Compleet ruggenmergletsel en Brain Dissection Protocol voor Latere Wholemount In Situ Hybridisatie in Larvale Overzeese Lamprei

Samenvatting

Prikken herstellen motoriek na een complete dwarslaesie. Sommige spinale-projecterende neuronen goed regeneratoren en andere niet. Dit document illustreert de technieken voor huisvesting zeeprik larven (en onlangs omgebouwd volwassenen), het produceren van volledige ruggenmerg doorsnijdingen en het voorbereiden wholemount hersenen en ruggenmerg voor in situ hybridisatie.

Samenvatting

Na een complete dwarslaesie, zijn zee lampreys eerst onder het niveau van doorsnijding verlamd. Echter, ze herstellen locomotie na enkele weken en dit gepaard met korte afstand regeneratie (enkele mm) van propriospinal axonen en spinale-projecterende axons van de hersenstam. Onder de 36 grote identificeerbare spinale-projecteren van neuronen, sommige zijn goed regenerators en anderen zijn slecht regenerators. Deze neuronen kunnen het gemakkelijkst worden geïdentificeerd wholemount CNS preparaten. Om de neuron-intrinsieke mechanismen bevorderen begrijpen of remmen axon regeneratie na verwonding in de gewervelde CZS, bepalen we de verschillen in genexpressie tussen de goede en slechte regeneratoren en hoe de expressie beïnvloed door ruggenmerg doorsnijding. Dit document illustreert de technieken voor huisvesting larvale en onlangs omgebouwd volwassen zee prikken in zoet water tanks, de fabricage van volledig ruggenmerg doorsnijdingen onder microscopische visie, en het voorbereiden van brain en het ruggenmerg wholemounts voor in situ hybridisatie. In het kort worden gehouden dieren 16   ° C en verdoofd in 1% benzocaïne in lamprei Ringer. Het ruggenmerg wordt doorsneden met iridectomiescharen via een dorsale benadering en het dier kan herstellen in zoet water tanks bij 23 ° C. Voor in situ hybridisatie, worden de dieren reanesthetized en de hersenen en koord verwijderd via een dorsale benadering.

Inleiding

Bij zoogdieren ruggenmergletsel (SCI) is een verwoestende aandoening die leidt tot permanent verlies van de functie onder de plaats van het letsel, omdat gewonde axonen niet regenereren door het trauma zone en opnieuw te verbinden met hun geschikte doelwitten. In tegenstelling tot zoogdieren, lampreys herstellen voortbeweging na volledig ruggenmergletsel. ¹ Interessant lampreys een set van 36 ruggenmerg projecteren neuronen die afzonderlijk identificeerbare geheel-mount brain preparaten wegens hun grote omvang ^2,3 (figuur 1) . Al deze spinale-projecterende neuronen axotomized door een hoog-niveau volledig ruggenmerg doorsnijding. Eerdere studies van onze groep en anderen hebben aangetoond dat zelfs bij aanwezigheid van functioneel herstel na SCI, sommige neuronen vertonen een zeer lage regeneratieve capaciteit (ze worden beschouwd als "slecht regeneratoren"), terwijl andere gewoonlijk vernieuwt axon door de plaats van letsel (ze worden beschouwd als "good regeneratoren "). ^2,3 Deze eigenschap maakt lampreys interessant vertebrate modellen om de verschillen in genexpressie tussen goed en slecht regenerator spinale-projecterende neuronen die op hun beurt leiden tot verschillen in de intrinsieke regeneratieve vermogen van neuronen die proberen te bestuderen regenereren hun axonen in dezelfde extrinsieke milieu. ¹

Met behulp van dit model dat we hebben eerder aangetoond dat spinale-projecteren neuronen met lage regeneratieve vermogen tonen uitdrukking van axonale begeleiding molecuul receptoren zoals UNC5 ^4,5 en neogenin, ^6, die de remmende werking van netrine en RGM respectievelijk bemiddelen. Bovendien met deze methode onze fractie is ook gebleken dat alleen de goede regeneratoren tonen een herstel van de expressie van neurofilamenten na het letsel en tijdens het regeneratieproces. Onlangs, Busch en Morgan ⁷ hebben aangetoond door immunofluorescentie dat de slechte regenerators tonen een Increased expressie van synucleïne na beschadiging, die is verbonden door de auteurs dat de "slechte regenerator" spinal-projecterende neuronen langzaam sterven na volledig ruggenmerg doorsnijding ^5,7,8. Dus, de lamprei model van een complete dwarslaesie heeft ontpopt als een zeer bruikbaar model om te begrijpen wat maakt een ruggemerg projecteren neuron een "slechte regenerator" na axotomy.

Om onze studies voeren we volledig ruggenmerg doorsnijding chirurgie protocol en een achterste hersenen dissectie op de gewenste tijdstippen na letsel wholemount voeren in situ hybridisatie. In de huidige methodologische artikel stellen we een gedetailleerd protocol voor de goede uitvoering van een complete dwarslaesie chirurgie in larvale prikken, het verdere onderhoud van de dieren en de uiteindelijke hersenen dissectie en de voorbereiding van de hersenen voor een wholemount in situ hybridisatie. Een gedetailleerd protocol te perform de wholemount in situ hybridisatie in de hersenen van larven prikken is eerder gemeld. ⁹ Daarnaast heeft dit protocol voor ruggenmergletsel en hersenen dissectie kunnen ook gebruikt dan verwerken de hersenen voor immunohistochemie of andere histologische methoden.

Protocol

Zie tabel 1 voor alle in dit protocol gebruikte materialen.

Experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Temple University.

1 Dieren

1. Verkrijgen wildkleur larvale zee prikvissen (Petromyzon marinus L.), 10 - 14 cm lang (4-7 jaar oud) uit beken voeden van Lake Michigan, van zijrivieren van de Delaware River (Pennsylvania) of stromen in Maine.
2. In het laboratorium handhaven larven in groepen van 50 - 100 dieren in 50 gallon zoetwater tanks bij 16 ° C. Lijn de tanks met een centimeter van grind voor de larven te graven in, en het water wordt houtskool gefilterd en geconditioneerd met lucht stenen voor ten minste 48 uur aan chloor en andere onzuiverheden te verwijderen voordat u het prikken in hen. Het is niet nodig de dieren die hun afval recyclen tot de dag van gebruik voeden.

2 Compleet SpinalKoord doorsnijding

1. Voor het ruggenmerg operatie stelt een lamprey Ringer oplossing met de volgende samenstelling: 110 mM NaCl, 2,1 mM KCI, 2,6 mM _CaCl2, 1,8 mM _MgCl2 en 10 mM Tris-buffer; pH 7.4.
2. Om het ruggenmerg doorsnijding voeren, plaatst de larven in een kleine houder zal worden verdoofd met 1% tricaïne methaansulfonaat in ijskoude Ringer oplossing.
3. Zodra verdoofde plaats de dieren in een petrischaal half gevuld met Sylgard (silicone) en gebruik 4 insecten kunnen (0,15 mm diameter) om de dieren in stand te houden voor de operatie (een is geplaatst op de snuit van het dier, een aan de staart en twee ter hoogte van de ^5e gill). Vul de petrischaal bijna tot aan de top met Ringer-oplossing. Zet de schaal met de larve op het ijs tijdens het uitvoeren van de operatie onder de stereomicroscoop.
4. Om het ruggenmerg doorsnijding uitvoeren van een dorsale, middellijn, maak een longitudinale incisie met een scalpel (# 11) ter hoogte van de ^5egill het ruggenmerg visualiseren. Aanvankelijk skin is geopend door de tip van de scalpel naar boven en het spierweefsel wordt gesneden zeer zacht tot ruggenmerg kan worden gezien van boven. Fashion twee haken van het insect pinnen en gebruik ze om te houden van het lichaam muren geopend tijdens het uitvoeren van het ruggenmerg doorsnijding.
5. Volledig doorsnijden van het ruggenmerg op het niveau van de 5 ^e kieuw met behulp van een schaar (Castroviejo 8 #), steek de schaar loodrecht op het ruggenmerg. Het ruggenmerg moet volledig worden doorsneden met een schone snede. Visualiseer het ruggenmerg gesneden uiteinden onder de stereomicroscoop om te bevestigen dat het ruggenmerg volledig is doorgesneden. Daarna lijnt de afgesneden einden van het ruggenmerg na de doorsnijding met een pincet (# 5).
6. Na het uitvoeren van het ruggenmerg doorsnijding sluit de wond in de dorsale lichaamswand met een paar fijne pincet en zet de larven op ijs gedurende 1 uur tot de wond t toestaano drogen. Leg een stukje filtreerpapier tussen het ijs en de larven en laat deze met lamprei Ringer-oplossing. De lage temperatuur blijft de dieren in leven tegelijkertijd dat het de wond aan de lucht drogen en kunnen bijdragen tot infecties.
7. Overdragen dan de larven van kleine tanks (1 larve per tank) met ijskoud water gedurende 24 uur.
8. Onderzoek de laesie larven 1 dag na de spinale doorsnijding te gedragsmatig bevestigen dat er geen beweging caudaal van de plaats van letsel. Een ruggenmerg doorsnijding als voltooid wanneer de larve alleen de kop rostraal kan naar de plaats van letsel (ter hoogte van de ^5e gill). Als dit het geval larven kan nu worden overgebracht naar tanks (1 larve per tank) met kraanwater bij kamertemperatuur (23 ° C) zodat zij terug voor de gekozen tijdstippen.
9. Tijdens de herstelperiode ververs het water om de 2 tot 3 dagen.

3 Brain Dissection en voorbereiding vanBrain in situ hybridisatie

1. Op de gewenste tijdstippen na de blessure opnieuw verdoven het larvale zee prikvissen en plaats en zet ze in de petrischaal met Ringer-oplossing naar de hersenen dissectie als hierboven uit.
2. Naar de hersenen ontleden, eerst een dwarse insnijding met de scalpel tussen het neusgat en de pijnappelklier orgel. Hier begint het weefsel rond de hersenen afgesneden door een paar Castroviejo schaar terwijl het met een pincet.
3. Zodra de hersenen blootgesteld, verwijdert de choroid plexus met een pincet en gebruik de haken aan het hoofd van het dier verspreiden en bloot de craniale zenuwen. Snij vervolgens het ruggenmerg dwars met de Castroviejo schaar. Houd het ruggenmerg met een pincet terwijl u een ander paar pincetten om de craniale zenuwen gesneden om de hersenen ontleden.
4. Na dissectie, zet de hersenen op een klein stukje van siliconen en houd deze vast door het invoegen van 2 insect pinnen in de olfactorische bollen en 1 in het ruggenmerg. Snij vervolgens de achterste en cerebrotectal commissuren van de hersenen langs de dorsale middellijn met de schaar en afbuigen de alar platen lateraal en speld ze plat op de silicone met 4 insect pinnen (figuur 2).
5. Breng het stuk silicone met de hersenen om een ​​buis met 4% paraformaldehyde in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (pH 7,4) bij kamertemperatuur temparature worden vastgesteld gedurende 3 uur op een rotator.
6. Na fixatie gebruik de hersenen wholemount voor in situ hybridisatie zoals eerder beschreven (Swain et al., 1994). Brains uit controle of sham geopereerde dieren moeten altijd parallel lopen met de hersenen van gewonde dieren. De wholemounted larvale hersenen kunnen worden onderzocht door in situ hybridisatie vanwege de platte en dunne vorm en ook door de afwezigheid van myeline ^10, die in de hersenen relatief doorschijnend maakt.

Resultaten

Als voorbeeld van de resultaten die kunnen worden verkregen bij gebruik van deze methode, representatieve beelden van wholemounted hersenen die de expressie van de neogenin transcripten in identificeerbare ruggenmerg neuronen uitstekende controle en 2 weken na lesie larvale zee lampreys zijn getoond in figuur 2. De lezers worden verwezen naar een eerdere studie ⁶ rapportage van de relatie tussen de expressie van neogenin na een complete ruggenmerg doorsnijding en het regeneratieve vermogen va...

Discussie

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om een ​​complete ruggenmerg doorsnijding en posterieure hersenen dissectie in larvale zee prikvissen voeren. Deze procedure maakt analyse verschillen in genexpressie tussen identificeerbare ruggenmerg neuronen projecteren ruggenmergschade door geheel-mount in situ hybridisatie brain. De kritische stap in de procedure is het correct uitvoeren van een volledige doorsnijding ruggenmerg, die 24 uur later worden bestuurd door het observeren van de afgesneden einden van het rugg...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tricaine methaan sulfonaat	Spectrum	TR108	Benzocaïne verzadigde oplossing in PBS voor opoffering
Scalpel #3	Fine Science Tools (FST)	10003-12
Bladen voor scalpel: #11	Fine Science Tools	10011-00
Castroviejo schaar #8	Fine Science Tools	15002-08
Pincetten #4 & #5	Dumont, Zwitserland	Roboz RS4955	#4 voor het dissekeren van het ruggenmerg; #5 voor het strippen van de meninges
Dissectiemicroscoop	Olympus	SZ51
Sylgard	Dow Corning Co.	184
Insectenpins 0.15, 0.20 mm	Austerlitz	Geen catalogus #	0.15 mm voor het vastpinnen van hersenen en ruggenmerg; 0.20 mm voor het lichaam
7 ml HDPE Scintillatiebuisjes met doppen	Fisher Scientific	03-337-1
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Science (EMS)	19210	Verdun tot 4% in PBS