In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

Samenvatting

Optogenetica is een krachtig hulpmiddel geworden voor gebruik in gedragsneurowetenschappelijke experimenten. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het ontwerp en de installatie van lasersystemen en biedt een volledig protocol voor het uitvoeren van meerdere en gelijktijdige in vivo optogenetische stimulaties die compatibel zijn met de meeste gedragstestparadigma's bij knaagdieren.

Samenvatting

De mogelijkheid om gedefinieerde neurale circuits te onderzoeken bij wakkere, vrij bewegende dieren met celtype-specificiteit, ruimtelijke precisie en hoge tijdelijke resolutie is een lang gezochte tool voor neurowetenschappers in de zoektocht op systeemniveau naar de neurale circuiterie die complexe gedragstoestanden regelt. Optogenetica is een geavanceerd hulpmiddel dat het veld van de neurowetenschappen aan het revolutioneren is en vertegenwoordigt een van de eerste systematische benaderingen om causale testen mogelijk te maken met betrekking tot de relatie tussen neurale signaleringsgebeurtenissen en gedrag. Door optische en genetische benaderingen te combineren, kan neurale signalering bidirectioneel worden geregeld door de expressie van lichtgevoelige ionenkanalen (opsines) in zoogdiercellen. Het huidige protocol beschrijft de levering van specifieke golflengten van licht aan opsine-expresserende cellen in diepe hersengebieden van wakkere, vrij bewegende knaagdieren voor modulatie van neurale circuits. Theoretische principes van lichttransmissie als experimentele overweging worden besproken in de context van het uitvoeren van in vivo optogenetische stimulatie. Het protocol beschrijft de ontwerp- en constructie van zowel eenvoudige als complexe laserconfiguraties en beschrijft tethering-strategieën om gelijktijdige stimulatie van meerdere dieren mogelijk te maken voor hoogdoorvoer gedragstests.

Inleiding

Optogenetics heeft een revolutie teweeggebracht systemen-niveau neurowetenschappen in zijn zoektocht naar de neurale circuit elementen rijden normaal en ziekte-relevante gedragstoestanden. De ontdekking dat lichtgevoelige microbiële opsins kon ¹ functioneel worden uitgedrukt in zoogdiercellen mits het platform voor het gebruik van licht om ongekende controle van neurale activiteit met een hoge ruimtelijke en temporele precisie ² te krijgen. In tegenstelling tot traditionele elektrofysiologische en farmacologische benaderingen voor de behandeling van neurale activiteit optogenetics maakt de bestrijding van specifieke celtypen (voor genetische identificatie of ruimtelijke uitsteeksel) in heterogene populaties en fysiologisch relevante tijdschalen. De latere invoering van een neurale-optische interface voorzien van een praktisch hulpmiddel voor de levering van licht om gedragen dieren ^3. Dit heeft het mogelijk gemaakt voor real-time modulatie van bepaalde neurale circuits in wakker gedragen knaagdieren om causaal testen van derol van deze neurale circuits in het bestuur van gedragstoestanden naar neurologische en psychiatrische ziekten ^4-6 relevant. Optogenetics, daarom is een krachtig hulpmiddel voor introductie in elk laboratorium geïnteresseerd in het onderzoeken van de functionele relatie tussen hersenactiviteit en gedrags- of fysiologische maatregelen in diermodellen.

Succesvol ontwerp en de voltooiing van een optogenetische experiment houdt in verschillende stappen en overwegingen (zie figuur 1). Het doel van het huidige protocol is om individuen te voorzien van de gereedschappen en onderdelen, samen met de theoretische en praktische kennis, die nodig zijn om optogenetische stimulatie uitvoeren wakker gedragen knaagdieren. Momenteel zijn er twee overheersende golflengte marges gebruikt microbiële opsin kanalen activeren: in het blauwe spectrum (gewoonlijk 473 nm) en groen-geel spectra (meestal 532 of 591 nm). Beide lasers en licht-emitterende diodes (LEDs) worden gebruikt als lichtbron voor dEliver specifieke golflengten van licht om hersenweefsel. De niet-coherent licht dat LEDs maakt echter effectieve transmissie van licht moeilijk wanneer het koppelen in de voor in vivo knaagdier stimulatie kleine kern vezels. Bepalen van de geschikte laser samenstel een cruciale eerste stap en zal afhangen van het beoogde gebruik van optogenetics in het lab. Het huidige protocol beschrijft twee basisconfiguraties die verschillen in hun gemakkelijke montage en gebruik: single pre-gekoppelde lasers en dubbele lasersystemen (zie figuur 2). Enkele lasersystemen die vooraf gekoppeld door de fabrikant in wezen kant-en-go bij aankomst met weinig tot geen opstelling vereist, maar hebben het nadeel minimale eindgebruiker voorbeeld. Een dual laser systeem maakt het mogelijk de levering van twee verschillende golflengten beneden dezelfde vezel. Dit wordt steeds belangrijker met de komst van combinatorische optogenetics worden waarbij verschillende golflengtes kan worden gebruikt voor het activeren / remmen onderscheidt celtypen die ruimtelijk mede gelokaliseerd. Dit is ook van essentieel belang is voor gebruik met een bi-stabiele stap functie opsins waar fotostromen worden gestart en beëindigd door blauw en geel licht, respectievelijk ^7,8. Dual lasersystemen ook aanpasbaar als de gebruiker kan toevoegen of componenten (zoals een externe shutters, beam filters, inline power meter) vanaf de stralengang verwijderen behoefte. Door zijn veelzijdigheid, is de dual laser set-up aan te raden als optogenetics gaat om een ​​voortdurende instrument dat wordt gebruikt in het lab zijn. Koppeling van de lasers, kan echter een uitdaging en dus een snelle, eenvoudige en betrouwbare koppelingsmechanisme is voorzien in dit protocol. Let op, dit protocol beschrijft de montage van optische componenten en maakt gebruik van patchkabels en componenten die zijn geoptimaliseerd voor stap-index multimode glasvezels met een 200 pm kern en een numerieke apertuur (NA) van 0,22. Verschillende kern maten en NA zijn beschikbaar voor aankoop, maar alle componenten moeten idealiter overeenkomen qua kerngrootte en NA te vermijden licht verlies bij glasvezelverbinding punten. Als alternatief op een glasvezelverbinding, kan het licht gaan van een kleinere naar een grotere kern grootte; en / of van een lagere naar een hogere NA-NA vezel zonder bijkomend verlies.

Tethering strategieën worden voorzien die het mogelijk maken simultane stimulatie van meerdere muizen high-throughput gedragstesten. De protocollen over te nemen, gebruik van chronisch implanteerbare vezels voor gedragsonderzoek, maar kunnen worden aangepast voor acute stimulatieprotocols. Acuut geïmplanteerde vezels voordelig te combineren optogenetic stimulatie met farmacologische manipulatie, omdat dezelfde canule gebruikt om drugs en het uiteinde van een optische vezel op dezelfde locatie te leveren. Het gebruik van chronisch geïmplanteerde vezels is echter sterk aanbevolen voor meerdaagse gedragstesten aangezien daardoor weefselbeschadiging een herhaalde plaatsen en verwijderen van vezels en verhoogt de nauwkeurigheid qua consistente plaatsing van vezels voorweefsel verlichting ^3. In combinatie met de tethering configuraties beschreven, kan gedrag worden geregistreerd betrouwbaar meerdere dagen. Inderdaad, betrouwbare lichttransmissie gemeld maanden na vezels implantatie ⁹ zodanig dat chronische stimulatie en gedragsproblemen testen paradigma's kan, in theorie, worden uitgevoerd over meerdere dagen en weken uitgevoerd. Aanvullende opmerkingen over hardware componenten zijn toegevoegd aan het protocol bij de lezer de keuze in het beste product dat past bij hun individuele behoeften, met inbegrip van kosteneffectieve alternatieven en producten die kunnen worden gemaakt in eigen huis mogelijk te maken. Belangrijke tips die handig zijn tijdens de installatie en implementatie zijn ook aanwezig.

Protocol

! LET OP: Dit protocol omvat het gebruik van de klasse 3B lasers en zal juiste richtlijnen opleiding en veiligheid moeten worden gevolgd. Veiligheidsbril moet gedragen worden ten alle tijden bij het bedienen van lasers, met de aanpassing procedures presentatie van een bijzonder hoog risico. Neem contact op met de laser provider om de brillen die maximale demping zal zorgen voor een gegeven laser bepalen. Indien beschikbaar, inschrijven in een institutionele laserveiligheid-opleiding. Exploiteren van een laser nooit zonder de juiste oogbescherming en opleiding.

1. Laser Apparatuur Set-up

In voorkomend geval, zijn stappen in hoofdstuk 1 aangeduid als (A) of (B) om onderscheid te maken tussen enkele of dubbele lasersystemen, respectievelijk.

1. Hechten en veilig lasers om het breadboard. Breadboards zijn uitstekende warmtegeleider en fungeren als een koellichaam om schade aan de interne laser onderdelen bij langdurig gebruik te voorkomen.
2. (A) Bevestig de pre-gekoppelde laser om een 10 "x 12" broodplank (of indien nodig) met behulp van ¼-20 "cap schroeven en ringen (Figuur 2A). Als broodplank gaten niet uitgelijnd met laser montagegaten, gebruik maken van kleine 'tafelklemmen' laser vast te breadboard.
3. (B) Als het 2 lasers te gebruiken zeer verschillende beam hoogtes (> ~ 1 cm), gebruik maken van kleine 4 "x 6" breadboards een platform voor één van de lasers. Bevestig deze borden naar de belangrijkste grote 12 "x 18" breadboard met behulp van ¼-20 "cap schroeven met ringen, bevestig vervolgens de laser om de kleinere planken met behulp van schroeven of tafelklemmen zoals weergegeven in figuur 2B. Maak de andere laser direct op de broodplank met behulp van schroeven of een variabele hoogte tafelklem.
   Kritische stap: Breadboards, schroeven, en optische componenten kunnen worden gekocht als keizerlijke of metrische consistente dus bij de aankoop van artikelen; de standaardinstelling voor dit protocol is keizerlijke.
4. (A)Bevestig een dikke mantel platte splitsen / fysiek contact (FC / PC) patch snoer met de koppelaar (aangeduid als een snoer van zie figuur 3) die fysiek is bevestigd aan de voorzijde van de laser (figuur 2A).
5. (B) Haal het koppelstuk op een ¾ "optisch post, dan epoxy de verbinding tussen de koppeling en de bovenkant van de paal met JB Kwik, epoxy of dergelijke te voorkomen losmaken en uitlijning gedurende gebruik. Bevestig de post naar de broodplank (zoals de broodplank gaten zal niet altijd op een lijn met de vereiste plaatsing van optische componenten, een ambtsdrager, voetstuk base-adapter, en klemmen vork worden gebruikt om de koppeling van de optische achteraf vast te zetten). Bevestig een dikke mantel patchkabel (koppeling snoer) aan de achterkant van de koppeling.
6. (B) Plaats de eerste stuur- spiegel voor de blauwe laser in de kinematische houder en bevestig deze aan de broodplank met een ¾ "optische bericht. Bevestig dit bericht aan een basis ADAPter en klemmen vork. Plaats de klemmen vork en post montage direct voor de blauwe laser met spiegel onder een hoek van 45 ° met de laser naar de dichroïsche spiegel sturen. Gebruik het rooster patroon van gaten op de broodplank als een ruwe uitlijngeleider. Eenmaal grofweg gepositioneerd, gebruik dan een ¼ "-20 dop schroef aan de klem vork vast te zetten aan de broodplank (zie figuren 2B, C).
7. (B) Steek de dichroïsche spiegel in een kinematische houder en bevestig deze aan een 1 "optische post en veilig direct naar het breadboard. Plaats de dichroïsche spiegel aan de uiterst links van, en in overeenstemming met de blauwe laser spiegel. Hoek van de dichroïsche spiegel in een hoek van 45 °, zodanig dat blauw licht gereflecteerd door de eerste spiegel wordt weerspiegeld in de koppeling, draai de schroef bevestigen van de kinematische houder om de post (zie figuren 2B, C).
8. (B) Bevestig de eerste stuur- spiegel voor de gele laser om een ​​¾ "optische bericht. Bevestig de optical post naar een basis-adapter en klemmen vork. Plaats de klemmen vork en post-ensemble direct voor de gele laser en de hoek van de spiegel bij 45 ° zodanig dat geel licht wordt gericht naar de tweede spiegel stuurinrichting. Bevestig de klemmen vork in plaats met een ¼ "-20 dop schroef en ring.
9. (B) Bevestig de tweede stuurstand spiegel voor de gele laser om een ​​1 "optische bericht. Hoek van de spiegel zodanig dat de gele lichtstraal van de eerste spiegel zal worden weerspiegeld door de dichroic en in de koppeling (figuur 2C). Bevestig het bericht direct naar de breadboard en draai de bevestigingsschroef zodra de spiegel onder een hoek op de juiste wijze. Fijne spiegel aanpassingen worden gemaakt met behulp van de kinematische spiegel mounts in een latere stap.
10. (B) Bevestig een grijsfilter wiel om een ​​¾ "optische post en leg de post in een post houder bevestigd aan een montageplaat. Bevestig het ensemble aan de broodplank tussen de eerste en second gele spiegels met behulp van een enkele ¼ "-20 dop schroef. Dit wiel wordt gebruikt om de kracht van geel laserlicht bereikt de koppeling passen.
    Tip: Individueel alle componenten (zoals de schroeven waarmee kinematische spiegel houders naar de top van de ambten, en de draden houden basis adapters aan de onderkant van berichten) draai voordat ze aan de basis. Gebruik een schacht van een kleine inbussleutel in de informatie die via-gaten in optische berichten om genoeg koppel te krijgen. Hiermee wordt voorkomen dat onderdelen los komen tijdens het gebruik, noodzakelijk herschikking.
11. Bevestig een FC / PC naar FC / PC L-bracket adapter op het breadboard.
12. Optioneel: Bevestig een 1 x 2 50/50 mini kubus vezel splitter direct naar breadboard voor gelijktijdig in vivo stimulatie van twee of meer dieren. Bovendien kunnen handvatten worden toegevoegd om te helpen bij de beweging van steekbord samenstel (zoals weergegeven in figuur 2A).

2. Laser Koppeling (Non-contact stijl Koppeling)

Deze sectie heeft betrekking op de dual-laser set-up (Figuur 2B). Lijn de innerlijke blauwe laser pad vóór het uitlijnen van de buitenste gele laser pad.

! LET OP: Gebruik een laag licht macht koppeling (~ 1 mW) om de veiligheid oog te garanderen. Draag een veiligheidsbril aan de macht van de laser en tot lichtintensiteit wordt gemeten en die veilig worden geacht.

1. Stel de schakelaars op de achterzijde van de laser "Curr" (stroom) en transistor-transistor logic mode (TTL) + voor constante verlichting (in tegenstelling tot analoge modus). Zorg ervoor dat de stroom knop op de voorkant van de bestuurder is ingesteld op nul. Zet de laser instelling door de bestuurder en daarna de laser toets.
2. Langzaam pas de stroom knop aan de voorzijde van het laseraanstuurmiddel zodat ~ 1 mW laserlicht wordt uitgezonden. Wacht 10-15 minuten (of zoals aangegeven door de fabrikant) voor laser op te warmen.
3. Sluit de glasvezelkabel tester direct naar de free einde van de koppeling patch stopcontact en zet de kabel tester (Figuur 3A). Pas de hoek van de koppeling zodat de rode straal reist direct terug naar het midden van de dichroïsche spiegel. De bundel pad van het rood licht uitgestraald door de kabel tester is het exacte pad dat de inkomende laserlicht zal moeten volgen om te worden gekoppeld in de laser.
4. Voer een grove uitlijning: Gebruik de laterale en horizontale knoppen aan de kinematische spiegels aan de laserstraal te sturen in de koppeling. Het voetstuk klemmen moet worden losgemaakt iets herpositioneren de spiegels en de koppeling. De kinematische mounts moet nog wat reizen beschikbaar voor verdere fijne aanpassingen. Wees niet bezorgd zijn als er geen blauw licht wordt uitgezonden uit de koppelaar bevestigd patchkabel op dit moment.
5. Plaats een stuk semitransparant papier direct voor de dichroïsche spiegel, tussen de dichroïsche en koppeling. Er zal zowel een blauwe en ared stip op dit papier uit de laser en de kabel tester, respectievelijk. Gebruik papier dat is doorschijnend genoeg om zowel de rode en blauwe plekken tegelijk zien vanaf dezelfde kant van het papier.
6. Nauwkeurig afstellen de eerste stuurinrichting spiegel (dwz de ene dichter bij de laser, niet de dichroïsche) door voorzichtig aanpassen van de laterale en horizontale knoppen om het midden van de rood punt met de blauwe stip lijnen.
7. Schuif het papier terug naar de koppeling zodat het direct voor de koppeling en de knoppen pas op de tweede (dwz dichroïsche) spiegel voor de laserbundel met de rode balk lijnen.
8. Itereren over de stappen 2.6 en 2.7 tot en met het middelpunt van de blauw / gele en rode balken precies zijn uitgelijnd in beide posities (dat wil zeggen, tot de rode en blauwe balken zijn colineair).
9. Verwijder de kabel tester uit de koppeling snoer. Laserlicht moet nu worden uitgezonden vanaf het einde van de koppeling patchkabel.
10. BEPALIne koppelingsefficiëntie door het meten van het licht wordt uitgezonden vanuit de vezel tip van de koppeling patchkabel met behulp van een power meter. Gebruik de 500 mW instelling op fotodiode de power meter en de golflengte instelling (λ) naar blauw (473 nm) of geel (635 nm) spectrum licht, afhankelijk van de laser wordt gebruikt veranderen.
11. Plaats de vezelpunt loodrecht op de fotodiode tot een macht te bekomen. Vergelijk het licht kracht invoeren van de koppeling aan het licht wordt uitgezonden vanaf het einde vezels. Een koppeling rendement van> 80% wordt als zeer goed. Zeer kleine verdere aanpassingen van de tweede stuurstand spiegel kan soms licht verbeteren koppeling. In het algemeen, wanneer de lichtbundel vanaf het einde van de koppeling vezel is een kleine, strakke, centrale locatie (zonder er omheen), koppelingsefficiëntie in de vezelkern optimaal.
12. Herhaal de stappen 2,1-2,11 voor gele laser koppeling, met uitzondering van het gebruik van de twee spiegels voor de gele laser (zie figuur 2C). Doe geent pas de positie van de dichroïsche spiegel of uitlijning van de blauwe laser zullen verloren gaan.

3. In vivo optogenetische Stimulatie

Zorg dat alle procedures met betrekking tot het gebruik van dieren worden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale en nationale richtlijnen en goedgekeurd door de overeenkomstige Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1. Optische vezel opstelling (zie figuur 3B voor identificatie van de verschillende patchkabels hierna). Om een enkele muis te stimuleren, sluit de koppeling patchkabel tot een dikke mantel patchkabel met behulp van de FC / FC L-bracket adapter rechtstreeks aangesloten op de broodplank (zie figuur 4A). Om twee dieren van de ene laser te stimuleren, sluit de koppeling patchkabel aan twee dikke mantel patchkabels met behulp van de 1 x 2 50/50 mini kubus (zie figuur 4B). Om drie of meer dieren te stimuleren, bevestig het snoer van een multimode fiber splitter met behulp van de 1 x 2 mini kubus reeds aan de broodplank (zie Figuur 4C).
2. Bevestig een collector / rotary joint aan de vrije uiteinden van de dikke mantel flardkoord / fiber splitter. Schakelaars zijn essentieel als ze rotatie van de vezel met beweging van knaagdieren, die accumulatie van torque voorkomt op de patch kabel mogelijk. Te veel koppel kan koorden draaien leiden tot breuk, en interfereren met de natuurlijke beweging van het dier tijdens het testen.
3. Bevestig het dier patchkabel aan de collector.
4. Bevestig een verbinding gespleten huls aan de vrije metalen ferrule uiteinde van het dier patch kabel (figuur 5). Forceer de mouw helemaal tot het beentje; laat ~ 0.5 cm huls blootgesteld is wat verbinding met de geïmplanteerde glasvezel aangebracht op het dier (figuur 6).
   Kritische stap: Altijd aankoop mouwen die een split bevatten om uitbreiding van huls over geïmplanteerde vezels beentje mogelijk te maken tijdens verbinding enverwijdering. Te strak van een fit kan ernstig trauma veroorzaken aan het dier als het implantaat loskomt van de schedel bij een poging om de hoes van het implantaat los te koppelen. Als dit toch gebeurt, moet het dier uit de studie worden verwijderd en onmiddellijk de dierenarts zorg. Ook voor het gebruik van een nieuwe hoes voor de eerste keer, 'breken in' door het aansluiten en loskoppelen van een ferrule totdat hij verbreekt met de gewenste hoeveelheid kracht.
   Tip: Het is gemakkelijk om een vezel te breken tijdens het verwijderen van een huls die nauw verbonden is aan een ferrule. Om dit te voorkomen, duw het beentje door het invoegen van een kleine houten staaf in het open uiteinde van de bus (het handvat van een standaard wattenstaafje is de juiste maat).
5. Sluit de blauwe laser bestuurder om een ​​pulsgenerator met een BNC-kabel en zet de pulsgenerator op.
6. Passende veiligheidsbril op. Stel de schakelaars op de achterzijde van de laser "Curr" en "TTL +" -modus. Zorg ervoor dat that de kracht knop op de voorkant van de bestuurder is ingesteld op nul andturn de laser op (zet de bestuurder op de eerste en vervolgens de laser-toets).
7. Pas de macht knop op de voorzijde van de laser zodat 5-10 mW wordt uitgezonden door het dier flardkoord vezelpunt als gemeten met een lichtvermogen meter. 5-10 mW is een algemene richtlijn - precies vermogensintensiteit moeten beïnvloeden een gegeven volume weefsel moeten vóór de start van het experiment wordt berekend, zoals in Aravanis et al ^3.
8. Schakel de blauwe laser op "Analoog" modus voor in vivo stimulatie. Opmerking: Geel DPSS lasers worden gebruikt in TTL + modus voor een constante verlichting. Wacht 10-15 minuten voor de laser op te warmen.
9. Zachtjes bedwingen van de muis en sluit de split-hoes op het dier patchkabel om de chronische implanteerbare vezel (zie figuur 6). Zorg ervoor dat de uiteinden van de beide vezels maken fysiek contact met elkaar. Gebruik de splitsing op de mouw aansluiting als eenvenster om direct contact tussen de twee visualiseren Kritische stap:. Soms vuil kan verzamelen over de metalen ferrule van implanteerbare vezels van het dier en interfereren met de juiste aansluiting. In dit geval gebruikt u een ethanol doekje om voorzichtig te reinigen het beentje op de kop van het dier voorafgaand aan de bevestiging. Probeer nooit een verbindingsmof via ferrule dit ernstig trauma veroorzaken aan het dier. Als een fysieke verbinding tussen vezeluiteinden niet gemaakt kan worden na het reinigen, verwijder het dier uit de studie.
   Tip: Lichte lekkage kan optreden op het verbindingspunt tussen de geïmplanteerde vezel en dier patchkabel. Visualisatie van dit licht door knaagdieren kan een experimentele verwarren ¹⁰ presenteren. Krimpkous kan worden bevestigd aan patchkabels en gleed over het aansluitpunt om vreemd licht te minimaliseren.
10. Laat de muis te herstellen gedurende enkele minuten vóór de aanvang van gedragstesten.
    Tip: Dfhankelijk de gedragstest te dienen, is het het beste om muizen voor de verbinding en tethering proces wennen 2 - 3 dagen, als de behandeling nodig is om het dier te verbinden stress kan induceren en verwarren gedragstesten.
11. Plaats de muis in de gedragswetenschappen testapparatuur ervoor te zorgen dat de stekker uit het stopcontact is vrij van haken en ogen. Laat nooit een dier zonder toezicht tijdens de stimulatie. Zelfs met het gebruik van commutatoren, hoeft patch koorden hebben de neiging te verdraaien gedurende langere tijdsperioden en kan interfereren met gedragstesten.
12. Gebruik een pulsgenerator de blauwe laser puls met een vooraf bepaalde frequentie die opsin keuze activeert. Voor geel laser gebruik: pulseren de gele laser met externe shutters of door simpelweg blokkeren van de bundel pad met een ondoorzichtige, niet-reflecterend, niet brandbaar object.

4. bericht In vivo stimulatie Overwegingen

Dit gedeelte is niet bedoeld om een ​​complete proto zijncol, maar wordt aangeboden als leidraad voor de aanvullende procedures die moeten worden overwogen na in vivo optogenetische stimulatie.

1. Na voltooiing van een experiment, bevestigen virale en fibre placement histologisch voor een nauwkeurige interpretatie van gedragsmatige resultaten. Euthanaseren dier volgens de institutionele richtlijnen en perfuseren het dier met ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en 4% (w / v) paraformaldehyde in PBS.
2. Verwijder geïmplanteerde glasvezel door stevig vast te grijpen de blootgestelde metalen ferrule met een tang of hemostats. Trek in een vloeiende, maar toch snel, beweging. Het is belangrijk dat de integriteit van de geïmplanteerde vezel getest door meting van de lichtopbrengst aan het einde van elk experiment.
3. Post-fix de hersenen in paraformaldehyde gedurende ten minste 24 - 48 uur vóór het snijden door het gebied van belang. (Bij gebruik van een bevriezing microtoom, incubeer hersenen in een 30% sucrose oplossing voor enkele dagen voor het snijden). Uit te voeren met behulp van immunohistochemie standard protocollen voor de detectie van de geschikte-opsin tagged fluoroforen, dat wil zeggen, groen fluorescent eiwit (GFP), verbeterde gele fluorescerende eiwit (eYFP) of mCherry.
4. Controleer plaats van opsin meningsuiting en vezels implantaat onder een microscoop en visueel bevestigen juiste plaatsing van het virus injectie en implantaat op basis van gekozen coördinaten.

Resultaten

Behavioral resultaten verkregen met in vivo optogenetische stimulatie zijn volledig afhankelijk van de neurale circuit wordt gericht, het diermodel gebruikt, en de modulatie parameters. Voor actuele demonstratieve doeleinden dopamine neuronen in het ventrale tegmentale gebied of VTA, tyrosine hydroxylase :: Cre muizen werden getransduceerd met een stabiele stap-functie opsin (SSFO) ^8, of controle virus (eYFP), en een vezel implantaat was chronisch geïmplanteerd. Het gebruik van TH :: Cre transgene muizen zorgt opsin expressie beperkt is tot TH + cellen (dopamine) in de VTA. Figuur 7 toont representatieve gedrags- resultaten verkregen met de huidige beschreven laser opstelling voor simultane stimulatie van meerdere muizen. Hier muizen vastgebonden en gestimuleerd tegelijkertijd met afzonderlijke lasers (3 muizen / Laser volgens figuur 4C) en bewegingsapparaat gedrag werd voor 1 uur. Herhaalde stimulatie van dopamine neuronen in het VTA resulteerde in eenhyperactief fenotype dat hield gedurende de hele duur van de stimulatie. Geen verandering in locomotorisch gedrag werd gezien in eYFP muizen (zie video 1). Volgende gedrags testen, werd immunohistochemie uitgevoerd om nauwkeurige virale targeting naar VTA dopamine neuronen en fibre placement werd visueel bevestigd (zie figuur 7) te controleren.

Figuur 1. Experimentele stappen voor in vivo optogenetische stimulatie. Er zijn vier algemene stappen die betrokken zijn bij het ​​ontwerpen en uitvoeren van in vivo optogenetische stimulatie. Dit protocol zet de stappen die betrokken zijn bij de levering van het licht van een laser lichtbron tot diepe hersenstructuren in de gedragen knaagdieren en omvat 1) lasersysteem assemblage en licht koppeling; 2) het aanbinden strategieën voor ceen stap die essentieel is voor de interpretatie van gegevens - ANSLUITEN meerdere dieren lichtbron voor high-throughput gedragstesten en 3) richtsnoeren de targeting voor lichte levering te bevestigen. Opmerking: hoewel dit protocol is niet exclusief voor chronische implanteerbare vezels voor tethering doeleinden, is het raadzaam en aangenomen bij het combineren van optogenetische stimulatie met gedragsproblemen testen. Zie zowel Ung & Arenkiel, 2012 ¹⁸ en Sparta et al., 2012 ⁹ voor in-house productie en de implantatie van chronische optische vezels. Ononderbroken lijnen = stappen die in dit protocol.

Figuur 2. Laser systemen voor het in vivo optogenetic stimulatie. (A) Single lasersysteem in vivo stimulatie. Deze laser is ph ysically vooraf gekoppeld door fabrikant en vereist weinig eindgebruiker set-up. (B) Dual lasersysteem. Twee lasers worden gekoppeld in een enkele vezel door het gebruik van spiegels die werken om elke stralengang sturen naar een contactloze stijl koppeling. Dit is de meest veelzijdige set-up als optische componenten kunnen worden verwijderd of toegevoegd als nodig, maar presenteert meer van een uitdaging op het gebied van efficiënte laser koppeling. (C) Schematische voorstelling van de dubbele lasersysteem weergegeven in (B) met vermelding van de plaatsing van lasers en spiegels met de bijbehorende laserstraal pad (pijlen) afgebeeld. Hier wordt de koudlichtspiegel "D" gebruikt om blauwe golflengten van het licht af te buigen tijdens het zenden gele golflengten door naar de koppeling "C" en in de bijgevoegde koppeling patchkabel. B = blauwe laser; C = non-contact stijl koppeling; D = dichroic spiegel; FW = filter wiel; M = Spiegel; Y = geel laser.krijgen = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3. (A) Kabel tester gebruikt in de niet-fysieke koppeling protocol Bottom:. Kabel tester direct verbonden met een patchkabel. Plaats beeldt verbindingspunt van tester aan de kabel (B) Patchsnoeren aangeduid hele protocol Van buiten naar binnen:.. Multimode fiber splitter, zwarte mantel dier patchkabel met witte zirconia sleufmof verbonden aan de flat-aanhangen (FC) einde, dikke mantel patchkabel (ook wel aangeduid als een "koppeling koord"). Dikke mantel patchkabels zijn bekleed met polyvinylchloride (PVC) buis voor extra bescherming. Voor deze kabels, worden standaard industrie kleurcodes gebruikt om onderscheid te maken tussen verschillende soorten vezels, waarbij oranje = multimode fiber. Dier patchkabels zijn dunnere mantel voorzien om de flexibiliteit voor de verplaatsing van dieren mogelijk te maken tijdens gedragsmatige testen. Merk op dat stofkapjes zijn op FC geplaatst / PC eindigt wanneer de kabels niet in gebruik zijn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4. Tethering strategieën voor in vivo optogenetische stimulatie van (A) een enkel dier, (B) twee dieren; . (C) drie of vier dieren Samenstellingen zijn niet beperkt tot de hierboven getoonde - meerdere configuraties zijn mogelijk door de unieke combinatie van adapters, vezelsplitsingen, en vertakking flardkoorden die commercieel beschikbaar zijn of door aangepaste volgorde. Opmerking: patchkabels en vezelsplitsingen bevatten FC / PC connectoren aan beide uiteinden (slechts één uiteinde wordt afgebeeld).ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5. Correcte en incorrecte (rode x) aansluiting van een patchkabel om een implanteerbare glasvezel met behulp van een split-sleeve. (Linker panel) A zirkoniumoxide split-folie om een patch aansluiten op de ferrule van een implanteerbare glasvezel (hier niet aangebracht op een dier). Pijl wijst naar het verbindingspunt tussen de patchkabel en implanteerbare glasvezel. Vergelijken (rechter paneel), waar er een kloof bestaat tussen de patchkabel en implanteerbare glasvezel, zoals gevisualiseerd door de splitsing van de verbindingsmof. Let op de lichte lekkage die kan optreden bij een slechte verbinding (rechtsonder). Bodeminzetstuk op upper linker paneel toont afzonderlijke componenten gebruikt. Van boven naar beneden van de insert: Dorische implanteerbare glasvezel canule, witte zirconia split-sleeve, een flatscreen-cleeve (FC) einde van een zwarte mantel dier patchkabel (volledige patchkabel weergegeven in figuur 3B). In alle panelen op dat de verbindingsmof is niet gelijk met het FC einde van de patch kabel. Verlaat ~ 0,5 cm van een over-hangen voor de aansluiting op de implanteerbare glasvezel aangebracht op het dier. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6. (linkerzijde) en frontale (rechts) van een muis met een geïmplanteerde glasvezel aangesloten op een patch kabel. Gebruik de splitsing op de aansluitmof te visualiseren juiste verbinding van de patchkabel to de ferrule van de geïmplanteerde glasvezel. Het aansluitpunt wordt gemarkeerd door een rood gestippelde doos en ook afgebeeld in de bovenste insert. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7. Representatieve resultaten. (Links) Behavioral uitlezing van in vivo optogenetische stimulatie. Voorbeeld van gedrag dat kan worden verkregen met behulp van de beschreven laser set-up en tethering-protocol. Getransduceerde met ofwel een stap-functie opsin (AAV5-DIO-SSFO-eYFP - bewegingsactiviteit werd tijdens optogenetische stimulatie van de ventrale tegmentale gebied (VTA) in tyrosine hydroxylase (TH) :: Cre muizen (8 / groep n = 7) opgenomen ) of de controle virus (AAV5-DIO-eYFP) in de VTA. Groepen van drie muizen werden gelijktijdig gebonden aan éénlaser zoals afgebeeld in figuur 4C en gestimuleerd met een 5 sec puls van 447 of 473 nm licht eens 15 min opgeleverd. Twee-weg herhaalde metingen ANOVA toonde een significante groep x tijd interactie (F _3,39 = 15,27, p <0,0001) en een significant hoofdeffect van tijd (F _3,39 = 4.67, p = 0.007) waarbij optogenetic stimulatie verhoogde de bewegingsactiviteit alleen in SSFO muizen (Bonferroni post-hoc p <0,0001, ten opzichte = 0 t - 15 keer bin), resulterend in een totale toename van de motorische activiteit in vergelijking met eYFP muizen (belangrijkste effect van de groep: F _1,39 = 10,69, p = 0,0061; Bonferroni post hoc p <0,01 bij t = 15-30 en p <0,001 bij t = 30 - 45 en t = 45 - 60). Fiber specs: 200 pm kern, 0,22 NA. Licht instraling = 6-66 mW / mm ^2, wat overeenkomt met vezelpunt afstand van 0,1-0,6 mm van virale injectieplaats met 5 mW licht macht uitgezonden op vezelpunt voorafgaand aan tethering. Fout balken geven standaardfout van het gemiddelde. eYFPvs. SSFO: ** p <0.01; *** P <0.001; tijd-effect: #### p <0,0001 (Rechts) Histologische bevestiging van virale en glasvezel plaatsing.. Image confocale fluorescentie verkregen op een Leica TCS SP5 laser scanning microscoop werd gebruikt om fibre placement (gestippelde lijn) en virale-gemedieerde expressie (groen) in de muis ventrale tegmentum volgende in vivo optogenetische stimulatie visualiseren. Dopamine neuronen (TH +) worden gezien in het blauw. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Video 1. In vivo optogenetische stimulatie:. Hyperactiviteit tijdens VTA stimulatie met behulp van SSFO in TH :: Cre muizen Klik hier om deze video te bekijken.

Tabel 1. Licht bestralingen nodig om veelgebruikte opsins activeren.
Opsin Variant	λ	De vermogensdichtheid (/ mm 2)		Woningen
			Aan / Uit Kinetics
Optische excitatie: Fast-acting channelrhodopsins
ChR2 2	470	1 - 5 mW	1.21 / 12 msec	Branden tot 40 Hz
Cheta 19	490	5 mW	0,86 / 8,5 msec	Branden tot 200 Hz
CHIEF 20	450	1.65 mW	1.62 / 12 msec	Niet-desensibiliserende vorm van ChR2
C1V 18	540-630	8 mW (540nm)	5/34 msec bij 540nm	Rood-verschoven
		3.2 mW (630nm)	67 msec (on) bij 630nm
Optische excitatie: Langzaam werkende kanaal rhodopsins
Stabiele stap functie opsin (SFO) 8	470/590	8 uW (470nm)	20 msec / 29 min	Nieuwe SFO variant; langer open toestand. Geopend door 470 nm, gesloten door 590 nm
Optische Remming
eNpHR3.0 21	560-630	3-5 mW	2.5 msec / <10 msec	Aanhoudende remming voor 30 min 22 met constant licht *
ArchT3.0 11, 23	520-560	1-5 mW	2 / <10 msec	Gevoeliger met grotere fotostromen dan eNpHR3.0
Deze tabel is bedoeld als slechts een leidraad; specifieke licht bestralingen die nodig zijn voor neurale modulatie moet onafhankelijk worden bevestigd.
Experimentele validatie is belangrijk om te controleren of de opsin, gericht op strategie, en lichte stimulatie parameters moduleren neurale afvuren op de bedoelde wijze 5.
Vermogensdichtheid (mW / mm2) verwijst naar het vermogen van het licht verlicht op een bepaald gebied van hersenweefsel en niet naar lichtvermogen geëmitteerd vanuit de vezel tip.
* Gebruik altijd de laagste lichtintensiteit mogelijk, vooral bij langdurig lichte stimulatie.

Tabel 1. Licht bestralingen nodig om veelgebruikte opsins activeren.
Afkortingen
AAV = adeno geassocieerde virus
DPSS = diode-gepompte solid state
EYFP = verbeterde gele fluorescerende eiwit
FC / PC = flat aanhangen / fysiek contact
GFP = groen fluorescerende eiwit
PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing
PVC = polyvinylchloride
mW = milliwatt
NA = numerieke opening
SSFO = stabiele stap-functie opsin
TH = tyrosine hydroxylase
TTL = transistor-transistor logica
V = spanning
VTA = ventrale tegmentum

Discussie

De huidige beschreven laser set-ups en tethering strategieën zijn compatibel met een breed scala van knaagdieren gedragstesten. Inderdaad, hebben een verscheidenheid van gedragstesten gebruikt na, of begeleiden, in vivo optogenetische stimulatie die emotieve gedragstherapie taken, gedragsconditionering, leren en geheugen paradigma's, slapen, opwinding, en appetitief taken omvatten een paar te noemen (zie Nieh et al. ⁶ voor een uitgebreide review). Optogenetics heeft de manier veranderd waarop traditionele gedrags-tests worden uitgevoerd in die meerdaagse studies kunnen nu worden gecondenseerd in een enkele sessie waarin gedrag wordt vergeleken, binnen-proefpersonen, tijdens verschillende tijdperken van het licht 'aan' versus 'uit' ^5. Van de nota, gedrags- apparaten die deuropeningen bevatten, afgesloten compartimenten of andere obstakels kunnen aangepast moeten worden om de doorgang van tethered vezels tegemoet te komen.

De beschreven tethering strategieën vergunning simultaneous stimulatie van meerdere muizen uit een laser. High throughput optogenetic gedragstesten kunnen derhalve worden bereikt door het gebruik van meerdere lasers en testapparatuur. Het aantal dieren die gelijktijdig kunnen worden gestimuleerd, zal echter door de maximale lichtsterkte dat in elke vezelpunt kan worden bereikt. Maximaal vermogen aan de vezel tip is afhankelijk van de 1) startvermogen van de laser; 2) koppelingsefficiëntie en 3) het aantal bundel splitst. Voor 100 mW laser met ~ 80% koppelingsefficiëntie en maximaal 4 bundel splitst (zoals weergegeven in figuur 4C), gemiddelde vermogen in de vezel uiteinde kan variëren tussen 5-10 mW bij gebruik van 200 urn kern, 0,22 NA fiber patch cords (nb verwachten transmissie verlies van roterende gewrichten te zijn <15%). Meten lichtopbrengst op de vezel tip is van essentieel belang voor het bepalen van een geschikt licht macht voor opsin activering als opsins verschillen in hun gevoeligheid voor licht en dus het licht vermogensdichtheid (mW/ ^Mm2) voor activering vereiste ^11. Bijvoorbeeld, de stabiele stap-functie opsin (SSFO) als een foton accumulator en vereist daarom weinig licht vermogensdichtheid voor activering (<8 uW / mm ^{2) 8.} Vergelijk dit met de traditionele kanaal rhodopsin (ChR2) dat een minimum van 1 mW / mm ² van licht om actiepotentialen ontlokken vereist ^2. Tabel 1 wordt geleverd als een snelle referentie voor bekende minimale licht bestralingen die nodig is om de meest voorkomende opsins momenteel in activeren gebruiken. Ten slotte moet men overwegen dat licht verstrooit en absorbeert als het reizen door hersenweefsel zodanig dat meer licht vermogen nodig is voor diepere hersenstructuren ^3. Een handig online hulpmiddel is altijd beschikbaar http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php dat de lichtsterkte op verschillende diepten door hersenweefsel zal berekenen door rekening terekening de vezel kern grootte, numerieke opening, golflengte van het licht gebruikt, en het begint licht vermogen bij de vezel tip. Voor een uitstekend overzicht van de theoretische uitgangspunten van deze berekeningen, zie Foutz et al. (2012) ^12. Voorbeelden van hoe deze uitgangspunten en berekeningen te experimenteel design toepassing worden gedemonstreerd in Aravanis et al. (2007) ³ en Tye et al. (2012) ^13. Voorafgaand uitvoeren van deze berekeningen het begin van een experiment cruciaal voldoende licht bestralingssterkte voor opsin activatie waarborgen. Gezien deze overwegingen is het voordelig om hogere aangedreven lasers kopen om voldoende vermogen te garanderen. Lasers met een vermogen tussen 100-200 mW zijn over het algemeen voldoende om te compenseren voor kleine kern vezels, meerdere vezels splitsen, koppeling inefficiëntie en transmissie verliest ^7. Bij gebruik van een hoog vermogen lasers, echter, zorg moeten worden genomen om neurale schade of warmte en licht-associate voorkomend artefacten die kan optreden bij langdurige en / of hoge aangedreven licht verlichting ^7. Een veilige bereik voor in vivo experimenten tot 75 mW / ^{mm2. 14}

Beslissen over de aard van de laser om de aankoop kan een ingewikkelde zaak, omdat er veel factoren te overwegen zijn. Bijvoorbeeld, directe diode lasers zorgen voor meer stabiele en herhaalbare gepulseerd vermogen dan doen diode-gepompte solid-state (DPSS) lasers, en zijn betrouwbaarder dan de tijd in een testomgeving. In sommige gevallen echter direct diodelasers een lagere lichtopbrengst, ~ 0,1 mW afgeven, zelfs wanneer de stuurspanning 0 V door een constante instelstroom aan de diode wordt verzonden door regelelektronica van de laser. Deze 'spontane' emissie heeft een breder spectrum dan doet laser emissie van dezelfde laser, dus kan specifiek door het installeren van een smalle band-pas (of 'opschonen') filter tussen de laser en de koppeling (zie onderdelen lijst) worden verlaagd. Dit filter zal ookverminderen vermogen door ~ 50% bij het laseren, dus de aanschaf van een hogere aangedreven laser dienovereenkomstig. Opgemerkt zij dat geel DPSS lasers zijn zeer gevoelig en kunnen niet goed bijgewerkt en verminderde levensduur als snel gemoduleerd door een pulsgenerator. Aanpassing van de gele laservermogen moet worden gedaan door middel van externe dichtheid filter wielen geplaatst in de bundel pad (paragraaf 1.7), terwijl de bediening van de laser in de TTL + modus. Als alternatief, de aanschaf van een groene 532 nm DPSS laser is een kosteneffectief alternatief dat zowel halorhodopsins en archaerhodopsins kan activeren.

De numerieke apertuur (NA) van een vezel is belangrijk om te overwegen bij het ontwerpen en de aankoop van fiber componenten voor laser montage set-up. De NA van een optische vezel bepaalt de hoeken van lichtstralen die kan worden aanvaard en afgegeven aan het uiteinde van een vezel. Indien een hoge-NA vezel wordt naar een lagere NA vezel zal aanzienlijk verlies optreden op die interface, dus is het belangrijk om consequent WI th fiber NA binnen één setup (of ervoor te zorgen dat NA verhoogt langs het lichtpad). Het effect van vezel NA van het volume van hersenweefsel verlichte minder belangrijk, aangezien hersenweefsel sterk verstrooiende en aangezien het licht gekoppeld vanuit een laserbron wordt vaak "underfill" high-NA vezels; Echter optische vezels met een NA van 0,22 en 0,37 worden vaak gebruikt. Evenzo koppelen van een grotere kern een kleinere kern vezel zal ook resulteren in aanzienlijke verliezen, dus altijd zeker te verhogen of gelijk kern diameters wordt naargelang de laserbron aan het dier implantaat. Op een algemene opmerking, moet vezeluiteinden altijd worden afgedekt wanneer niet in gebruik om stof en deeltjes opbouw te voorkomen. Het is een goed idee om regelmatig schoon vezeluiteinden en connectoren (70% isopropylalcohol werkt goed) om maximale licht vermogen te garanderen, en om licht vermogen door middel van een 'dummy implantaat' te testen voordat u begint elke dag experimenten.

"> Tijdens gedragstesten, is het noodzakelijk maatregelen te nemen om te controleren voor de effecten van virale infectie, exogene eiwitexpressie, zichtbaar licht, en eventuele verwarming van weefsel effect en artefacten diergedrag. Daarom is de juiste controlegroep bestaan ​​dieren getransduceerd met een controle virus (bijvoorbeeld GFP, eYFP, mCherry) dat identieke lichte stimulatieparameters ontvangen. Experimentele verificatie is een cruciale laatste stap als gedragsgegevens gebruikt voor analyse is geheel afhankelijk van een juiste opsin glasvezelkabels plaatsing in het interessegebied . Specifiek bij dieren waarbij geen immunohistochemisch signaal wordt gedetecteerd of wanneer plaatsing van het signaal of vezel niet in het gebied van belang, dan gedragsgegevens voor dat dier worden verwijderd uit het experiment. Daarnaast is het essentieel lichtopbrengst testen de vezelpunt zowel voor chirurgische implantatie en opnieuw post-mortem om voldoende licht macht voor opsin activering te garanderen. In animals waar ernstige licht verlies is opgetreden door de vezel na experimenten (> 30%) ^9, gegevens voor dat dier moet worden overwogen voor verwijdering. Criteria voor de verwijdering moeten worden vastgesteld a priori. Ten slotte moet men de pulsfrequentie nodig neurale afvuren moduleren, die zal afhangen van de hersenen structuur en neuronale subtypes doelwit beschouwen. Geplaatst optogenetic licht stimulatieparameters aanwezig voor meervoudige neuronale subtypes, moet echter de mogelijkheid om neurale afvuren moduleren onafhankelijk bevestigd door in vivo of hersenplakje elektrofysiologische opnames.

Als men wordt bedreven met laser gebruik en modificatie van laser set-ups, kunnen combinaties van verschillende golflengten worden aangebonden om meerdere vezels op een enkel dier of geleverd door dezelfde vezel voor combinatorische optogenetics ^8. Multi-golflengte stimulatie zal steeds belangrijker worden, gezien de snelle ontwikkeling van de roodverschuivinged channelrhodopsins ^8, de engineering van blauw-verschoven hyperpolariserende opsins ^15, het gebruik van bistabiele stap-functie opsins ^8,16,17, en de algemene groeiende lijst van opsins met verschillende activering spectra ^11. Deze uitbreiding van de optogenetische toolbox zal de ongekende controle van meerdere neurale sub-types, zowel binnen als tussen de gebieden van de hersenen in staat te stellen hun rol in het bestuur van complexe gedragsproblemen staten bepalen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1. Laser Set-up
100 mW 473nm of 488nm Diode Laser System, <2% Stabiliteit (hoeveelheid: 1)	Omicron	Luxx/Phoxx 473/488-100	Optioneel accessoire omvat een afstandsbediening box met sleutelschakelaar en LED-display
100 mW 594nm DPSS-laser (hoeveelheid: 1)	Colbolt	0594-04-01-0100-300	04-01 serie gele laser; gevoelig voor terugreflectie van vezels
200 mW 532 nm DPSS-laser; 5% vermogensstabiliteit (hoeveelheid: 1)	Shanghai Lasers	GL532T3-200	Kosteneffectief alternatief voor gele DPSS-laser voor activering van halorhodopsines en archaerhodopsines
Non-contact stijl laser naar multimodevezelkoppeling (hoeveelheid: 1)	OZ Optics	HPUC-23-400/700-M-20AC-11	Voor gebruik met dubbele laseropstelling; Specificaties: 33 mm OD voor 400 - 700 nm; FC ontvangstvak, f = 20 mm lens met postmontage laserkopadapter #11
Aluminium breadboard, 12" x 18" x 1/2", 1/4"-20 Draad (hoeveelheid: 1)	Thorlabs	MB1213	Voor dubbel lasersysteem
Aluminium breadboard, 10" x 12" x 1/2". 1/4"-20 Draad (hoeveelheid: 1)	Thorlabs	MB1012	Voor enkel lasersysteem
Aluminium breadboard, 4" x 6" x 1/2", 1/4"-20 Draad (hoeveelheid: 2)	Thorlabs	MB4	Voor blauwe laser; dubbel lasersysteem
Compacte variabele hoogteklem, 1/4"-20 Tapped (hoeveelheid: 4)	Thorlabs	CL3
3/4" roestvrij staal post (hoeveelheid: 1)	Thorlabs	TR075
1" roestvrij staal post (hoeveelheid: 4)	Thorlabs	TR1
Posthouder met veerbelaste hex-vergrendelingsmoer (hoeveelheid: 2)	Thorlabs	PH1
Socle Base Adapter (hoeveelheid: 3)	Thorlabs	BE1
Kleine Klemvork (hoeveelheid: 3)	Thorlabs	CF1253
Kinematische houder voor 1" optica met zichtbaar laserkwaliteitsspiegel (hoeveelheid: 3)	Thorlabs	KM100-E02
Neutrale filterdichtheidswiel (hoeveelheid: 1)	Thorlabs	NDC-50C-2M
1" Longpass dichroic spiegel 50% (hoeveelheid: 1)	Thorlabs	DMLP505
Kinematische houder voor 1" optica (hoeveelheid: 1)	Thorlabs	KM100	Voor dichroische spiegel
20-delig zeskantsleutelset met standaard (hoeveelheid: 1)	Thorlabs	TC2
1/4"-20 dopschroef en hardwarekit (hoeveelheid: 1)	Thorlabs	HW-KIT2
Montagebasis 1" x 2.3" x 3/8" (hoeveelheid: 1)	Thorlabs	BA1S
FC/PC naar FC/PC L-Haak koppelingshuls (hoeveelheid: 2)	Thorlabs	ADAFCB1	Dual FC/PC L-bracket ook beschikbaar
Breadboard heftjes (hoeveelheid: 3)	Thorlabs	BBH1
Ø1" Bandpass Filter, CWL = 450 ± 2 nm, FWHM = 10 ± 2 nm (hoeveelheid: 1)	Thorlabs	FB450-10	Voor gebruik met diodelasers die spontaan uitzenden
2. Laser Koppeling
! Laserbeschermende bril (hoeveelheid: 1 voor elke gebruiker bij elke golflengte)	Verschillend		! Raadpleeg laseraanbieder om de juiste selectie van bril te verzekeren die maximale lichtverzwaking zal bieden voor de aangeschafte laser
Vezel optic kabel tester (hoeveelheid: 1)	Eclipse	902-186N
Een-staps vezel connector reiniger (hoeveelheid: 1)	Thorlabs	FBC1
Koppeler patchkabel (0.75 meter) (hoeveelheid: 1)	Thorlabs		0.75 m 200 μm kern, 0.22 NA, FC/PC connectors multimodevezels; voor dubbel lasersysteem
Koppeler patchkabel (0.5 meter) (hoeveelheid: 1)	Thorlabs		0.5 m 200 μm kern, 0.22 NA, FC/PC connectors, multimode; voor enkel lasersysteem
Doric mini kubus (hoeveelheid: 2)	DORIC	DMC_1x2_FC-2FC
Compacte vermogen en energie meter console (hoeveelheid: 1)	Thorlabs	PM100D	Digitaal 4" LCD
C-serie slanke vermogen sensor 5 - 500 mW (hoeveelheid: 1)	Thorlabs	S130C	Meerdere detectortypes zijn beschikbaar; check met leverancier
3. In vivo Optogenetische Stimulatie
Multimodevezel splitters (hoeveelheid: 2)	FONT Canada		Grote kern vezel optic 1 x 2 splitter, 50/50 verhouding, FC connectors, versterkt. Lengte, kerngrootte en numerieke apertuur kunnen worden gespecificeerd bij bestellen; kosteneffectieve kleinere kerngrootten beschikbaar
Willekeurige golfvorm functiegenerator (2 kanalen) (hoeveelheid: 1)	Rigol	DG1022	Kan tot 2 lasers tegelijkertijd besturen
Vezel optic rotatiegewricht (commutator) (hoeveelheid: 6 - 8)	DORIC*	FRJ_1X1_FC-FC	*Ook beschikbaar via Thorlabs en Prizmatix
Dierd