Methodenartikel

Een eenvoudige en snelle protocol voor het meten van neutrale lipiden in algencellen met behulp van fluorescentie

DOI:

10.3791/51441

⸱

30 mei 2014

 ,  ,  , 
1Department of Chemical and Materials Engineering, University of Alberta, 2Department of Chemical and Petroleum Engineering, University of Calgary

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een eenvoudig protocol om de neutrale vetgehalte van algen cellen te bepalen met behulp van een Nile Red kleuring procedure wordt beschreven. Deze tijdbesparende techniek biedt een alternatief voor traditionele-gravimetrische basis lipide kwantificering protocollen. Het is ontworpen voor de specifieke toepassing van controle bioproces prestaties.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Algen worden beschouwd als uitstekende kandidaten voor hernieuwbare energiebronnen, door de natuurlijke lipiden opslag mogelijkheden. Krachtige systemen van algen fermentatieprocessen en screening op nieuwe olierijke stammen vereist een snelle en betrouwbare protocol voor de bepaling van intracellulaire lipidegehalte. Huidige praktijken grotendeels aangewezen op gravimetrische methoden om het oliegehalte te bepalen, technieken ontwikkeld decennia geleden die tijdrovend zijn en grote steekproef volumes vereisen. In dit document, Nile Red, een fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt om de aanwezigheid van lipide organen in tal van soorten organismen identificeren, wordt opgenomen in een eenvoudige, snelle en betrouwbare protocol voor de neutrale lipiden van Auxenochlorella protothecoides, een groene alg. De methode maakt gebruik van ethanol, een relatief mild oplosmiddel, aan de celmembraan voor kleuring en 96 goed micro-plaat monstercapaciteit in fluorescentie-intensiteit metingen toenemen doorlaatbaar. Het ontwerp ised met de specifieke toepassing van het toezicht bioproces prestaties. Eerder gedroogde monsters en levende monsters van een groeiende kweek kan worden gebruikt in de test.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vanwege hun vermogen om lipiden organen opslaan onder bepaalde stresscondities algen hebben veel aandacht in de afgelopen jaren als potentiële duurzame brandstofbron 1,2. Neutrale lipiden kan goed zijn voor meer dan 60% van de cel drooggewicht onder geschikte groeiomstandigheden 3. Toch is de industrie niet over een eenvoudige, schone, snelle en betrouwbare gestandaardiseerd protocol om vetgehalte van algen cellen te kwantificeren om goed te monitoren bioproces prestaties, culturen te analyseren, en het scherm voor nieuwe stammen.

De Bligh-Dyer gravimetrische methode ontwikkelde zo'n 50 jaar geleden blijft een va....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Isolatie van droge biomassa van de algen worden gebruikt als standaarden voor fluorescentie Readings

  1. Verwijder een monster volume van de groeiende algencultuur dat ten minste 200 mg van droge biomassa zal bieden, 400-600 mg de voorkeur.
  2. Centrifugeer monster bij 4 ° C gedurende 10 min bij 10.000 x g. Verwijder het supernatant en was de pellet met een gelijk volume fosfaatbuffer volgens dezelfde pH als groeimedium.
  3. Herhaal stap 1.2 voor een totaal van 3 stappen wassen.
  4. Resuspendeer de pellet in gedeïoniseerd water en breng over naar een vooraf gewogen weeg schaal. Laten drogen bij 50 ° C gedurende 48 uur. OPMERKING: Drogen on....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Representatieve algen cellen gekleurd met Nile Red kleurstof in figuur 1. Delen A en B van figuur 1 tonen afbeeldingen van A. protothecoides gegroeid dan stikstof, wat leidt tot zeer lage intracellulaire lipide accumulatie. In de delen C en D, de monsters van A. protothecoides onder stikstof beperking gekweekt getoond. Onder transmissieverlichting, kan de lipide organen van de cel worden gevisualiseerd.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De algen in de standaardcurve moet dezelfde soort gekweekt onder dezelfde experimentele omstandigheden als die gemeten. Significante veranderingen in de samenstelling van het materiaal, teelttechniek en kleuringsprotocol kan invloed hebben op de intensiteit van de fluorescentie lezen. Hexaanextractie (in de punten 1 en 2 beschreven) werd gebruikt om de neutrale vetgehalte van de monsters die in de standaard curve te bepalen. Voor nauwkeurige fluorescentie-intensiteit metingen moeten alle monsters worden geanalyseerd op .......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen graag de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada bedanken voor het verlenen van financiële steun voor dit project.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Drooggewicht
25 ml wegwerppipettenFisher13-676-10K
PipetbulbFisher13-681-51
40 ml Nalgene Teflon centrifugebuizenFisher05-562-16ATeflon nodig voor hexaan
Weegschalen (polypropyleen)Fisher2-202B
1,5 ml microcentrifugebuizenFisher05-408-129
CentrifugeSorvallRC6plus
Droogoven (Fisher 625D)Fisher13-254-2
OpslagbuisjesFisher0337-4
Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D)Fisher05-40-100
Gravimetrische kwantificering
Porseleinen vijzel (Coorstek)Fisher12-961A
Porseleinen stamper (Coorstek)Fisher12-961-5A
40 ml Centrifugatiebuizen (FEP)Fisher05-562-16AKan ook glazen buizen gebruiken
Pasteur glazen pipettenFisher13-678-20C
Aluminium weegschalenFisher08-732-101
HexaansFisherH292-4
Fluorometrische kwantificering van oliegehalte
Fluorescentie multi-well plate readerThermo Lab SystemsFluoroskan Ascent
Fluorescentie leessoftwareThermo Lab SystemsAscent Software 2.6
COSTAR 96 welp plate met ronde bodemFisher06-443-2
Nile RedSigmaN3013-100MG
Ethanol (alcohol reagent grade)FisherAC65109-0020
Beeldvorming van fluorescerende cellen
Leica DMRXA2 (of gelijkwaardig) microscoopLeicaDMRXA2
MicroscoopglaasjesFisher12-550-15
MicroscoopdekglasjesFisher12-541B
CameraQimagingRetiga Ex
Beeldvorming softwareQimagingQCapture v.1.1.8

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).
  2. National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy. U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Meting van neutrale lipidenfluorescentie assayNile Red kleuringanalyse van algenbiomassaethanol permeabilisatie96 wells plaatlezerspectrophotometrische metingenhexaanextractiekalibratiecurvedetectie van lipidendruppels

Gerelateerde artikelen