs door muizen neuronen, uit te voeren immuuncytochemie tegen vesiculaire neurotransmitter receptoren zoals vesiculaire glutamaat transporter 1 (vGluT1).
4. Probe getransduceerde cellen voor hun elektrische eigenschappen (dwz het vermogen van het genereren van actiepotentialen) en de vaststelling van functionele synapsen door patch-clamp elektrofysiologie. Voor details van de procedure zie Heinrich et al.. (2011).

Resultaten

De eerste resultaten van dit protocol na succes een cultuur van een monster van humane volwassen hersenschors bestaat uit de identificatie van de cellulaire samenstelling van de cultuur. Immunocytochemie voor celtype specifieke eiwitten onthult een hoge mate van heterogeniteit tussen culturen afgeleid van specimen van verschillende patiënten (Figuur 1A). Zoals gekwantificeerd door flow cytometrie er altijd een aanzienlijke fractie van cellen die expressie PDGFRß (gemiddeld ~ 75%, van 30 tot maximaal 99%...

Discussie

Het huidige protocol beschrijft de in vitro uitbreiding en verrijking van-pericyte afgeleide cellen na isolatie van de menselijke hersenschors volwassen en de daaropvolgende omzetting in iNs door-retrovirus gemedieerde expressie van de neurogene transcriptiefactoren Sox2 en Ascl1. Een dergelijk protocol voorziet in een experimenteel in vitro systeem om de lijn-omzetting van hersen-ingezeten cellen in neuronen en mogelijk ook glia bestuderen, met het doel voor ogen om uiteindelijk vertalen deze directe ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
anti-CD140b-PE	BD Biosciences	558821	gebruik 1:100
anti-CD146-FITC	AbD Serotec	MCA2141FT	gebruik 1:100
anti-CD13-FITC	AbD Serotec	MVA1270A488T	gebruik 1:100
anti-CD34-APC	BD Biosciences	560940	gebruik 1:100
anti-PDGFRβ	Cell Signaling	3169S	gebruik 1:200
anti-CD146	Abcam	Ab75769	gebruik 1:400
anti-NG2	Millipore	AB5320	gebruik 1:400
anti-SMA	Sigma-Aldrich	A2547	gebruik 1:400
anti-βIII-tubulin	Sigma-Aldrich	T8660	gebruik 1:400
anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M4403	gebruik 1:200
anti-GFAP	Sigma-Aldrich	G3893	gebruik 1:600
anti-GFP	Aves Labs	GFP 10-20	gebruik 1:1,000
anti-RFP	Chromotek	5F8	gebruik 1:500
anti-S100β	Sigma-Aldrich	S2532	gebruik 1:300
anti-NeuN	Millipore	MAB377	gebruik 1:200
anti-GABA	Sigma-Aldrich	A2052	gebruik 1:500
anti-Calretinin	Millipore	AB5054	gebruik 1:500
anti-vGluT1	SYnaptic SYstems	135511	gebruik 1:1,000
Rat IgG1 isotype control FITC	AbD Serotec	11-4301-81	gebruik 1:100
Rat IgG1 isotype control PE	AbD Serotec	12-4301-81	gebruik 1:100
Rat IgG1 isotype control APC	AbD Serotec	17-4301-81	gebruik 1:100
TrypLE	Invitrogen	12605-010
DMEM, hoge glucose, GlutaMAX	Invitrogen	61965
B27 serum-free supplement	Invitrogen	17504044
foetaal runder serum	Invitrogen	10106-169	voer hitte-inactivatie uit door incubatie bij 56 °C gedurende 30 min
Penicilline-streptomycine	Invitrogen	15140122
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)	Invitrogen	24020-091
Dulbecco's PBS zonder CaCl2 en MgCl2 (D-PBS, 1x)	Invitrogen	14190
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich	P0899
PFA (paraformaldehyde)	Sigma-Aldrich	P1648
Runder serum albumine	Sigma-Aldrich	A9418
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI (4',6-Diamidin-2-fenylindole) dilactaat	Sigma-Aldrich	042M4005
Aqua-Poly/Mount	Polysciences	18606-20
Polypropyleen buisjes met ronde bodem	BD Biosciences	352063
Polystyreen buisjes met ronde bodem en celfilterdop	BD Biosciences	352235
24-well platen	Orange Scientific	5530305
75 cm2 kweekkolven	Greiner Bio-One	658175
25 cm2 kweekkolven	Greiner Bio-One	690175
Weggeef pipetten 10 ml	Sarstedt	86.1254.001
Glazen Pasteur pipetten (150 mm)	Fisherbrand	FB50251
Glazen dekglasjes 12 mm diameter	Menzel	CB00120RA1
Chirurgische wegwerp scalpels	B. Braun	5518083
Weefsel kweek schalen	Greiner Bio-One	633180
Conische buisjes 15 ml	BD Biosciences	352095
Laminaire stroomkast
Centrifuge en draaibare rotor met adapters voor 15 ml en 50 ml buisjes	Hettich Lab Technology	1406
Celsorteerder voor flow cytometry: FACSAria l met FACSDiva software	BD Biosciences
Gebeluchte kweekincubator	Eppendorf Galaxy 170R
Waterbad op 37 °C
FACSFlow buisjesvloeistof	BD Biosciences	342003
Epifluorescentie microscoop BX61	Olympus
Confocale microscoop LSM710	Zeiss