Visualisatie van endosoom Dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale Fluorescentie Imaging

Samenvatting

Vierdimensionale (4D) beeldvorming wordt gebruikt om het gedrag en interacties tussen twee soorten endosomen in levende gewervelde zenuwuiteinden bestuderen. Beweging van deze kleine structuren wordt gekenmerkt in drie dimensies, waardoor de bevestiging van evenementen zoals endosome fusie en de exocytose.

Samenvatting

Vier-dimensionale (4D) lichte afdruk is gebruikt om het gedrag van kleine structuren te bestuderen binnen motorische zenuwuiteinden van de dunne transversus abdominis van de kousenband slang. Ruwe data omvat time-lapse sequenties van 3D z-stacks. Elke stapel bevat 4-20 beelden die met epifluorescentie optiek bij focale vliegtuigen gescheiden door 400-1,500 nm. Stappen in de overname van het beeld stacks, zoals aanpassing van de focus, schakelen van excitatiegolflengten, en de werking van de digitale camera, zijn geautomatiseerde zo veel mogelijk op de foto te maximaliseren en minimaliseren van weefselschade door blootstelling aan licht. Na verwerving wordt een reeks afbeeldingsstapels deconvolved ruimtelijke resolutie te verbeteren, omgezet in het gewenste 3D-formaat, en gebruikt om een ​​4D "film" die geschikt is voor verschillende computergestuurde analyse, afhankelijk van de gevraagde experimentele gegevens. Een toepassing is studie van het dynamisch gedrag van twee klassen van endosomes gevonden in zenuwuiteinden-macroendosomes (MES)en zure endosomen (AE) die afmetingen (200-800 nm voor beide) op of nabij de diffractie limiet. Toegang tot de 3D-informatie op elk tijdstip biedt een aantal voordelen ten opzichte van conventionele time-lapse imaging. In het bijzonder kunnen de grootte en de snelheid van beweging van structuren gekwantificeerd tijd zonder verlies van scherpstelling. Voorbeelden van gegevens van 4D beeldvorming blijkt dat ME's benaderen de plasmamembraan en verdwijnen, wat suggereert dat ze in plaats van zijn exocytosed gewoon verticaal verplaatsen uit de buurt van een enkel vlak van focus. Ook geopenbaard is putatieve fusie van MES en AEs door visualisatie van overlap tussen de twee kleurstof bevattende structuren gezien in elk drie orthogonale projecties.

Inleiding

Time-lapse beeldvorming van levend weefsel biedt visuele toegang tot dynamische structuur-functie relaties die niet kunnen worden gewaardeerd in vaste of leven voorbereidingen afgebeeld op een enkel punt in de tijd. Vaak echter het nadeel van toegang tot temporele informatie een afname van optische resolutie. Hoge numerieke apertuur olie-immersie doelstellingen zijn onpraktisch in levend weefsel vanwege hun smalle bandbreedte van focus, waardoor het water onderdompeling of droog doelstellingen als de enige alternatieven. Bovendien kan de verhoogde resolutie geboden door confocale optica niet worden gebruikt in bepaalde levende preparaten vanwege fototoxiciteit van de relatief hoge niveaus van verlichting vereist ^1,2. Tot slot, terwijl een aantal real-time of time-lapse-optische technieken beschikbaar die bieden verbeterde resolutie, wordt hun toepasbaarheid beperkt tot preparaten structuren van belang kan worden gepositioneerd binnen een paar honderd nanometer van de doelstelling ^1. De werkwijze beschrevenmaakt gebruik van relatief goedkope apparatuur, is veelzijdig, maar biedt een betere resolutie vergelijking met de meer algemeen gebruikte time-lapse technieken. Het is bedoeld voor gebruik in elk laboratorium en beeldvormingsapparatuur.

De werkwijze gebruikt conventionele epifluorescentie microscopie, gecombineerd met een gevoelige digitale camera en hardware waarmee snel reeksen afbeeldingen ophalen op iets verschillende beeldvlakken (z-stacks). Elke z-stack wordt digitaal deconvolved de resolutie te verhogen. Een kenmerk van 3D time-lapse (4D) beeldvorming is nauwkeurig volgen van bewegende organellen of andere structuren. Wanneer goed ingesteld, hoeft afgebeeld structuren niet uit te gaan van de focus en beweging in drie richtingen kan worden waargenomen en gekwantificeerd. Dus het is onmogelijk voor een gebrandschilderd structuur te verdwijnen over een of meer time-lapse frames alleen door drijven boven of onder een smalle focal plane. De methode dient ook als een gevoelig instrument voor de beoordeling van de interacties en mogelijke funing van kleine structuren. Conventionele epifluorescentie of confocale beelden van de structuren in de buurt van de diffractie limiet (een paar honderd nm) niet bevestigen fusie ook al samengevoegd beelden tonen overlap van hun respectievelijke labels ^3. Fusie wordt voorgesteld, maar blijft het mogelijk dat de objecten horizontaal of verticaal zijn gescheiden door een afstand die onder de diffractie limiet. Drie of vier-dimensionale beeldvorming, daarentegen, maakt het bekijken van de objecten in elke van de drie orthogonale richtingen. Het uiterlijk van de fusie in alle drie weergaven verhoogt het niveau van zekerheid. En, in sommige levende preparaten, gericht of Brownse beweging van vermoedelijk gesmolten voorwerpen bewijst eens te meer wanneer beide labels gaan samen in de tijd. Natuurlijk, toen in de buurt van de diffractie limiet van het niveau van zekerheid in het onderscheiden structuren van de achtergrond, of waaruit blijkt dat zij twee kleurstoffen (fusie) bevatten, is niet absoluut. Eventueel gespecialiseerde technieken zoals fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET)^4, zijn meer geschikt.

Protocol

1. Vlekken op de voorbereiding met Supravital Kleurstoffen

1. Voor de kousenbandslang dissectie protocol zie Stewart et al.. ⁵ en Teng et al.. ⁶ Reptilian weefsel overblijft fysiologische voor langere tijd, en met minder bacteriële besmetting, bij bewaring bij lage temperaturen (zie hieronder). Zoogdierweefsel wordt gewoonlijk gehandhaafd bij kamertemperatuur of hoger.
2. Voor lysosomale vitale kleurstof vlekken, los de kleurstof in koude reptielen Ringers-oplossing 1:5000 (0,2 uM). Incubeer bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Was enkele malen met koud Ringers. Beeld zo snel mogelijk.
3. Voor FM1-43 kleuring met behulp van KCl stimulatie, verdunnen de kleurstof in high-KCl Ringers 1:500 (7 pm). Incubeer bij 4 ° C gedurende 30-60 seconden maximaal. Was snel drie keer met koud Ringers, ~ 1 min / spoelen. Beeld zo snel mogelijk.
4. Voor FM1-43 kleuring met behulp van hypertone (sucrose) stimulatie, verdunnen de kleurstof in 0,5 M sucrose Ringers als hierboven. Incubeer bij 4 & #176, C gedurende 2-5 minuten. Was zoals in stap 1.3 hierboven met koud Ringers. Beeld zo snel mogelijk.
5. Voor FM1-43 kleuring via elektrische stimulering, zie Teng et al.. ⁶ kort wordt de bereiding geplaatst op een schotel met fysiologische zoutoplossing en de kleurstof. De zenuw wordt gestimuleerd met een voorgeprogrammeerde trein van 200 psec rechthoekige pulsen (~ 7 V, 30 Hz, 18 psec). Was zoals in stap 1.3 hierboven met koud Ringers. Beeld zo snel mogelijk.

2. Configureer de Preparation for Imaging

1. Richt de bereiding zodat structuren plaats zo dicht mogelijk bij het microscoopobjectief.
2. Als een omgekeerde microscoop wordt gebruikt, maken gebruik van een kamer waarvan de bodem is voorzien van een dunne ronde dekglas. Normaal gesproken moet de beeldvorming kamer een dunne roestvrij stalen bodem met een diameter van 25 mm # 1 dikte glazen afdekplaat slip in het midden hebben. Als een rechtopstaande microscoop wordt gebruikt, wordt een onderste dekglaasje niet vereist maar is handigom beeldvorming te kunnen met doorvallend licht (bijv. differentieel interferentie contrast, DIC) met het model te oriënteren en te lokaliseren objecten van belang.
3. Kies een geschikte doelstelling om de hoogst mogelijke resolutie 3D te verkrijgen. Er zijn afwegingen tussen numerieke apertuur (NA), werkafstand, vergroting, en het type lens (droog, water-en olie-immersie). Voor dunne preparaten zoals weefsel culturen, olie doelstellingen zijn het beste. Met behulp van een microscoop rechtop, drijven een dekglas op het waterbad, en gebruik immersie olie tussen de bovenkant van het deksel slip en de doelstelling.
4. Als deconvolutie software wordt gebruikt, kan de verkoper vooraf bepaalde puntspreidingsfuncties (PSF's) voor bepaalde doelen. Indien dergelijke informatie wordt verstrekt, of als een niet-ondersteunde doel wordt gekozen, bepalen de PSF door beeldvorming fluorescerende microdots of soortgelijke buigingsbegrensd objecten ^7,8.

3. Bepaal de gewenste scherptediepte en Aantal ImaGES Gewenste per Time-lapse Frame

1. Selecteer de totale diepte van het veld, zodat het verplaatsen of interactie structuren van belang niet verdwijnen of uit te gaan van de focus als ze in de z-richting te verplaatsen. De z-veld moet iets groter zijn dan de verticale afmeting van de cel of proces wordt afgebeeld. Voor gewervelde motorklemmen, 15-20 micrometer is typisch.
2. Bereken de z-as stap nodig voor elke toename van de focus. Resolutie langs de z-as varieert afhankelijk van eigenschappen van het doel; het is ongeveer een vierde van het xy-vlak resolutie. Als een confocale beeldvorming of deconvolutie software wordt gebruikt, is z-as resolutie verbeterd. Verbeter de uiteindelijke resolutie van opzettelijke oversampling in de z-richting ^5, maar zie ook stap 3.3 hieronder. Een typische stapgrootte is in het gebied van 400-1,500 nm voor 40-100X doelstellingen. Licht moet worden geblindeerd uit elk beeld z-stap tussen.
3. Selecteer het aantal beelden per z-stack, namelijk de gewenste scherptediepte verdeeldde stapgrootte. Tijd om een ​​typisch z-stack compleet is 1-10 sec. Snel bewegende objecten (100 nm / sec) kan verschijnen wazig in een 3D-beeld stapel omdat elk beeldvlak komt overeen met een iets ander tijdstip. Ook, elke extra afbeelding bijdraagt ​​aan photobleaching en mogelijke fototoxiciteit (zie Discussie). Als beide situaties betrekking heeft, kies dan een grotere z-stap naar minder beelden per stack te verzamelen. Compenseer later met behulp van beeld interpolatie software (stap 6.3 hieronder).

4. Selecteer de Time-lapse Frame Rate

Kies proefondervindelijk een tarief dat is net voldoende om vlot met de tijd verandert, zoals beweging, interacties of fusie gebeurtenissen ⁹ lossen. Onder bemonstering kan bewegende voorwerpen (steekproeffouten) produceren, terwijl oversampling onnodig verhoogt blootstelling aan licht. Verzamel ofwel een enkele lange sequentie of meerdere herhaalde sequenties van hetzelfde preparaat, elk met een betrekkelijk kleine totale tijdsinterval ( bijv. 10 keer punten x 30 sec interval = 5 min). Indien mogelijk, bekijk de voorbereiding met doorlopende epifluorescentie verlichting tot ruwweg schatting beweging snelheden, waaronder drift van de gehele voorbereiding indien aanwezig.

5. Voltooi alle Live-Imaging voor een preparaat

Reptilian voorbereidingen doorgaans robuuste blijven ~ 1-2 uur, langer indien gekoeld.

6. Analyseren Volgens gewenste toepassing

1. Bewaar alle ruwe data bestanden. Hoewel digitale opslag is meestal geen probleem, verwerkingstijd significant zelfs bij snelle computers of werkstations. Om deze reden, bijsnijden in een regio van belang [ROI]. Verzekeren dat de hele regio van belang is in de bijgesneden venster tijdens het hele verloop.
2. Deconvolutie beeld stapels met behulp van de juiste software en de juiste puntspreidingsfunctie. Bevestigen die resolutie wordt verbeterd en dat er geen artefact is gegenereerd door dedeconvolutie algoritme. Figuur 3 toont bijvoorbeeld afbeeldingen.
3. Gebruik een interpolatie algoritme om z-as schijnbare resolutie uit te breiden. Een 6X uitbreiding van een werkelijke beeld 1,5 urn vliegtuig scheiding een schijnbare 0,25 micrometer scheiding wordt gesuggereerd. U kunt ook een combinatie van oversampling (stap 3.2) en interpolatie.
4. Voer contrast, helderheid, geluid filteren, photobleaching en andere typische beeldverwerking aanpassingen indien gewenst. Beeldmanipulatie normen dicteren dat voor de meeste wetenschappelijk werk, is het aangewezen dat dezelfde correcties worden toegepast op alle beelden, zowel binnen een stapel en op verschillende tijdstippen. Het gevolg van een bijzondere aanpassing worden beoordeeld onder alle beelden ^9.
5. Selecteer een bepaalde weergavemodus voor de export van gegevens. De meest eenvoudige display stereo video aan met rood-groen of rood-blauw anaglyphen (voorbeelden in figuur 3), stereo paren, of afwisselend links / right oog frames met shutter-bril. Anaglyphen zijn beperkt tot een kleur. Verbeter schijnbare beelddiepte desgewenst tot z-as visuele resolutie te verbeteren.
6. Experimenteren met diverse filter-en beeldverbetering technieken. Bijvoorbeeld, Laplace filtering nuttig om contrast van kleine structuren boven de achtergrond toenemen. De helderheid van pixels in het midden van een actief venster wordt verbeterd terwijl de helderheid van de omgeving wordt verminderd. Merk op dat sommige filtering methoden niet goed werken in combinatie.
7. Solliciteer drift correctie als er aanzienlijke beweging van de voorbereiding in de tijd. Een dergelijke beweging is gebruikelijk in levende spier, zelfs met drugs toegevoegd aan actiepotentialen en synaptische potentialen onderdrukken. Een pixel registratie algoritme (bijv.. Imaris, Adobe After Effects, TurboReg plugin voor ImageJ) lijnt time-lapse beelden en kan verminderen, maar meestal niet volledig uit te sluiten, zoals beweging.

Resultaten

De getoonde gegevens zijn van slang neuromusculaire terminals (zie lage en hoge uitzicht vergroting in figuur 3, de endocytische kleurstof (FM1-43) opname creëert een waas die elk bouton vult) en, in het bijzonder, macroendosomes (MES) en zure endosomes (AE) binnen deze terminals ^5. ME's zijn gemaakt door bulk endocytose tijdens neurale activiteit ¹⁰ en hun aantal daalt exponentieel met de tijd na de activiteiten heeft gestaakt ^6. Gebruik van 4D live-imaging was om t...

Discussie

De meest kritische aspect van 4D beeldvorming is beheer van de duur en intensiteit van blootstelling aan licht. Fotobleken vermindert het signaal-ruisverhouding en kan problematisch of niet, afhankelijk van verschillende factoren, waaronder keuze van fluoroforen zijn. Niet-specifieke schade aan levend weefsel (fototoxiciteit) is gerelateerd aan fotobleken, en kan soms worden geïdentificeerd met fluorescerende probes daartoe ingerichte ^2,12 of door onderzoek van de morfologie helderveld met geschikte optica, z...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Equipment
SGC5	Biotium, Hayward, CA	70057	Finale conc: 10 mM
FM1-43FX	Invitrogen, Carlsbad, CA	F35335	Finale conc: 7 mM
LysoTracker Red	Invitrogen, Carlsbad, CA	L7528	Finale conc: 0,2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2,5 mM
CaCl2			3,6 mM
MgSO4			1,8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1,0 mM
HEPES			5,0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl			86 mM
KCl			60 mM
CaCl2			3,6 mM
MgSO4			1,8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1,0 mM
HEPES			5,0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2,5 mM
CaCl2			3,6 mM
MgSO4			1,8 mM
KH2PO4 (Dibasic)			1,0 mM
HEPES			5,0 mM
Sucrose			0,5 M (17,1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope	Carl Zeiss, Thornwood, NY		www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm	Carl Zeiss, Thornwood, NY		www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher	Sutter Instruments, Novato, CA	175W Xenon arc lamp	www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher	Sutter Instruments, Novato, CA		www.sutter.com
Sensicam CCD camera	Cooke Instruments, Tonawanda, NY		www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera	Photometrics, Tucson, AZ		www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0	Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO	Deconvolutie; Drift correctie; 3D en 4D data presentatie	www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2	Bitplane, South Windsor, CT	Drift correctie; 3D en 4D data presentatie	www.bitplane.com
AfterEffects CS6	Adobe, San Jose, CA	Drift correctie	www.adobe.com
ImageJ 1.46	National Institutes of Health, Bethesda, MD	Meerdere plugins beschikbaar; Stereo paar constructie	http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM	Carl Zeiss, Thornwood, NY	Stereo paar constructie	www.zeiss.com