Een eenvoudige en snelle protocol voor het meten van neutrale lipiden in algencellen met behulp van fluorescentie

Samenvatting

Een eenvoudig protocol om de neutrale vetgehalte van algen cellen te bepalen met behulp van een Nile Red kleuring procedure wordt beschreven. Deze tijdbesparende techniek biedt een alternatief voor traditionele-gravimetrische basis lipide kwantificering protocollen. Het is ontworpen voor de specifieke toepassing van controle bioproces prestaties.

Samenvatting

Algen worden beschouwd als uitstekende kandidaten voor hernieuwbare energiebronnen, door de natuurlijke lipiden opslag mogelijkheden. Krachtige systemen van algen fermentatieprocessen en screening op nieuwe olierijke stammen vereist een snelle en betrouwbare protocol voor de bepaling van intracellulaire lipidegehalte. Huidige praktijken grotendeels aangewezen op gravimetrische methoden om het oliegehalte te bepalen, technieken ontwikkeld decennia geleden die tijdrovend zijn en grote steekproef volumes vereisen. In dit document, Nile Red, een fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt om de aanwezigheid van lipide organen in tal van soorten organismen identificeren, wordt opgenomen in een eenvoudige, snelle en betrouwbare protocol voor de neutrale lipiden van Auxenochlorella protothecoides, een groene alg. De methode maakt gebruik van ethanol, een relatief mild oplosmiddel, aan de celmembraan voor kleuring en 96 goed micro-plaat monstercapaciteit in fluorescentie-intensiteit metingen toenemen doorlaatbaar. Het ontwerp ised met de specifieke toepassing van het toezicht bioproces prestaties. Eerder gedroogde monsters en levende monsters van een groeiende kweek kan worden gebruikt in de test.

Inleiding

Vanwege hun vermogen om lipiden organen opslaan onder bepaalde stresscondities algen hebben veel aandacht in de afgelopen jaren als potentiële duurzame brandstofbron ^1,2. Neutrale lipiden kan goed zijn voor meer dan 60% van de cel drooggewicht onder geschikte groeiomstandigheden ^3. Toch is de industrie niet over een eenvoudige, schone, snelle en betrouwbare gestandaardiseerd protocol om vetgehalte van algen cellen te kwantificeren om goed te monitoren bioproces prestaties, culturen te analyseren, en het scherm voor nieuwe stammen.

De Bligh-Dyer gravimetrische methode ontwikkelde zo'n 50 jaar geleden blijft een van de meest voorkomende technieken die vandaag de dag ^4,5 gebruikt. Hoewel deze procedure is eenvoudig, betrouwbaar en eenvoudig uit te voeren, is tijdrovend, vereist grote monstervolumes, en maakt gebruik van toxische oplosmiddelen. Het is niet praktisch voor het analyseren van vele samples van een fermentatie run of screening voor nieuwe olie-rijke stammen. Andere methoden bEEN-ontwikkeld, maar meestal vereisen geavanceerde apparatuur en zijn niet gestandaardiseerd ^6.

Een alternatief dat heeft vergaard een grote belangstelling is de Nijl Rode vlek. Nile Red, een kleurstof die fluoresceert bij voorkeur in niet-polaire omgevingen is gebruikt om lipide organen in verschillende organismen, waaronder nematoden ^7, gist ^{8, 9} bacteriën en algen ^10-19 identificeren of kwantificeren. Initial technieken met Nile Red waren meestal kwalitatieve of semi-kwantitatieve, het combineren van de vlek met single-cuvette spectrofotometrie of flowcytometrie. Bovendien zijn sommige soorten algen zoals groene algen dikke celputjes die meestal ondoorlaatbaar kleurstof, die het bereik van de techniek ¹⁰ beperkt.

Recente verbeteringen aan de Nijl Rode kleuringsmethode gemeld dat de aanvankelijke tekortkomingen van het protocol ^10,11 omzeilen. Kleuring van de cellen in de aanwezigheid van een carrier oplosmiddel zoals DMSO ¹⁰ of ethanol ^10,11 linearizes de relatie tussen oliegehalte en absorptie, waardoor betrouwbare kwantitatieve metingen. Het oplosmiddel helpt permeabilize het celmembraan, zodat de Nijl Rode moleculen kan passeren. Daarnaast is het opnemen van een spectrofotometer met micro-plaat leesmogelijkheid zorgt voor een hoge doorvoersnelheid protocollen geschikt voor kwantitatieve analyse.

In dit artikel gedetailleerd een eenvoudige werkwijze voor het meten oliegehalte van algen cellen door kleuring culturen Nijl Rood in aanwezigheid van ethanol, een mild oplosmiddel. Om zo goed mogelijk rekening te houden achtergrondruis in de metingen wordt een standaardcurve correleren fluorescentie intensiteit oliegehalte ontwikkeld met algen bekende oliesamenstelling. De methode is een bewerking van eerder gepubliceerde protocollen ^10,11. Door een 96-putjes spectrofotometer, men in staat om dezelfde hoeveelheid te analyseren in een uur that zou dagen duren om te controleren door gravimetrische methoden. Bovendien, door het kalibreren met behulp van representatieve monsters van de gewenste algensoorten deze methode levert relatief nauwkeurige metingen die direct interpreteerbaar. Er bestaan ​​vele protocollen, waarin de methoden van kleuring algen met Nile Red geoptimaliseerd voor verschillende stammen en toepassingen; het protocol hier gepresenteerde werd oorspronkelijk ontwikkeld door de la Hoz Siegler et al.. ¹¹ voor Auxenochlorella protothecoides, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus en Scenedesmus obliquus, hoewel het waarschijnlijk is geschikt voor veel meer soorten en klassen. Het is ontworpen met de specifieke toepassing van het toezicht bioprocess prestaties en het werkt even goed voor eerder gedroogde monsters en natte monsters van een groeiende cultuur.

Protocol

1. Isolatie van droge biomassa van de algen worden gebruikt als standaarden voor fluorescentie Readings

1. Verwijder een monster volume van de groeiende algencultuur dat ten minste 200 mg van droge biomassa zal bieden, 400-600 mg de voorkeur.
2. Centrifugeer monster bij 4 ° C gedurende 10 min bij 10.000 x g. Verwijder het supernatant en was de pellet met een gelijk volume fosfaatbuffer volgens dezelfde pH als groeimedium.
3. Herhaal stap 1.2 voor een totaal van 3 stappen wassen.
4. Resuspendeer de pellet in gedeïoniseerd water en breng over naar een vooraf gewogen weeg schaal. Laten drogen bij 50 ° C gedurende 48 uur. OPMERKING: Drogen onder vacuüm zal droogtijd afnemen en drogen van de cultuur bij temperaturen boven 50 ° C kan resuspensie bemoeilijken.
5. WINKEL algenculturen gedroogd bij kamertemperatuur voor toekomstig gebruik.

2. Gravimetrische Kwantificering van neutrale lipiden door hexaanextractie (Aangepast van Bligh en Dyer ⁴⁾

1. Meet ongeveer 50 mg van droge biomassa van de algen in een weeg schaal. OPMERKING: Missen variërend 40-80 mg kan zonder verlies van reproduceerbaarheid worden gebruikt.
2. Breng de biomassa naar een mortier pre-gewassen met hexaan. Indien nodig, was het wegen schaal met een kleine hoeveelheid (1 ml) hexaan Met een Pasteur-pipet om de biomassa volledig overdragen aan de mortel. OPMERKING: Hexaan is een zeer vluchtige en giftige stof. Het moet in de zuurkast met de juiste beschermende kleding worden behandeld.
3. Maal de biomassa van de algen gedurende 5 minuten met behulp van een stamper. Begin met zachte slijpen en langzaam de intensiteit verhoogt. Maal de biomassa in een fijne en gladde pasta in de periode van 5 minuten. Als overmaat hexaan wordt gebruikt bij het overbrengen van de biomassa naar de mortel, het het beste om te wachten op de hexaan verdampen voordat slijpen.
4. Voeg enkele ml hexaan om de mortel en meng de verkregen suspensie met de stamper totdat het wordt gehomogeniseerd. Zorg ervoor dat alle celbrokstukken gehandeld op de muren van de morteer zijn gratis klopte en opgehangen in de vloeistof.
5. Breng de hexaan-celmassa mengsel in een centrifugebuis. OPMERKING: De centrifugebuis moet ofwel glas of een geschikt polymeer verenigbaar met hexaan zoals Teflon zijn.
6. Herhaal de stappen 2.4 en 2.5 totdat alle biomassa is overgedragen aan de centrifugebuis (3-5x).
7. Centrifugeer het monster bij 4 ° C gedurende 20 min bij 10.000 x g.
8. Pipet de bovenstaande vloeistof voorzichtig in een vooraf gewogen metalen wegen schotel. Bewaren in de zuurkast.
9. Voer een ^2e hexaan extractie door toevoeging van 3 ml hexaan om de pellet en vortexen krachtig gedurende 1 minuut.
10. Herhaal de stappen 2.7 en 2.8. Voer indien nodig de monsters gedurende 30 minuten in de centrifuge tijdens de tweede extractie, zodat alle celdebrie volledig afwikkelt. Bepaal de massa van olie gravimetrisch gewonnen na hexaan volledig is verdampt.

3. Fluorometrische Kwantificering van neutrale lipiden gebruik Nile Red (zo VERSLAted door de la Hoz Siegler et al.. ¹¹⁾

OPMERKING: alleen 10 gl van een algen suspensie bij 5 g / L is nodig voor de fluorescentie lezen. Algemeen isolatie van droge biomassa algen van 1.5 ml kweekbouillon is meer dan voldoende. Ook kan de lichtsterkte van de lamp in de spectrofotometer na verloop van tijd. Aanbevolen normen omvatten in elk experiment zodat variaties in het instrument geen onnodige fout aan de metingen.

1. Bereid een Nile Red oplossing met een concentratie van 10 ug / ml opgelost in alcohol reagenskwaliteit ethanol. Bewaar deze oplossing in het donker bij 4 ° C.
2. Bereid een 30% (v / v) ethanol oplossing in gedeïoniseerd water en bewaar bij 4 ° C.
3. Bereid alle algen monsters op hetzelfde biomassaconcentratie (5 g / L wordt aanbevolen) en op dezelfde wijze als de normen die in de meting. Doe dit door een opschorting vooraf gedroogde monsters in de juiste hoeveelheidfosfaatbuffer (0,6 g / L kaliumfosfaat dibasisch, 1,4 g / l monobasisch kaliumfosfaat), en aanpassingen van de concentratie van een groeiende algen kweek tot 5 g / L met fosfaatbuffer na het meten van de troebelheid. OPMERKING: metingen uitgevoerd op levende algenculturen zullen vaak groter foutenbronnen bij deze afhankelijk van de precisie van de troebelheid kalibratiecurve. Resuspenderen gedroogde monsters kan het gebruik van een homogenisator volledig dispergeren van de biomassa nodig.
4. Voor elk monster, meng 80 pl van 30% ethanol-oplossing, 10 ul van de Nijl Rode oplossing en 10 gl algen suspensie in een enkel putje van een 96-wells plaat. Om goed rekening te houden met de variabiliteit van de fluorescentie meting uitvoeren 5 herhalingen van elk monster.
5. Voer een twee punts kalibratie curve met normen eerder bereid om rekening te houden voor de dag-tot-dag variaties in het instrument en voorbereiding. Bereid de normen voor fluorescentie meting met behulp van de same procedure als de monsters. OPMERKING: algemeen twee punten voldoende herkalibratie van het instrument kunnen drie punten worden uitgevoerd om lineariteit verifiëren.
6. Voer de fluorescentiemetingen in een multi-put plaatlezer spectrofotometer. De volgende condities werden gevonden om de meest consistente resultaten ¹¹ opleveren:
   1. Schudden bij 1200 rpm, baan 3 mm, voor 30 sec.
   2. Incubeer bij 40 ° C gedurende 10 minuten.
   3. Schudden bij 1200 rpm, baan 3 mm, voor 30 sec.
   4. Record fluorescentie, excitatie bij 530 nm, emissie bij 604 nm.
7. Zet de fluorescentiemetingen olie-inhoud met de resultaten van de interne standaarden.

4. Fluorescentiemicroscopie Techniek

OPMERKING: De kleuringsprotocol beschreven in hoofdstuk 3 is ontworpen voor kwantitatieve analyse, maar het kan ook nuttig zijn om visuele representaties van vlek-gebaseerde technieken voor educatieve en illustratieve pu zijnrposes. Om beelden van het monster fluorescentie een produceren vereist een optische microscoop met traditionele transmissie en extra epifluorescentie verlichting bronnen. Excitatie en emissie licht filters in de 530 nm (groen) en 604 nm (rood) bereik, respectievelijk, die nodig zijn voor de Nijl Rode vlek evenals een microscoop gemonteerde camera met bijbehorende software. De in deze studie aangetoond (figuur 1) beelden werden verkregen met behulp van een helder veld microscoop uitgerust met een camera en Monochrome naar RGB converter unit. De procedure voor het produceren van Nile Red fluorescentiebeelden gebruik van deze tools wordt hieronder beschreven:

1. Bereid een cultuur monster met de Nijl Rode vlek volgens paragraaf 3 van het protocol. OPMERKING: een monster in de 5 g / L concentratiegebied produceert slides van adequate celdichtheid zonder overbevolking.
2. Na het voltooien van stap 3.6 van de kleuringsprotocol Bereid een microscoopglaasje van het verwerkte monster volgens standaard laboratoriumprocedures.
3. Te beginnen met de microscoop in de transmissie mode, laadt de bereide dia in de microscoop, en zoek de cellen op de gewenste vergroting (de afbeeldingen in dit artikel zijn overgenomen met de 100X doelstelling).
4. Zodra gericht, schakelt de microscoop van transmissie naar epifluorescentie verlichting mode. De lichtbron moet nu rechtstreeks uit de objectieflens (dit kan visueel worden bevestigd door het observeren van de ruimte tussen de slede en de objectieflens).
5. Steek een groene excitatiefilter in de lichtbron en een rode emissie filter in de observatie lichtpad; de fluorescentie van de gekleurde cellen moet nu direct zichtbaar door het oculair.
6. Schakel de microscoop observatie-modus van het oculair van de camera gemonteerd en gebruik viewing software om een ​​beeld van de fluorescerende cellen vast te leggen. Afhankelijk van de gevoeligheid van de camera, kan het monster niet in eerste instantie weergegeven in het voorbeeldvenster (dwz het scherm zalzwart zijn); om dit te verhelpen, past u de belichtingstijd en de winst van de camera tot een niveau waarop de cellen zichtbaar zijn. Specifieke instellingen zal variëren met instrumenten, apparatuur en celtypes.

Resultaten

Representatieve algen cellen gekleurd met Nile Red kleurstof in figuur 1. Delen A en B van figuur 1 tonen afbeeldingen van A. protothecoides gegroeid dan stikstof, wat leidt tot zeer lage intracellulaire lipide accumulatie. In de delen C en D, de monsters van A. protothecoides onder stikstof beperking gekweekt getoond. Onder transmissieverlichting, kan de lipide organen van de cel worden gevisualiseerd...

Discussie

De algen in de standaardcurve moet dezelfde soort gekweekt onder dezelfde experimentele omstandigheden als die gemeten. Significante veranderingen in de samenstelling van het materiaal, teelttechniek en kleuringsprotocol kan invloed hebben op de intensiteit van de fluorescentie lezen. Hexaanextractie (in de punten 1 en 2 beschreven) werd gebruikt om de neutrale vetgehalte van de monsters die in de standaard curve te bepalen. Voor nauwkeurige fluorescentie-intensiteit metingen moeten alle monsters worden geanalyseerd op ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Drooggewicht
25 ml wegwerppipetten	Fisher	13-676-10K
Pipetbulb	Fisher	13-681-51
40 ml Nalgene Teflon centrifugebuizen	Fisher	05-562-16A	Teflon nodig voor hexaan
Weegschalen (polypropyleen)	Fisher	2-202B
1,5 ml microcentrifugebuizen	Fisher	05-408-129
Centrifuge	Sorvall	RC6plus
Droogoven (Fisher 625D)	Fisher	13-254-2
Opslagbuisjes	Fisher	0337-4
Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D)	Fisher	05-40-100
Gravimetrische kwantificering
Porseleinen vijzel (Coorstek)	Fisher	12-961A
Porseleinen stamper (Coorstek)	Fisher	12-961-5A
40 ml Centrifugatiebuizen (FEP)	Fisher	05-562-16A	Kan ook glazen buizen gebruiken
Pasteur glazen pipetten	Fisher	13-678-20C
Aluminium weegschalen	Fisher	08-732-101
Hexaans	Fisher	H292-4
Fluorometrische kwantificering van oliegehalte
Fluorescentie multi-well plate reader	Thermo Lab Systems	Fluoroskan Ascent
Fluorescentie leessoftware	Thermo Lab Systems	Ascent Software 2.6
COSTAR 96 welp plate met ronde bodem	Fisher	06-443-2
Nile Red	Sigma	N3013-100MG
Ethanol (alcohol reagent grade)	Fisher	AC65109-0020
Beeldvorming van fluorescerende cellen
Leica DMRXA2 (of gelijkwaardig) microscoop	Leica	DMRXA2
Microscoopglaasjes	Fisher	12-550-15
Microscoopdekglasjes	Fisher	12-541B
Camera	Qimaging	Retiga Ex
Beeldvorming software	Qimaging	QCapture v.1.1.8