Het analyseren van de Beweging van de Nauplius &#39;<em&gt; Artemia salina</em&gt; &#39;Door Optical Tracking van Plasmonische Nanodeeltjes

Samenvatting

We maken gebruik van optische tracking van plasmonische nanodeeltjes om sonde en karakteriseren de frequentie bewegingen van het water levende organismen.

Samenvatting

We laten zien hoe een optisch pincet een gevoelig instrument om de vloeibare trillingen opgewekt door de beweging van kleine levende organismen te analyseren kunnen voorzien. Een gouden nanodeeltjes bezit van een optische pincet wordt gebruikt als een sensor om de ritmische beweging van een Nauplius larve (Artemia salina) kwantificeren in een watermonster. Dit wordt bereikt door een tijdsafhankelijke verplaatsing van de gevangen nanodeeltjes als gevolg van de Nauplius activiteit. Een Fourier analyse van de positie van de nanodeeltjes geeft dan een frequentiespectrum dat is kenmerkend voor de beweging van de waargenomen soorten. Dit experiment toont het vermogen van deze methode te meten en karakteriseren van de activiteit van kleine aquatische larven zonder de noodzaak om direct waarnemen en informatie over de positie van de larven opzichte van de gevangen deeltjes te verkrijgen. In totaal kan deze benadering een inzicht in de vitaliteit van bepaalde soorten gevonden in een aquatisch e gevencosystem en kon het bereik van conventionele methoden voor het analyseren van watermonsters uit te breiden.

Inleiding

Beoordeling van de waterkwaliteit op basis van chemische en biologische indicatoren is van fundamenteel belang om inzicht te krijgen over de toestand en milieuomstandigheden van een aquatisch ecosysteem ^1-3 winnen. Klassieke methoden voor de chemische water analyse zijn gebaseerd op de organoleptische eigenschappen of de bepaling van de fysisch-chemische parameters. Biologische indicatoren, aan de andere kant, zijn diersoorten waarvan de aanwezigheid en de levensvatbaarheid inzicht bieden in de milieu-omstandigheden en het effect van verontreinigende stoffen voor een ecosysteem dat ze zich voordoen binnen Typische voorbeelden voor bio-indicatoren zijn Copepods, een groep van kleine water schaaldieren, dat kan te vinden in bijna elke waterhabitat ^4,5. Het observeren van de activiteit en de levensvatbaarheid van deze soorten uit een watermonster kan dus worden gebruikt om informatie over de algemene voorwaarden van een ecosysteem ⁵ te verkrijgen. De larven van Copepods, die Nauplii worden genoemd, gebruiken ritmische slagen van hun antennes (elk larve heeft drie paar appendages aan het hoofd regio) om te zwemmen in water ^6. De frequentie en intensiteit van deze slagen is daardoor een directe indicator van de leeftijd, conditie en milieuomstandigheden van het dier ^7-10. Alle onderzoeken op deze specimens worden meestal gedaan met een microscoop door het observeren en de antenne slagen van de Nauplii tellen direct. Door hun grootte (~ 100-500 um) ¹¹ Dit vereist vaak metingen, een voor een of een Nauplius bevestigen aan een substraat.

Hier tonen we een nieuwe aanpak om de activiteit van Copepod larven nemen in watermonsters met behulp van een optisch gevangen gouden nanodeeltjes als een ultra-detektor. Optische pincetten worden doorgaans gebruikt door vele groepen als een fijne experimentele tool om krachten toe te passen of te meten tussen de moleculen tot aan de piconewton bereik ^12-14. Meer recent heeft de toepassingsmogelijkheden voor optische pincetten uitgebreid akoestische trillingen waarnemen en oplossennt schommelingen in vloeibare media door het toezicht op de beweging van nano-en micropartikels die zijn opgesloten in een optische val ^15. Deeltjes die worden ondergedompeld in een vloeistof worden onderworpen aan Brownse beweging. Binnen een optische val, maar deze beweging wordt gedeeltelijk gedempt door een sterke laser geïnduceerde gradiënt kracht. Derhalve kan de stijfheid van de optische val en de lokalisatie van het deeltje in de focus van de laserbundel worden afgestemd door het laservermogen. Tegelijkertijd is het mogelijk om kenmerken trapping potentieel gezien en interacties van moleculen met het deeltje analyseren monitoring van de tijd-afhankelijke deeltjes beweging in de val. Deze aanpak maakt het mogelijk op te halen de frequentie, de intensiteit en de richting van de vloeibare beweging die wordt gegenereerd door een bewegend object in vloeibare omgeving. We demonstreren hoe dit algemene idee kan worden toegepast op een frequentiespectrum van de beweging van een individuele Nauplius verkrijgen zonder de eisdirect bemoeien met het monster. Deze experimentele benadering introduceert een nieuw algemeen concept voor de waarneming van de beweeglijke gedrag van levende exemplaren in een zeer gevoelige manier. Voor opmerkingen over bio-indicator soorten, kan dit de huidige methodologie voor water analyse uit te breiden en kan worden toegepast op gegevens over de gezondheid en de integriteit van aquatische ecosystemen te krijgen.

Protocol

1. Experimentele opstelling

1. Gebruik een up-right microscoop en een donker veld olie condensor met een numerieke apertuur (NA) = 1.2 voor donkere veld verlichting. Gebruik een water immersie objectief met 100X vergroting en een NA = 1.0 voor deeltjesfysica observaties en trapping. Gebruik een lucht objectief met 10x vergroting en een NA = 0,2 tot de beweging van de Nauplius volgen.
2. Gebruik een optische pincet setup met een 1064 nm continue golf laser gekoppeld in de up-rechts microscoop. Stel het laservermogen van de optische val 100 mW (gemeten met een vermogensmeter na de doelstelling).
3. Gebruik een CMOS high-speed camera of een digitale spiegelreflexcamera (DSLR) camera om de afbeelding op te sporen en het goud deeltje beweging in de optische val en de beweging van de Nauplius.
4. Gebruik een notch filter om te voorkomen dat de laser in de camera.
5. Gebruik een power meter aan de laser macht na de doelstelling te meten.

2. Monstervoorbereiding

1. Pipet een druppel water (180 pl) op een microscoop glasplaatje en plaats het monster op de donkere veld microscoop.
2. Pipetteer een Nauplius van een kleine watertank naar het water druppel.
3. Gebruik een 10X lucht doel om de beweging van de Nauplius observeren in de oplossing en registratie van een videostroom.
4. Gebruik een gouden nanodeeltjes met een diameter van 60 nm als een detector de vloeiende beweging gegenereerd door de Nauplius observeren. Daarom voeg 5 ul van een sterk verdunde oplossing in het deeltje waterdruppel, zodat ongeveer een deeltje kan worden gezien in het gezichtsveld met een 100X water immersie objectief.

3. Particle Tracking Experiment

1. Trap een gouden nanodeeltjes met de optische pincet. Daarom brengen de 1064 nm trapping laser dicht bij een gouden nanodeeltjes die diffusie in oplossing door het verplaatsen van de microscoop podium. De aantrekkelijke optische krachten trek de gouden nanodeeltjes naar het brandpunt van the laserstraal. De gevangen deeltje is niet meer te diffunderen en nogal behoudt zijn positie. Neem een ​​video-stream van de gevangen nanodeeltjes met de DSLR camera op een frame rate van 50 Hz gedurende 30 sec.
2. Schakel de laser van het optische pincet en laat de gouden nanodeeltjes uit de val.
3. Gebruik een deeltje volgen programma de positie van het optisch gevangen gouden deeltjes aan elk frame van de videostroom uitlezing. Een snelle Fourier-transformatie (FFT) van xy-positie van het deeltje na verloop van tijd blijkt dat er een frequentiespectrum.
   LET OP: Hier werd een zelfgeschreven 'IGOR PRO' computerprogramma code gebruikt om het deeltje middenpositie in het xy-vlak in de tijd en voor FFT analyse analyseren.
4. Als alternatief voor een zelf geschreven IGOR code vrij toegankelijke 'Video Spot Tracker "voor het bijhouden van de deeltjes in de video. Gebruik de commerciële software 'Origin' om de Fourier transformatie van het bijhouden van gegevens uit te voeren:
   1. Sleep het videobestand naar het geopende programma 'Video Spot Tracker'.
   2. Muis klik op het deeltje te zien in de eerste foto van de video stream en een cirkelvormig gebied van belang verschijnt.
   3. Kies "symmetrisch" en "optimaliseren" in de command prompt venster om het volgen van het deeltje te optimaliseren.
   4. Muisklik "logging" in de command prompt venster en kies een map om de gegevens op te slaan. De tracking data wordt opgeslagen als een data-spreadsheet.
   5. Muisklik "play" op de linkerzijde command prompt venster van de tracking programma en wacht tot alle frames van de video worden geanalyseerd.
   6. Sluit het programma en open de opgeslagen gegevens spreadsheet met 'Origin'. Stel de kolomwaarden als "y _1" en "y _2".
   7. Stel de tijd stappen voor elke video frame als "x" in de 'Origin' data spreadsheet.
   8. Mark de x-Positie kolom en voer een FFT door te kiezen voor "Data Analysis" en "FFT" in de command prompt venster. Herhaal stappen voor de kolom y-positie.
   9. Zet de amplitudes van de berekende FFT signaal in x-en y-richting ten opzichte van de frequentie.

4. Numerical Simulation

1. Bereken de polariseerbaarheid α van 60 nm goud deeltjes met het computerprogramma "Mathematica".
   1. Met vergelijking (1) de polariseerbaarheid berekenen volgens Kuwata et al. ^16.:
      (1)
   2. Definieer de volgende drie parameters in de programmacode: de golflengte-afhankelijke complexe diëlektrische functie van goud deeltje, de nanodeeltjes radius en de brekingsindex van het omringende medium.
2. Met de beschrijving van de electric veldverdeling van een gefocusseerde Gaussische bundel volgens Agayan et al. ¹⁷ de optische krachten op een 60 nm goud deeltje berekend.:
   (2)
   1. . Gebruik vergelijkingen (3) - (6) vanaf Agayan et al. ¹⁷ zowel berekenen het verloop en verstrooiing krachten op het deeltje:
      (3)
      (4)
      (5)
      (6)
   2. In de programmacode, definieer de parameters voor het laservermogen, de numerieke apertuur van de oOEL en het complex polariseerbaarheid van de nanodeeltjes.
   3. Kortom het verloop kracht en de verstrooiing kracht om de totale optische kracht die op het goud deeltje in een optische val te berekenen.
3. De simulatie door tegelijkertijd op "Control" en "Enter".

Resultaten

Een schematische weergave van de experimentele opstelling wordt getoond in figuur 1A. Een donkerveld configuratie moet optisch detecteren van de verplaatsing van een 60 nm goud deeltje in een optische val ^15. De golflengte van 1064 nm voor het vangen laser wordt gekozen om een stabiele opsluiting van de detector gouddeeltje ^12,14 waarborgen. Een bundeldeler in de microscoop wordt gebruikt om de vangst bundel zich door het objektiefstelsel en een notch filter voorkomt de trapping la...

Discussie

Donkerveld microscopie is een krachtig hulpmiddel voor het visualiseren goud nanodeeltjes met afmetingen onder het optische diffractie limiet, omdat het gedeelte verstrooiingsdoorsnede van de metaal nanodeeltjes hun geometrische dwarsdoorsnede (vgl. figuur 2A) ¹⁸ overschrijdt. In een pincet opstart, deze benadering ook te onderscheiden indien slechts een enkele of meerdere gouden nanodeeltjes worden gevangen door de laserbundel omdat plasmon koppeling tussen de deeltjes veroorzaakt een roodve...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Microscope Zeiss Axio Scope.A1	Carl Zeiss	490035-0012-000	dark field illumination
Water objective Achroplan	Carl Zeiss	440087	100X vergroting, NA = 1.0
Air objective Epiplan	Carl Zeiss	442934	10X vergroting, NA = 0.2
Dark field oliecondensor	Carl Zeiss	445323	NA = 1.2
Cobolt Rumba CW 1,064 nm DPSSL	Cobolt	1064-05-01-2000-500	1,064 nm, CW, λ = 1,064 nm, 2 Watt, TEM00
Straalvergroter	Edmund Optics		Artikelnr. 1064 2-8X 64414
High Speed Camera Dimax HD	PCO. Germany
Color Camera Canon EOS 500 D	Canon		FAQ-ID: 8201395700
Notch filter StopLine 532/1064	Semrock	A11149-711265	Artikelnr. NF01-532U
Water
Nauplius Artemia salina
Goud colloid	BBInternational	Batch 13741	Diameter 60 nm
MQMie Version 3.2	Dr. Michael Quinten
Mathematica 8.0	Wolfram
Comsol Multiphysics 4.0	COMSOL, Inc.